תיוג פלואורסצנטי אנדוגני בתיווך CRISPR/Cas9 של גנים ספציפיים לקו הנבט ב-Caenorhabditis elegans
29 במאי 2026
תהליך הזרקה מיקרו-CRISPR/Cas9 לתיוג פלואורסצנטי אנדוגני בקו הנבט Caenorhabditis elegans לקבלת קווי הדחיפה הומוזיגוטיים לניתוח מיקום חלבונים בחיים.
אנו משתמשים בתיוג אנדוגני מבוסס CRISPR כדי לחקור את המיקום והדינמיקה של חלבוני הגרמיין ב-C.elegans. טרנסגנים קונבנציונליים עשויים להשפיע על ביטוי קו הנבט, אך פרוטוקול זה מתייג חלבונים בלוקוס האנדוגני תחת שליטה טבעית. כדי להתחיל, יש לזהות את הגנים המועמדים עם ביטוי דומיננטי בגונד או בתאי הנבט באמצעות מאגרי מידע ציבוריים וספרות שפורסמה.
לאחר פתיחת ערך UniProt לחלבון היעד, לחץ על מבנה כדי להעריך תכונות מבניות ותחומי חלבון ולזהות אתר תיוג פלואורסצנטי מתאים. גלול למטה ופתח את ערך מסד הנתונים של AlphaFold כדי לאמת את ערכי האמון של המודל. לחצו על Domains לסיווגים מבניים ספציפיים.
לאחר מכן, פתח את דף הגן היעד ב-WormBase. גלול למטה ולחץ על ווידג'ט Sequences ועל קישור התמלול הראשי כדי לפתוח את דף התמלול. גללו למטה לסעיף הרצפים ולחצו על האפשרות הספציפית כדי לחשוף את הרצף המחובר של התמליל הנבחר.
בדף המדריך של IDT CRISPA-Cas9 לכלי עיצוב RNA, העתק והדבק את רצף האקסון הראשון של הגן המטרה מדף WormBase, ובחר את C, elegans מתפריט הנפתח Species לתכנון RNA או gRNA מדריך. לחצו על כפתור DESIGN כדי לקבל ולסקור את רצף ה-gRNA המומלץ ביותר ואת רצף ה-PAM המתאים לו. ב-SnapGene, בחר ב-Sequence כדי לזהות את נקודת השיבוט בין פרומוטר CeU6 לאזורי הפיגום של ה-gRNA.
העתק את רצף ה-gRNA מדף הכלי IDT, הדבק אותו בתיבת הדיאלוג של ההכנסה, ולחץ על Insert כדי לשלב את המרווח בפלסמיד הביטוי של CRISPR. כדי לאשר את דיוק הכנסת ה-gRNA, בחרו את הרצף ולחצו על Show יישורים כדי להשוות את תוצאת רצף סנגר בסיס אחר בסיס לרצף הצפוי. כדי לבנות את פלסמיד התורם, העתק את רצפי הגנום של זרוע ההומולוגיה מ-WormBase.
ב-SnapGene, הדבק את הרצף ולחץ על 'הכנסה'. לאחר מכן, לחץ קליק ימני על אתר ההחדרה כדי לפתוח את חלון Set DNA Color ולשנות אותו לכתום כדי לסמן את הצומת. העתק את רצף החלבון הפלואורסצנטי הירוק או ההכנסת GFP והדבק אותו ישירות במיקום המסומן.
ואז לחץ על 'הוסף תכונה'. תן שם לתכונה GFP. שנה את צבע התצוגה לירוק ולחץ על אישור להשלמת הרכבת הפלסמיד של תורם ב-סילקו.
כדי להכניס החלפה שקטה לתבנית הפלסמיד התורם למניעת חיתוך חוזר של Cas9 לאחר האינטגרציה, העתק את מרווח ה-gRNA של 19 נוקלאוטידים מווקטור הביטוי. בלשונית הפלסמיד של התורם, הדבק את הרצף בשורת החיפוש של חיפוש רצף DNA כדי לאתר את אתר היעד ולבחור את מיקום הנוקלאוטידים הספציפי למוטציה. בהחלפת בסיס, הזן נוקלאוטיד חדש ולחץ על הכנסה.
לחץ קליק ימני על הבסיס המותאם והשתמש ב-Set DNA Color כדי לשנות את צבעו לאדום. יישר את תוצאות ריצוף הפלסמיד סנגר של התורם עם הרצף הצפוי כדי לאשר את השלמות. הכינו את תערובת ההזרקה על ידי שילוב פלסמיד ביטוי CRISPR, פלסמיד התורם, וסמני הזרקה משותפת במים מזוקקים כפולים סטריליים לנפח סופי של 10 מיקרוליטרים בריכוז המוצג.
לאחר מכן צנטריפוגה את התערובת ב-10,000 גרם למשך 10 עד 20 דקות כדי להוציא חלקיקים ולמנוע סתימה של הנימי המיקרו-הזריקה. השתמש במושך מחטים ליצירת מחטי מיקרו-הזרקה מנימי זכוכית עם צמצום ארוך וקצה חד המתאימים להזרקת גונדה, תוך אופטימיזציה אמפירית של ההגדרות הפולריות. חממו פיפטה מיקרוקפילרית וחברו אותה לשני חלקים כדי ליצור כלי טעינה.
חבר נורה משפרית גומי לקצה הרחב של הפיפטה המיקרוקפילרית המקוצרת. שואף בערך מיקרוליטר אחד של תערובת הזרקה לתוך המעמיס. הכנס את המעמיס לקצה האחורי של מחט ההזרקה ומשחרר בעדינות את תערובת ההזרקה.
הנח את המחט הטעונה אופקית למשך 10 דקות כדי ליצור עמוד רציף ולאפשר לתמיסה לשקוע לכיוון הקצה. התקן את המחט על מיקרוסקופ ההזרקה והביא את הקצה לפוקוס באמצעות אופטיקה בשדה בהיר. פתח את קצה המחט במגע עדין עם קצה הכיסוי בשמן הלוקרבון ווודא את הזרימה.
כדי לגדל את התולעים להזרקה, שמרו את תולעי ה-N2 פראיות על פלטות מדיה עם זרעי חיידקים OP50. בחרו הרמפרודיטים בשלב L4 מצלחת בריאה ודגרו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 10 שעות כדי לקבל צעירים עם קווי נבט מפותחים היטב. העבר את התולעים לצלחת לא מזורזת כדי להפחית את העברת החיידקים.
הכינו פד יבש עם 2% אגרוז על מגלשת זכוכית. ותמרח טיפה של שמן הלוקרבון. השתמשו בחוטף ריסים כדי להעביר תולעת אל כרית האגרוז ולתקוע אותה.
השתמשו באובייקטיב בהגדלה נמוכה כדי לכוון את הגונדה להזרקה. השתמש בבקרות מיקרומניפולטור כדי למקם את המחט בזווית של 20 עד 40 מעלות יחסית לתולעת. השתמש בהגדלה גבוהה כדי להתמקד בקו הנבט הדיסטלי.
התקדמו את התולעת אל המחט ומקמו את הקצה בתוך הסינקסיציה הגונדלית. הזריק את התמיסה עד שהגונאדה מתנפחת. הוציא את המחט ומקם מחדש להזרקות הבאות.
הוסיפו בופר M9 כדי לרכך ולשבור חלקית את כרית האגרוז לשחרור התולעים. העבר כל תולעת ללוח התאוששות אישי. אחר כך חזרו על ההזרקות ל-20 עד 25 תולעים.
סקר את צאצאי F1 לסימני הזרקה משותפים ובחירת בעלי חיים חיוביים לסמן. העבר כל תולעת F1 לצלחת נפרדת ומאפשר יום עד יומיים להטלת ביצים. לעבור לכל תולעת F1 בבופר K פרוטאינאז להכנת תבניות PCR.
בצע PCR חיבור באמצעות פריימר גנומי אחד מחוץ לזרוע ההומולוגיה ופריימר תג פנימי אחד. ושומרים על לוחות תואמים מבעלי חיים חיוביים ל-PCR F1. לבודד צאצאי F2 מקווים חיוביים ל-PCR על פלטות בודדות כדי לייצר צאצאים.
Lyse למבוגרים לגנוטיפינג. לבצע PCR באמצעות פריימרים משני צידי זרועות ההומולוגיה כדי להבחין בין אללים מסוג פראי ואללים מסוג נוק-אינ לפי גודל המוצר. השתמשו בכלי SnapGene כדי לאמת ולאמת אינטגרציה נכונה הן במחברי ההחדרה השמאלי והימני על ידי יישור תוצאות ריצוף סנגר עם רצף הגנומי הערוך הצפוי.
השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנצי לאימות ביטוי ומיקום קו הנבט. הרחבת קווים הומוזיגוטיים מאושרים. שמור מלאי וקווי קריושימור מאומתים לאחסון ארוך טווח.
סקר מבוסס PCR של צאצאי F1 חשף פגיעות מוצלחות שזוהו על ידי אמפליקון PCR מצמד של 1,550 זוגות בסיסים באמצעות פריימר גנומי משני הצדדים ופריימר GFP פנימי אחד. היעדר רצועת 1,550 זוגות בסיסים ברוב בעלי החיים של F1 הצביע על חוסר אינטגרציה ניתנת לזיהוי של מטרות, בהתאם להעברת DNA לא אינטגרטיבית ולא לתיקון מונחה הומולוגיה. קביעת זיגוזיות בצאצאי F2 שמקורו בקווים חיוביים ב-PCR בצומת מבחינה בין אללים לפי גודל רצועה ב-1,345 זוגות בסיסים כאלל מסוג פראי, ו-2,344 זוגות בסיסים כאלל נוק-אין.
הטרוזיגוטים מראים את שתי הלהקות. דגימות הונאק-אינ הומוזיגוטיות חסרות את הרצועה בגודל מסוג פראי, והדגימות עם אינטגרציה כושלת מציגות רק את המוצר בגודל מסוג פראי. אימות נוסף של קו ה-GFP ההומוזיגוטי בוצע באמצעות הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית, שבה נצפתה פלואורסצנציה של GFP בתאי הנבטה עם אות מועשר באזור הזרע.
פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ב-vivo של מיקום דינמיקת חלבונים בקו הגרמנט של C.elegans. עיצוב תג קפדני ואימות יסודי חיוניים לשמירה על תפקוד החלבון ולהפחתת מועמדים חיוביים שגויים. מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בזרימת עבודה זו כדי לעקוב אחר מיקום החלבונים ולחקור אינטראקציות אפשריות במהלך התפתחות קו הנבט.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג תהליך עבודה מעשי מבוסס CRISPR/Cas9 לסימון פלואורסצנטי של חלבונים אנדוגניים בקו הנבט של Caenorhabditis elegans. הפרוטוקול מאפשר יצירת אללים יציבים בשיטת knock-in המדווחים במדויק על מיקום החלבון תחת בקרה רגולטורית טבעית, ובכך מתגבר על מגבלותיהן של גישות מסורתיות לטרנסגנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- מיקום חלבונים הוא קריטי להבנת תפקוד הגנים במהלך הגמטוגנזה ב-C. elegans.
- שיטות קונבנציונליות להחדרת טרנסגנים גורמות לעיתים קרובות לביטוי משתנה ולהשתקה של השורה הנבטית.
- סימון אנדוגני מספק דפוסי ביטוי מהימנים ורלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.
- עריכה גנומית באמצעות CRISPR/Cas9 מאפשרת השבקה מדויקת של תגי פלואורסצנציה באתרים טבעיים.
מטרת המחקר
- תיאור של זרימת עבודה הניתנת לשחזור ליצירת חלבונים אנדוגניים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקו הנבט של C. elegans.
- מתן אפשרות ליצירת זנים הומוזיגוטיים יציבים עם השתלה פנימה (knock-in) לצורך ניתוחים התפתחותיים וביולוגיים-תאיים.
- אספקת פרוטוקול בעל יישום רחב עבור גנים המועשירים את קו הנבט.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בחירת אסטרטגיית תיוג מתאימה עבור חלבון המטרה.
- החדרה של רכיבי CRISPR/Cas9 באמצעות מיקרו-הזרקה לגונדות של תולעים הרמאפרודיות בוגרות צעירות.
- גינוטיפיקציה מבוססת PCR לאורך שני דורות כדי לזהות ולבודד תולעי knock-in הומוזיגוטים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לאישור פלואורסצנציה בקו הנבט ולהערכת לוקליזציה תת-תאית של החלבון in vivo.
תוצאות עיקריות
- ביסוס של זרימת עבודה ליצירה יעילה של חלבונים אנדוגניים המסומנים פלואורסצנטית ב-C. elegans.
- יצירת אללים של knock-in יציבים, המשמשים לדיווח על התפלגות חלבונים תחת בקרה טבעית.
- ניתן לבודד ולאמת באופן מהימן זנים הומוזיגוטים מסומנים.
- דימות קונפוקאלי מאשר לוקליזציה תת-תאית מדויקת של חלבונים מסומנים בקו הנבט.
מסקנות
- פרוטוקול CRISPR/Cas9 המתואר הוא חסון וניתן ליישום רחב עבור תיוג חלבונים בקו הנבט ב-C. elegans.
- הוא מתגבר על המגבלות של גישות מסורתיות לטרנסגנים, ומספק ביטוי יציב ורלוונטי מבחינה פיזיולוגית.
- תהליך עבודה זה מקל על מחקרים התפתחותיים וביולוגיים של התא על ידי מתן אפשרות לניתוח מדויק של לוקליזציית חלבונים in vivo.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סימון פלואורסצנטי אנדוגני באמצעות CRISPR/Cas9 בגנים של קו הנבט ב- Caenorhabditis elegans פותר את האתגר של ביטוי משתנה או מושתק של טרנסגנים, ומאפשר מחקרים מדויקים של לוקליזציית חלבונים תחת בקרה רגולטורית טבעית. זרימה זו של עבודה (workflow) מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה ותומכת בהחלטות גילוי מוקדמות ומבוססות. גישה זו ישימה באופן רחב להקמת מודלים רלוונטיים פיזיולוגית, שהם קריטיים למחקר תרגומי ולהקדמת פיתוח תיקי מוצרים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של לוקליזציית חלבונים לצורך תיקוף תפקודי של מטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אישור דפוסי ביטוי אנדוגניים.
- מקל על חקירה מונחית-השערה של תפקוד גנים במהלך הגמטוגנזה.
- משפר את הביטחון החזוי עבור מחקרים ביולוגיים המשכיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק זנים מתויגים יציבים וניתנים לשחזור עבור בדיקות דימוי כמותיות.
- מסטנדרט את המערכות הביולוגיות לצורך תוצרי סריקה עקביים.
- מאפשר הערכה מהימנה של התפלגות חלבונים סוב-צלולית in vivo.
- תומך בזרימות עבודה ניתנות להרחבה להערכת תרכובות בהקשרי גמלין.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתוני לוקליזציה של חלבונים עם תהליכים התפתחותיים הרלוונטיים למחלה.
- מבטיחה המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני תוך שימוש בוויסות גנים טבעי.
- מפחיתה את הסיכון לארטפקטים שעלולים להטות מחקרי ביומרקרים תרגומיים.
- מחזקת את הבסיס לקבלת החלטות על קידום הפרויקט בהתאם להערכת הסיכונים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטת תיוג זו, המתווכת על ידי CRISPR/Cas9, משתלבת ברצף הגילוי החל מאישור מטרות מוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ובכך היא תומכת הן במחקרים מכניסטיים והן ברצף תרגומי.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת השערות והבהרה של מסלולים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה של דינמיקה של חלבונים אנדוגניים.
- סריקה: מספקת פלטים של דימוג כמותיים הניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות.
- אנליזה: מספקת תוצאות של טיפוס גנטי (genotyping) מבוסס PCR ומיקרוסקופיה קונפוקלית להשוואה חסונה של נתונים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רלוונטיות פיזיולוגית לצורך התאמה של סממנים ביולוגיים ומודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זנים מתויגים לשימוש חוזר עבור יוזמות מו"פ נוכחיות ועתידיות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מנרמל את זרימות העבודה ומשפר את השחזוריות בין צוותי מחקר.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי מזעור הסיכון הביולוגי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם-סיכון ובקידום של מטרות מאושרות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בעריכת גנום באמצעות CRISPR/Cas9 ובטכניקות של מיקרו-הזרקה.
- נחוש גישה למיקרוסקופיה קונפוקלית ולתשתית גנוטיפינג מבוססת PCR.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית לאסטרטגיית התיוג ולפרוטוקולי סריקה.
- ניתן להתואמה לגנים אנדוגניים שונים המועשרים בקו הנבט ובגנים אחרים ב-C. elegans.
- תלוי בהתאוששות ובסריקה חסונות של אללים ערוכים לאורך דורות.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פרמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Germline Target Gene Selection and CRISPR Component Design in Caenorhabditis elegans
3:53
Preparing the Needle for the Gonadal Microinjection
5:30
Preparing the Worms for Injection
6:01
Performing the Gonadal Microinjection
7:07
Screening F1 and F2 Progeny
8:34
Results
10:04
Conclusion
