שיטה להתאמת Euglena gracilis למצעי קסבה לגידול הטרוטרופי

המחקר שלנו מתמקד בהתאמת עלי Euglena gracilis חדשים לפסולת קסאווה ובחקר צמיחה, הפחתת ציאניד וייצור ביומסה עשירה בחלבונים. פרוטוקול זה ניתן ליישם בעיבוד קסווה בר-קיימא, הערכת פסולת חקלאית, ייצור מזון ומערכות ביוטכנולוגיה זולות. כדי להתחיל, יש לסמן בקבוקונים סטריליים עם פתח אוורור בנפח 500 מיליליטר עם סוג המצע כ-garri.

סמן את ריכוז המטרה המתאים על הבקבוק. יש לסמן את הבקבוק עם זיהוי שכפול ותנאי עיקור מתוכנן כאוטוקלב או לא אוטוקלב. שים סירת שקילה על מאזן האנליטי.

לאחר לחיצה על טארה, שקול את הגארי כך שיתאים לנפח העבודה הסופי. מוסיפים את הגארי הכבד לתוך בקבוק סטרילי בנפח 500 מיליליטר המכיל 300 מיליליטר של מים מזוקקים או דה-יוננים. הניחו מחדש את הפקק המאוורר על כל בקבוק.

מערבבים כל תלייה במשך שלוש דקות עד שהתערובת מתאחדת. אם משתמשים בערבוב מגנטי, הניחו את הבקבוק על צלחת ערבוב ומכוון את המהירות ל-200G כדי ליצור מערבולת רדודה ללא התזות. תנו למתלה להידרדר ללא הפרעה במשך 10 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

הדק את מכסה האוורור מיד לפני התסיסה וסובב את הבקבוקון ביד חמש פעמים כדי להומוגן בעדינות את התערובת ולהחזיר את החומר השקוע. להכנת מדיום נוסף של מוצרי קסאווה, יש לסמן את הבקבוקים ולשקול את המצע כפי שהודגם בעבר, כדי להגיע ל-30 גרם לליטר בהתאם לנפח העבודה. מוסיפים באופן אספטי את המצע השקול לבקבוק סטרילי המכיל 300 מיליליטר של מים מזוקקים או דה-יוניים.

הניחו מחדש את הפקק המאוורר על כל בקבוק. שתו וערבבו את המתלים כפי שהודגמו קודם. ודאו שהבקבוקים מצוידים במכסה אוורור חדיר לגז כדי לאפשר החלפת גזים תוך מזעור זיהום סביבתי.

הניחו את הבקבוקים זקופים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס באזור ייעודי הרחק מאור שמש ישיר וזרימת אוויר בתנועה גבוהה ודוגמו את הבקבוקים ללא הפרעה למשך מינימום של 72 שעות. רשמו את תאריך ושעת תחילת התסיסה עבור כל בקבוק ומצב. ודאו שכל בקבוק בנפח 500 מיליליטר אינו מכיל יותר מ-300 מיליליטר נוזל לאחר התסיסה, כדי למנוע רתיחה במהלך עיקור.

לאחר שהפקק המאוורר משוחרר למצב צמוד לאצבע, יש להניח סרט אינדיקציה של האוטוקלאב על הבקבוק. לאחר טעינת הבקבוקים למגש בטוח לאוטוקלאב, הכניסו את המגש לאוטוקלאב ובחרו במחזור הנוזל P13. הגדר את פרמטרי הסטריליזציה ל-121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לצורך עיקור נוזלי.

התחל את מחזור האוטוקלאב. לאחר סיום המחזור, אפשר ללחץ תא האוטוקלאב לחזור ללחץ האטמוספרי ולפתוח את דלת האוטוקלאב לאט. באמצעות כפפות עמידות לחום, הסר את הבקבוקים ואפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר.

אחסן את הבקבוקים המקוררים למשך הלילה בטמפרטורת החדר לפני החיסון. השתמשו במדיום הקסווה המותסס ישירות ללא אוטוקלב כדי לשמר קהילות מיקרוביאליות מקומיות. חיסון את המדיה הלא-אוטוקלבית מיד לאחר תקופת התסיסה של 72 שעות כדי למזער זיהום סביבתי לא מכוון.

שמרו על טיפול עקבי בין הרפליקטים על ידי שימוש באותם בקבוקי פקק מאווררים בנפח 500 מיליליטר, אותו נפח עבודה ואותו משך תסיסה לכל תנאי המצע. החסן את Euglena gracilis לתוך מדיום תזונתי הטרוטרופי טרי. דגרו את התרביות בחושך מוחלט בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עם רעידות אורביטליות רציפות ב-120G עד שהתרביות מגיעות לגדילה לוגריתמית אמצעית.

באמצעות מיקרוסקופ אור מורכב במצב שדה בהיר, בדקו את התרביות בהגדלה כוללת פי 100 עד 400 ואשר תנועתיות פעילה, מורפולוגיית תאים מוארכת ורמות לחץ נמוכות. יש לשלול תרביות המציגות פסולת תאית מופרזת, מורפולוגיה לא תקינה או התעקשות מוגברת לפני ניסויי הסתגלות. לאחר הומוגניזציה עדינה של תרביות ההתחלה על ידי הידוק מכסה האוורור, סובבו את הבקבוקים ביד במשך 15 שניות כדי להבטיח חלוקה אחידה של התאים מבלי לגרום ללחץ כבד.

באמצעות המוסיטומומטר נויבאואר, קבעו את צפיפות התאים. לאחר ערבוב התרבית על ידי סיבוב הבקבוק במשך 15 שניות, הפיפטה של מיליליטר אחד של תרבית לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מיליליטר. נקה את ההמוציטומטר ואת משטח הכיסוי עם 70% אתנול ואפשר להמוסיטומטר ולכיסוי הכיסוי להתייבש באוויר.

פיפט 10 מיקרוליטר של תרבית על שני הרשתות בהמוקציטומטר ומניח את הכיסוי על הדגימה הרטובה. באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר עם מטרה של 10x, התמקדו ברשת וספרו את התאים בתוך קבוצת ריבועים מוגדרת על הרשת הגדולה על ידי יישום כללי הגבול הסטנדרטיים. חזור על ספירת התאים בתא השני וחשב את ממוצע התאים למיליליטר ואת צפיפות התאים.

כוונו את נפחי החיסון כדי להגיע לחיקון סופי של 5% נפח בנפח בכל מדיות הניסוי. הכינו חיסון נפרד לכל מצב טיפול כדי לשמור על צפיפויות תאים ראשוניות עקביות בין קבוצות ניסוי. הוסף את ה-E.gracilis inoculum המוכן לחומר קסאווה מאוטוקלב ולא מאוטוקלב שהוכנה בריכוזי גארי סופיים של 10, 20 ו-30 גרם לליטר.

השתמש בנפחי חיסון שווים בכל תנאי הטיפול כדי לתקן את צפיפות התאים ההתחלתית. לאחר הידוק המכסה המאוורר, סובב בעדינות את הבקבוקון בתנועה מעגלית במשך 15 שניות כדי לפזר את התאים. דגרו את התרביות בחושך מוחלט בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס כדי להתחיל בצמיחה הטרוטרופית.

מזעור ערבוב של המדיה הלא-אוטוקלבית כדי לשמר את מבנה הקהילה המיקרוביאלית המקומית ואת שכבת המצע. ערבבו את כל התרביות פעם ביום באמצעות סיבוב ידני עדין למשך 15 שניות כדי לשמור על מגע בין תאי E.gracilis לחומר הקסאווה התלוי. באמצעות קצה פיפטה סטרילי, כל 48 שעות, אספו דגימות מיליליטר אחד מכל תרבית באופן אספי.

הדק את הפקק המאוורר וסובב בעדינות את בקבוק התרבית במשך 15 שניות לפני הדגימה כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים והחומר התלוי. לאחר העברת אליקו של תרבית לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מיליליטר, דילל את הדגימה במים דה-יוניים לפי הצורך כדי לשפר את הוויזואליזציה של התאים הבודדים. הכינו סלייד מיקרוסקופ רטוב על ידי פיפפטינג של 10 מיקרוליטר מהדגימה המדוללת על סלייד מיקרוסקופ נקי וכיסוי הדגימה בכיסוי.

באמצעות מיקרוסקופ אור מורכב במצב שדה בהיר, בדקו את הדגימות בהגדלה כוללת פי 100 עד 400 והערכו את תנועתיות התא, המורפולוגיה ותדירות ההתעקשות כאינדיקטורים למצב ההסתגלות. כל שבעה ימים, העבר באופן אספטי 20% נפח לפי נפח מכל תרבית למדיום קסאווה טרי עם אותם ריכוז גארי ותנאי עיקור. שמרו על נפחי העברה עקביים בין המעברים וחזרו על מעבר סדרתי עד שהתרביות מציגות גדילה עקבית, תנועתיות מתמשכת ותדירות התעקשות נמוכה במדיום קסווה של 30 גרם לליטר.

לאחר התאמת קסאבה בריכוז גבוה וניתוח השוואתי של צמיחה, השתמשו ברצועות צבע כדי להעריך את רמות הציאניד ולצפות בצבע שהתפתח. לאחר הצנטריפוגה, קצור ביומסה לניתוח במורד הזרם. בתנאי גידול חשוכים לחלוטין, תרביות שגודלו ב-30 גרם לליטר של גארי הציגו צמיחה משולבת גבוהה יותר מאשר ריכוזים נמוכים יותר.

ריכוזי גארי נמוכים של 10 עד 20 גרם לליטר הראו גידול ניתן לזיהוי אך מופחת ומשתנה יותר. ריכוזים גבוהים יותר של 40 עד 50 גרם לליטר הגיעו לצפיפות שיא גבוהה של התאים, אך הראו ייצוב מאוחר יותר ושונות רבה יותר. בדיקות החרגה של טרייפן כחול הראו כי תרביות שנשמרו על 30 גרם לליטר גארי שמרו על קיימות גבוהה לאורך נקודות זמן שנדגמו.

ריכוזי גארי גבוהים יותר הראו ירידות חולפות ביכולת הקיימות ואחריהן התאוששות חלקית עם שונות מוגברת לאורך זמן. תוצאות חיוביות כללו תאים מעוגלים או חצי-מתעקשים עם תנועתיות מופחתת שנשארו שלמים לאורך תת-גידול חוזר. תרביות E.gracilis מותאמות הציגו צמיחה שניתנת לשחזור בין סוגי מצע שונים והראו ייצוב מוקדם יותר עם ירידה מופחתת בשלבים מאוחרים יחסית לתרביות מסוג בר.

יישום מוצלח של הפרוטוקול הניב ביומסה של E.gracilis עם תכולת חלבון גולמית מדידה, כפי שנקבע בניתוח מעבדה חיצוני בשיטת דומאס בעירה. אחוזי החלבון שנצפו בתרביות מותאמות היו דומים לאלו שנמדדו בתרביות מסוג בר עם תפוקת חלבון כוללת גבוהה יותר התואמת לעלייה בהצטברות ביומסה. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור את צמיחת אוגלנה, הפחתת ציאניד, ייצור ביומסה ופוטנציאל תזונתי בסביבות מבוססות קסבה שונות.

האתגר הקריטי בפרוטוקול זה הוא שמירה על טמפרטורה יציבה, תנאי תרבית עקביים וקהילה מיקרוביאלית מאוזנת לצמיחת אוגלנה. מחקרים עתידיים יכולים לאופטם ולהרחיב את הפרוטוקול הזה, לשפר את תפוקת החלבון, ולבחון יישומים תעשייתיים שונים באמצעות זרמי פסולת קסאווה מגוונים בקנה מידה רחב.