הערכת השפעת מסננים מצופים ומסננים מקדימים על ההדבקה והריכוז של וירוס Phi6 שהתרומם

אנו חוקרים את השפעת מסננים מוקדמים וציפויים אנטי-ויראליים בהפחתת זיהום וריכוזי וירוסים באוויר בסביבות פנימיות. גישות זרם מפספסות דינמיקת זרימת אוויר ריאליסטית. הפרוטוקול שלנו משחזר את תנאי האירוסול ומודד הן את הווירוסים המדבקים והן את העומס הנגיפי הכולל.

בתחילה, דיללו את תסמיני הבקטריופאג' המטוהר בבופר פספט אשלגן 20 מילימולר המכיל כלוריד מגנזיום מילימולר אחד, מותאם ל-pH 7.2. הרכיבו את כל חומרי המסנן, המסנן המקדים וחומרי הציפוי האנטי-ויראלי בתוך ארון הבטיחות הביולוגית כדי לבצע את בדיקות המשטח. העריך את הפעילות האנטי-ויראלית של כל חומרי הציפוי המבוססים על נחושת, או רכיבים פעילים מנחושת וכסף המוטמעים במטריצות קנייניות, כלומר A6, B4, VS ו-VS B, על חלקי בדיקה שטוחים.

לאחר מכן, פיפטה של 20 מיקרוליטר של תמיסת בקטריופאג' מדוללת על חלקי בדיקה מצופים כדי לבצע את בדיקת הכדאיות על פני השטח. פזר את הדגימה באופן שווה על שטח של שני על שני סנטימטרים באמצעות משולש זכוכית סטרילי. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס עד ארבע נקודות זמן, כולל דקה, חמש דקות, שעה או שלוש שעות.

הוסיפו 180 מיקרוליטר של מרק LB טרי לפני השטח כדי לשחזר את הווירוסים לאחר כל נקודת זמן. שטוף את המשטח על ידי פיפטינג חוזר של 10 עד 20 פעמים כדי לאסוף את הדגימה. השתמש בצלחת פטרי מפלסטיק כמשטח בקרה.

כימות יעילות אנטי-ויראלית של ציפויי פני השטח באמצעות בדיקת פלאק למדידת מספר חלקיקי הווירוס המדבקים ותגובת שרשרת כמותית הפוכה של פולימראז, או qRT-PCR, לקביעת מספרי עותקי הגנום הוויראלי. מדלל את תמציית החיידק phi6 המרוכזת והמטוהרת כפי שהודגם קודם כדי להשיג ריכוז וירוס בטווח של 2.5 כפול 10 עד 10, ועד 4.08 כפול 10 לכוח של 11 יחידות יצירת פלאק למיליליטר. לאחר מכן, הרכבת תא האירוסול הניסיוני באמצעות גוף זכוכית גלילי עם מכסה תואם.

הכנס את הפיגום המתכתי הפנימי לתוך התא ואבטח אטמים מבודדים כדי להבטיח אטימה אטומה לאוויר. השתמש בנבולייזר בשילוב עם משאבת אוויר כדי לייצר קלט יציב וניתן לשחזור של אירוסולים ויראליים. יש לכוון את תמיסת הווירוס ששימש בנבולייזר לפני ואחרי כל ניסוי כדי לעקוב אחר יציבות.

כוון את קצב זרימת האירוסול לשמונה ליטר לדקה בתוך החדר. כדי להפחית לחות במהלך מדידות ממושכות, יש לכוון כשלושה רבעים מזרימת האירוסול לפליטה דרך פילטר חלקיקי אוויר (HEPA) יעיל מאוד. אפשר לרבע הנותר של הזרימה, המקביל לשני ליטרים לדקה, להיכנס לתא.

השתמש במשפך כדי לכוון את זרימת האירוסול לעבר המסנן או פני המקדים בתוך התיבה. להטיל לחות על זרימת האוויר היוצאת באמצעות מייבש כדי להגן על מסנן ה-HEPA ומד הזרימה מפני לחות עודפת. באמצעות המשאבה החיצונית, יוצרים לחץ שלילי בתוך המערכת, ותמיכה נוספת בזרימת אוויר כדי להבטיח פליטה יעילה דרך פתח היציאה.

העריך את התכונות האנטי-ויראליות של פוליאסטר ובולפרן לא מצופים או מצופים ב-VS לצד חומרי סיבי זכוכית דו-שכבתיים בתוך תא האירוסול. כדי להעריך את ההשפעה האנטי-ויראלית באמצעות דגימת השפעה, יש למקם צלחת פטרי המכילה בופר HEPES בקוטר 20 מילימולר ב-pH 7.2 ישירות מתחת למסנן הבדיקה כדי למקסם את הצטברות החלקיקים. לחלופין, כדי לבדוק את ההשפעה האנטי-ויראלית של מסנני GF2, התקן אימפינגר סחרור בעל שלושה פיות וזכוכית מלאה שמחובר למשאבה חיצונית לאיסוף אירוסולים.

שמור על זרימת אוויר דרך המסנן או המסנן המקדים של הבדיקה בקצב של שני ליטר לדקה. הגדילו את סך זרימת האוויר ל-10 ליטר לדקה באמצעות שסתום נוסף אחרי יציאת המחליף. ללכוד את האירוסולים בחמישה מיליליטר של בופר HEPES בקוטר 20 מילימולר.

ולמלא מחדש את הבופר המאודה כל 30 דקות. לדגימה משולשת, בצע ריצות בקרה ללא מסננים או מסננים מוקדמים במשך 15 דקות לפני ואחרי כל ניסוי. לאחר ריצת הבקרה לפני הניסוי, הכנס את המסנן או המסנן המקדים לתא והפעלו את המערכת במשך שלוש שעות.

איסוף אירוסולים ויראליים על ידי איסוף מיליליטר אחד של תלייה מצלחות פטרי המכילות 20 מיליליטר של בופר כל 30 דקות. הסר את המסנן ובצע ריצת בקרה לאחר הניסוי. איסוף דגימות כל 30 דקות במהלך הניסוי כדי לקבל שמונה דגימות qRT-PCR וטיטרציה בכל ניסוי.

בניסויי אימפינגר, איסוף דגימות טיטרציה רק פעם אחת בסיום הריצה של שלוש שעות. השתמשו ב-800 מיקרוליטר מהדגימה שנאספה לניתוח qRT-PCR וב-200 המיקרוליטרים הנותרים לטיטרציה של הווירוס. הקפיאו במהירות דגימות qRT-PCR בחנקן נוזלי ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס.

עבד דגימות טיטרציה של וירוס מיד באמצעות בדיקת פלאק. בדיקות הקיימות על פני השטח הראו שכל הציפויים שנבדקו השביתו את הווירוס בהצלחה, עם ירידה משמעותית שנצפו בתוך חמש הדקות הראשונות. הציפוי המבוסס נחושת, B4, השיג את ההפחתה המהירה ביותר, כאשר הפחית את מספר ההדבקות בשלושה סדרי גודל בתוך חמש דקות, והגיע לביטול מוחלט עם מגבלת גילוי מתחת ל-100 יחידות יצירת פלאק למיליליטר ב-15 דקות.

ציפוי A6 השיג השבתה מוחלטת של הווירוס תוך 25 דקות, ו-VS B תוך 60 דקות. ציפוי VS הציג את שיעור ההשבתה האיטי ביותר מבין החומרים שנבדקו. המסננים המוקדמים BP6, S11 ו-FMR5 היו יעילים באותה מידה בהפחתת מספר הווירוסים המדבקים, ועברו דרכם ב-1.5 עד 2 סדרי גודל לעומת בקרת ללא מסנן.

מסנני GF2 הראו ביצועים טובים יותר, שהורידו את העומס הנגיפי לפחות בשישה סדרי גודל, ולא זוהו פלאקים זיהומים של וירוס phi6 במסגרת מגבלת הגילוי. ציפוי VS B לא השפיע באופן משמעותי על יעילות סינון וירוסים זיהומיים בהשוואה לפילטרים מוקדמים ללא ציפוי. תוצאות qRT-PCR הראו כי מסננים מורידים את מספר עותקי הגנום הוויראלי עד שני סדרי גודל.

מסנן GF2 הראה ירידה של עד ארבעה סדרי גודל בהשוואה לבקרה ללא פילטר. בעוד שההבדלים בין מסנני קדם לבקרה נותרו זניחים במהלך 30 הדקות הראשונות, יעילות הסינון המכנית עלתה מנקודת הזמן של 60 דקות. בנוסף, יישום ציפוי VS B לא השפיע באופן מדיד על מספר הגנומים הוויראליים העוברים דרך מדיום הסינון.

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לכמת את השבתה של הוויראלים, יעילות הסינון וההבדלים בין חלקיקים זיהומיים לעומס הנגיף הכולל. אתגר מרכזי הוא זמן מגע קצר מאוד עם פני הווירוס במהלך זרימת האוויר, מה שמגביל את יעילות הציפויים האנטי-ויראליים. מחקרים עתידיים יכולים לחקור שילוב ציפויים עם UV או בדיקת ביצועים במערכות אוורור אמיתיות ועם וירוסים מגוונים.