ביטוי ממוקד של ה-GFP ב זקיק השיער באמצעות אקס התמרה Vivo ויראלי
17 במרץ 2008
זקיק שיער הוא האיבר המורכב ביותר של העור המכילה ריבוי של סוגי תאים. הזקיק עובר אופניים קבוע דרך החיים של האורגניזם, כולל צמיחה resorption עם צמיחה תלויה בתאי גזע מסוים. המיקוד של זקיק ידי גנים בתאי גזע כדי לשנות את המאפיינים שלה, ובמיוחד את האופי של השערה הוא דן. זקיק שיער מערכות אספקת מתוארים, כגון ליפוזומים ו וקטורים ויראליים עבור ריפוי גנטי. האופי של זקיק השיער תאים גזע נדון, בפרט, pluripotency שלה.
זקיק השערה הוא נספח עור מורכב המורכב משישה גלילים קונצנטריים עם מספר סוגי תאים נבדלים המייצרים חלבונים ייעודיים ביותר. המחזוריות המתמשכת של זקיק השערה דרך שלבי הגדילה המובחנים שלו הופכת את הנספח למתאים לטיפול גנטי ממוקד, אשר עשוי לתקן התקרחות ואובדן פיגמנטציה של השיער. בסרטון זה, אנו מדגימים שיטה לתרבית היסטולוגית של שיער, גידול עור, והעברה של חלבון פלואורסצנטי ירוק לתוך זקיקי שערה ex vivo.
טכניקת הטרנסדוקציה היעילה הזו שימושית למעקב אחר פעילות הפרומוטור של גנים שונים שמעניינים את החוקר באזורים שונים של הזקיק לאורך מחזור הצמיחה שלו. שמי רוברט הופמן. אני נשיא חברת Anti-Cancer Inc.
היום נדגים בפניכם פרוצדורות עוצמתיות מאוד לטיפול גנטי בזקיקי שיער. פרוטוקול זה מתחיל בתרבית היסטו (histo culture) של עור, ולאחריה טיפול בקולגנאז. ראשית, מקריבים את העכברים שישה ימים לאחר הדילול, ועור הגב מוסר ברמת תת-העור (subcu).
לאחר הסרת העור, מוסר הרקמה התת-עורית. לאחר מכן, שוטפים את העור ב-PBS נטול סידן ומגנזיום. בשלב זה, מועבר העור שנשחט למצע לאחר השטיפה ב-PBS.
דגימות עור נחתכות לחתיכות קטנות של כ-one millimeter cubed. חלק מהדגימות מופרשות ומגודלות ב-RPMI 1640 וב-10% fetal bovine serum כביקורות לא מטופלות. שאר הדגימות מדוגרות ב-two mg per mil.
תמיסת קולגנאז (Collagenase). לאחר עיכול הדגימות במצע RPMI למשך 45 דקות עד 3.75 שעות בטמפרטורה של 37°C, שוטפים אותן ב-PBS נטול סידן ומגנזיום. ניתן להדביק תרביות היסטולוגיות בנגיף לצורך טרנסדוקציית GFP. כעת, לאחר שהקולגנאז הפך את זקיקי השיער לנגישים יותר לנגיף, ניתן להשרות את זקיקי השיער.
כדי לבטא GFP, הם נדבקים תחילה בנגיף אדנווירוס. לאחר מכן, פלסמיד הנושא GFP מתווסף לעור שעובד עם קולגנאז. תרביות היסטו בריכוז של 2.4 מיליון עד 5 מיליארד יחידות פלטפורמה למילי.
לאחר הוספת הווירוס, התרביות מועברות לאינקובטור למשך שעה אחת עד שש שעות לאחר טרנסדוקציה ויראלית של GFP בתרביות רקמת עור (histo cultures), ובערך 24 שעות לאחר הקציר, ניתן להשתיל את הדגימות בעכברים מסוג nude או C 57 black six. לאחר מכן, ניתן להעריך את ביטוי ה-GFP באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המבוצעת על תרביות הרקמה או על ידי הדמיה in vivo של העור המשתול. כדי לקבוע את יעילות הטרנסדוקציה של GFP, נקבע מספרם הכולל של זקיקי השיער ומספרם של זקיקי השיער החיוביים ל-GFP תחת מיקרוסקופיה בשדה בהיר ובפלואורסצנציה.
מנותחים חמישה שדות מיקרוסקופ שנבחרו באופן אקראי המכסים שטח של 0.581 millimeters squared. עבור ביטוי GFP, נספרים לפחות 500 שערות לכל דגימה כדי לחשב את אחוז זקיקי השערה החיוביים ל-GFP. זקיקי שערה שבהם GFP מזוהה בכל חלק בבצל השערה או בגזע השערה נספרים כחיוביים ל-GFP.
הצגנו בפניכם שיטה יעילה ביותר להחדרה של GFP לזקיקי שיער, שתהיה שימושית ביותר עבור טיפול גנטי. ידע זה הוא בעל חשיבות קלינית כיוון שיש לו השלכות על ריפוי אלפציה (הקרחה), מניעת אלפציה הנגרמת מחסמי כימותרפיה, ושינוי קבוע של צבע השיער. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
זקיק השערה הוא נספח עור מורכב העובר מחזורי התחדשות רציפים, מה שהופך אותו למטרה עבור תרפיה גנטית. מאמר זה דן בשיטות לתרבית רקמה (histoculture) והעברה גנטית (gene transduction) בזקיקי שערה, שעשויות להיות בעלות השלכות על טיפול בהסרת שיער.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- תרפיה גנית
- דרמטולוגיה
רקע
- זקירי שיער מורכבים מסוגים שונים של תאים ומבנים.
- הם עוברים מחזורי שלבי צמיחה המושפעים מתאי גזע.
- תרפיה גנטית עשויה לתת מענה למצבים כגון קירחות.
- הבנת הביולוגיה של זקירי השיער היא קריטית עבור טיפולים יעילים.
מטרת המחקר
- להדגמת שיטה לתרבית רקמה (histoculture) של זקיקי שיער.
- לבחינת טכניקות של טרנסדוקציה גנטית עבור זקיקי שיער.
- להערכת יעילות הביטוי של GFP בזקיקי שיער.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תרביות רקמה (Histo culture) של דגימות עור ולאחריהן טיפול בקולגנאז.
- הדבקת זקיקי שיער עם אדנווירוס הנושא פלסמיד GFP.
- הערכת ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- ניתוח יעילות התעתוק על ידי ספירת זקיקי שיער חיוביים ל-GFP.
תוצאות עיקריות
- הושגה טרנסדוקציה יעילה של זקיקי שיער עם GFP.
- ניתן להדגים את ביטוי ה-GFP in vivo ובתרביות היסטולוגיות.
- השיטה מראה פוטנציאל ליישומים בתרפיה גנטית.
- נדונו השלכות לטיפול באלפציה ולשינוי צבע השיער.
מסקנות
- המחקר מציג שיטה רבת עוצמה לטיפול גנטי בזקיקי שיער.
- הבנת התעתוק הגני עשויה להוביל להתקדמות בטיפול בנשירת שיער.
- מחקר עתידי עשוי להתמקד ביישומים קליניים של טכניקות אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
טרנסדוקציה ויראלית ממוקדת ex vivo של זקיקי שיער מאפשרת הובלה מדויקת של גנים לאוכלוסיות תאים זקיקיות מובחנות, ובכך תומכת בבדיקה פונקציונלית של ביטוי גנים ברקמה רגנרטיבית מורכבת. גישה זו מגבירה את רמת הוודאות החיזוית באסטרטגיות של טיפול גנטי עבור מסלולי פיתוח ברפואה דרמטולוגית ורגנרטיבית, במיוחד במקרים שבהם ספציפיות לסוג התא ויעילות טרנסדוקציה כמותית הן קריטיות. התפוקות הכמותיות והשחזוריות של השיטה ממצבות אותה ככלי בעל ערך לתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ולמחקר תרגומי במו"פ של הביו-פרמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של יעדי גנים באוכלוסיות מוגדרות של תאי זקיק שיער.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי מתן אפשרות למעקב מרחבי וזמני אחר ביטוי גנים באמצעות GFP.
- מקל על הערכה כמותית של פעילות פרומוטור ויעילות העברת גנים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק מערכת ex vivo הניתנת לשחזור להערכת וקטורים ומבנים להעברת גנים.
- מייצר מדדים סטנדרטיים וכמותיים של יעילות טרנסדוקציה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תומך בפיתוח בדיקות לסריקת מועמדים לטיפול גני המכוונים לביולוגיה של העור וזקיקי השיער.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מערכות רלוונטיות למחלות לצורך מידול של הפרעות בזקיקי השיער וטיפולים רגנרטיביים.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות להשתלה in vivo ומעקב ארוך טווח אחר ביטוי גנים.
- תומך בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים עבור תוכניות לטיפול גנטי המכוונות לנספחי העור.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי ניתוח
שיטה זו להעברה ויראלית ex vivo משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת על הפער שבין תיקוף in vitro להערכה תפקודית in vivo עבור מועמדים לטיפול גנטי המכוונים לביולוגיה של זקיקי השערה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי אפשור ניתוח ממוקד של ביטוי גנים בתתי-אוכלוסיות של זקיקי שיער.
- סריקה: מספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור על יעילות התעתוק לצורך קבלת החלטות על בחירת וקטורים וסמיכות (constructs).
- אנליטיקה: מספקת מדידות פלואורסצנטיות חסונות להשוואת תנאי הובלת גנים ותוצאותיהם.
- מחקר תרגומי: מקלה על רציפות פרה-קלינית באמצעות השתלה וניטור in vivo של זקיקים שעברו מודיפיקציה גנטית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת להרחבה ולהתאמה להערכת מודאליות מגוונות של תרפיה גנטית במודלים של עור וזקיקי שיער.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות לטיפול גנטי ומפחית עמימות מכניסטית ברקמות מורכבות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה להעברת גנים ולכימות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ולמיון תיקי פיתוח על ידי אספקת נתוני טרנסדוקציה כמותיים וספציפיים לסוג התא.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעודוף מותאם סיכון של נכסי טיפול גנטי המכוונים לאינדיקציות דרמטולוגיות ורגנרטיביות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות רקמה ex vivo, טיפול בוקטורים ויראליים ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה.
- נדרשת גישה לתשתיות אנליטיות להדמיה כמותית וניתוח נתונים.
- נדרש תיקנון בין-צוותי של עיבוד הרקמות וקריטריוני הדירוג לצורך השחזוריות.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור מינים שונים, סוגי זקיקי שיער או וקטורים להעברת גנים.
- היעילות והספציפיות עשויות להשתנות בהתאם לסוג הוקטור, בחירת הפרומוטור ומצב הרקמה.
