Name: פרופילינג ליזוזומי באמצעות LysoTracker להערכה כמותית של הזדקנות תאית בפיברובלסטים אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-17T12:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: למדו פרופילינג ליזוזומי באמצעות LysoTracker Deep Red לבחינת הזדקנות תאית בפיברובלסטים אנושיים. שיטת הדמיה חיה זו מספקת מדידה כמותית של שינויים בליזוזומים כמסמן לעומס הזדקנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית רקמה 24-חלקים (תחתית שטוחה, מטופל ב-TC)</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229124</td><td>כל צלחת תרבית רב-חלקית עם תחתית שקופה התואמת לדימות פלואורסצנטי של תאים חיים (למשל, צלחות פוליסטירן מטופלות ב-TC של 6-, 12- או 24-חלקים; צלחות דימות עם תחתית זכוכית עשויות להיות מועדפות לדימות ברזולוציה גבוהה יותר).</td></tr><tr><td>ערכת צביעת בטא-גלקטוזידאז (מבחן הזדקנות)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9860</td><td>כל ערכת SA-&beta;-גלקטוזידאז מסחרית עם מאגר צביעה מאומת ב-pH 6.0. לצורך התייחסות, תמיסת הקיבוע מכילה 2% פורמלדהיד ו-0.2% גלוטראלדהיד ב-PBS, ותמיסת הצביעה מכילה 1 מ"ג/מ"ל X-gal ב-DMF, 40 מ"מ ציטרט/פוספט pH 6.0, 5 מ"מ אשלגן פרוציאניד, 5 מ"מ אשלגן פריאציאניד, 150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ MgCl2.</td></tr><tr><td>BioRender (תוכנת איור מדעי)</td><td>BioRender</td><td>N/A &mdash; אפליקציית אינטרנט</td><td>משמשת ליצירת דיאגרמות סכמטיות (איורים 1&ndash;3). https://www.biorender.com</td></tr><tr><td>גז דו-חמצן פחמן (CO2), גליל דחוס</td><td>Airgas (או ספק דומה)</td><td>N/A</td><td>CO2 מדרגה רפואית המשמש לשמירה על אטמוספירה של 5% במדחס תרבית תאים ובתא דימות בשלב.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברית (FBS), מחוטא בחום</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10082147</td><td>כל FBS מדרגת תרבית תאים, מחוטא בחום ב-56 &deg;C; משמש ב-10% v/v במדיום תרבית מלא.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם יכולת תאים חיים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF7000</td><td>כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה או קונפוקלי עם בקרת טמפרטורה ו-CO2 לתאים חיים, סט מסננים לערוצים אדום רחוק (עוררות ~647 ננומטר / פליטה ~670 ננומטר) ו-DAPI/Hoechst (עוררות ~405 ננומטר / פליטה ~460 ננומטר), ועדשה 20&times;-40&times; עם NA מספק לרזולוציה של מאפייני ליזוזומים. מערכת הדימות EVOS M7000 שימשה במחקר זה.</td></tr><tr><td>צביעת גרעין Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>צבע DNA חדיר לתאים לצביעת גרעין תאים חיים (פלואורסצנציה כחולה, עוררות ~405 ננומטר). לא ניתן להחליף עם DAPI, שאינו חדיר לתאים בתנאים פיזיולוגיים.</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונות</td><td>קרן התוכנה Python</td><td>N/A</td><td>כל סביבת מחשוב מדעית התומכת בפילוח גרעין, הרחבת אזור גרעין לתא, סף עוצמה וסטטיסטיקת תמונות בסיסית (למשל, Python עם scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). צינורת SenTrack (ראה קובץ משלים S1) פותחה למחקר זה.</td></tr><tr><td>פיברובלסטים ריאתיים אנושיים IMR-90 (קו תאים)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>קו תאים פיברובלסטיים דיפלואידים תקינים מעובר אנושי, המשמשים לדגמן הזדקנות רפליקטיבית; ניתן להחליף בכל קו פיברובלסטים אנושי מאפיין דומה.</td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>L12492</td><td>צבע פלואורסצנטי אסידוטרופי לצביעת תאים חיים של אברונים חומציים; מסופק כמלאי 1 מ"מ ב-DMSO. ריכוז עבודה הוא 75nM במדיום תרבית תאים מוכן.&nbsp; פליטה אדומה רחוקה (עוררות 647 ננומטר / פליטה 668 ננומטר) ממזערת את החפיפה עם פלואורסצנציה אוטומטית של ליפופוסצין אך אינה מבטלת אותה.</td></tr><tr><td>מדיום מינימלי חיוני (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11-095-080</td><td>מדיום תרבית בסיסי לפיברובלסטים IMR-90; משלים עם 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. ניתן להחליף בכל ניסוח סטנדרטי של מדיום מינימלי חיוני של איגל עם מלחי ארל ול-גלוטמין.</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (100&times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15140122</td><td>תוסף אנטיביוטי למדיום תרבית מלא; משמש ב-1% v/v (ריכוז סופי 100 U/mL פניצילין, 100 &mu;g/mL סטרפטומיצין). ניתן להחליף בכל תמיסת פן-ס

פרופילינג ליזוזומי באמצעות lysotracker להערכה כמותית של הזדקנות תאית בפיברובלסטים אנושיים

Lysosomal Profiling With LysoTracker For Quantitative Assessment of Cellular Senescence In Human Fibroblasts

פרופילינג ליזוזומי באמצעות LysoTracker להערכה כמותית של הזדקנות תאית בפיברובלסטים אנושיים

Cellular senescence is a stable cell-cycle arrest state associated with characteristic phenotypes, including enlarged cell morphology, altered secretory ...

lysosomal-profiling-with-lysotracker-for-quantitative-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת ציטומטריה של זרימה לכימות תאי סרטן מזדקנים הנגרמים על ידי טיפול עם סמני הזדקנות כפולים. הגילוי והכימות של תאים מזדקנים כרוכים בשימוש במצע β-גלקטוזידאז. המצע נבקע על ידי β-גלקטוזידאז ליזוזומלי פעיל בתוך התאים המזדקנים, ומייצר תוצר פלואורסצנטי אשר, בשילוב עם גרגרי ליפופוסצין אוטופלואורסצנטיים, מסמן את תאי הסרטן המזדקנים.

כימות מבוסס ציטומטריה של זרימה של תאי סרטן מזדקנים הנגרמים על ידי טיפול

אם מונעת הזדקנות או מקדמת tumorigenesis נותר שנוי במחלוקת. מאז תרופות chemotherapeutical יכולות לגרום לתאים סרטניים להזדקן, לומד הזדקנות הוא חיוני למציעים טיפולים חדשים. עם זאת, assay β-גלקטוזידאז הסטנדרטי ומשמש באופן נרחב מציג חסרונות עיקריים. אנו מציעים כאן assay מבוסס זרימת cytometry מהירה ורגיש לכמת הזדקנות.

שיטה רגישה לכמת תאי סרטן senescent

הזדקנות תאית, המדינה ההפיכה של מעצר מחזור התא, יכולה להיגרם על ידי מדגיש הסלולר שונה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לגרום הזדקנות תאית שיטות להערכת סמנים של הזדקנות.

טכניקות כדי להשרות ולכמת סלולר הזדקנות

כאן, אנו נדון סדרה של פרוטוקולים עבור אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית התאית בתאים בתרבית. אנחנו מתמקדים גירויים שונים בתדר הזדקנות ביולוגית. ומתארות כימות של סמנים משותפים הקשורים הזדקנות ביולוגית. אנו מספקים פרטים טכניים באמצעות fibroblasts כמודל, אך ניתן להתאים את הפרוטוקולים השונים דגמי הסלולר.

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

ROS תאיים הוכח לשחק תפקיד חשוב אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית הסלולר. כאן, אנו מתארים וזמינותו רגיש לכימות תנועת ROS רמות במהלך הזדקנות ביולוגית הסלולר. אנו מספקים גם פרוטוקולים להערכת את הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה פנוטיפ, אשר תורמת הדיווחים תפקוד שונות הקשורות לגיל.

מדידה כמותית של מינים חמצן תגובתי, הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה ב Fibroblasts אנושי נורמלי במהלך אונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית

הזדקנות תאית היא הגורם העיקרי בפיתוח של הפתווגיות הקשורות לגיל כרונית. זיהוי של הtherapeutics שתאי היעד מציגים הבטחה להרחבת הזדקנות בריאה. כאן, אנו מציגים את הבקשה הרומן על המסך לזיהוי של senotherapeutics מבוסס על מדידה של פעילות ביולוגית β-גלטוסידאז הקשורים בתאים בודדים.

א-β-גלטוסידאז-מבוסס על הקרנת ההקרנה לזיהוי תרופות הסאותרפיה

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה לתיוג מטבולי של תאים סניסנטיים ולא מתחלקים עם SILAC פועם, ניתוח ספקטרומטריית מסה לא ממוקדת וחישוב יעיל של זמן מחצית חיים של חלבונים.

מדידת שיעורי תחלופת חלבונים בתאי תרבית סנסנטיים ולא מתחלקים באמצעות תיוג מטבולי וספקטרומטריית מסה

כאן אנו מציגים שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה להדמיה וכימות של סמנים מרובים הקשורים לסנסנציה בתאים בודדים.

הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

פרוטוקול לכימות ציטומטרי פלואורסצנטי, זרימה של תאים סרטניים סנסנטיים המושרים על ידי תרופות כימותרפיות בתרבית תאים או במודלים של גידולי מורין. הליכים אופציונליים כוללים co-immunostaining, קיבוע דגימה כדי להקל על אצווה גדולה או ניתוח נקודת זמן, והעשרה של תאים senescent קיימא על ידי מיון ציטומטרי זרימה.

בדיקה פלואורסצנטית פלואורסצנטית β-גלקטוזידאז הקשורה לזיהוי והעשרה של תאי גידול סנסנטיים על ידי ציטומטריה של זרימה

אימונופלואורסצנציה מרובה מאפשרת תיוג רציף של מספר סמני נוגדנים בתוך חתך רקמה אחד כדי לתמוך בניתוח מרחבי של ארכיטקטורת הרקמה ואוכלוסיות התאים. כאן מוצגת זרימת עבודה לזיהוי מולטיפלקס של סמנים מבניים וחיסוניים הקשורים להזדקנות, הכוללת הכנת שקופיות ידנית ואוטומטית, הדמיה איטרטיבית וניתוח תאים בודדים באמצעות תוכנת פתולוגיה דיגיטלית.

מבחן אימונופלואורסצנציה מרובה לצורך הערכה מרחבית של סמני הזדקנות ב-vivo

פרוטוקול זה מציג מיקרוסקופיה קונפוקלית מוחזרת באור לזיהוי אובייקטיבי של פעילות בטא-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורה להזדקנות בחלק הווסקולרי סטרומלי שבודד מרקמת שומן אנושית. השיטה תואמת לאימונוציטוכימיה, משלבת בקרות pH להערכה כמותית, ומספקת גם חלופה רגישה ופחות סובייקטיבית לצביעת SA-β-gal המסורתית.

זיהוי הזדקנות באמצעות אור מוחזר בחלק הווסקולרי סטרומלי שומני

למדו פרופילינג ליזוזומי באמצעות LysoTracker Deep Red לבחינת הזדקנות תאית בפיברובלסטים אנושיים. שיטת הדמיה חיה זו מספקת מדידה כמותית של שינויים בליזוזומים כמסמן לעומס הזדקנות.

פרופילינג ליזוזומי באמצעות LysoTracker להערכה כמותית של הזדקנות תאית בפיברובלסטים אנושיים

גלה סרטונים נוספים