פרוטוקול יעיל למיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת בגרעעיני ארבידופסיס
May 8th, 2026
פרוטוקול זה מציע תהליך עבודה יעיל להדמיית מיקרוסקופיה בלוקליזציה בודדת של גרעיני ארבידופסיס מבודדים, תוך שימוש בבידוד, קיבוע ותיוג אופטימליים להשגת ויזואליזציה ננומטרית אמינה של כרומטין ו-RNA פולימראז II. גישה זו ניתנת להתאמה קלה לחלבונים אחרים הקשורים לכרומטין או לשינויים בהיסטונים להדמיה ברזולוציה גבוהה.
המחקר שלי מתמקד בעריכת אפיגנום ובהמחשת ארגון הכרומטין בגרעיני ארבידופסיס באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה על. השיטות הקיימות אינן מותאמות להדמיית STORM. פרוטוקול זה משפר את טוהר הגרעינים, עקביות התווית, הרכבת הדגימה ויציבות הדמיה.
הוא חל על Arabidopsis thaliana ומערכות צמחים נוספות לחקר ארגון גרעיני, מבנה כרומטין ואפיגנטיקה ברזולוציה גבוהה. כדי להתחיל, הניחו צלחת תרביות בעלת שש בארות על קרח מתחת למכסה האדים. מערבבים את תמיסת הקיבוע המכילה 4% נפח בנפח, פורמלדהיד מיוצב במתנול 0.1% טריטון X100 ו-PBS.
הוסיפו כארבעה מיליליטר של תמיסת קיבוע קרח לכל באר מתחת למכסה האדים. באמצעות מלקחיים נקיים, הסר את שתילי הערבידופסיס שנמצאים בין שמונה לחמישה עשר ימים לאחר הנביטה ממוצק של מורשיגה וסקוג, או מדיום MS. טבלו מיד את השתילים בתמיסת הקיבוע והניחו כ-20 שתילים בכל באר.
השתמש בשלוש בארות כדי לקבל מספיק חומר לכל דגימה. הניחו את הפלטה בתא ואקום מלא בקרח וסגרו אותה. מרח ואקום בין מינוס 0.6 בר למינוס 0.8 בר למשך 15 דקות כדי להסיר אוויר כלוא ולאפשר חדירה עמוקה של הקיבע לרקמות הצמח.
לאחר מכן, שחרר לאט את השואב. ערבבו את הדגימה ומרחו את הוואקום למשך 15 דקות נוספות. מתחת למכסה האדים, הסר את תמיסת הקיבוע עם פיפטה.
שטפו כל באר שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת תחת ערבוב עדין עם חמישה מיליליטר של PBS קר קרח. אחרי הכביסה, הסר את ה-PBS. באמצעות מלקחיים, העבר את הרקמה הקבועה לצלחת פטרי בגודל 120 על 120 מילימטר והוסיף 50 מיקרוליטר של בופר בידוד גרעינים לשתילים הקבועים.
עם להב, חתוך את הרקמה הקבועה. באמצעות אותו להב, גרדו את הרקמה הקצוצה לקצה אחד של צלחת הפטרי. הוסיפו 600 מיקרוליטר של בופר בידוד גרעינים ושטפו כל רקמה שנדבקה ללהב.
העבר את תערובת הרקמה לצינור הומוגנייזר Dounce בנפח שני מיליליטרים וליטף חמש עד עשר פעמים עם העלי הקטן. לאחר מכן, ליטפו עם העלי הגדול עד שהוא נע חלק בתוך הצינור, בדרך כלל דורשים חמש עד עשר משיכות. סנן את הדגימה ההומוגנית דרך מסנן רשת של 30 מיקרומטר לצינור של 50 מיליליטר.
העבר את הסינון לצינור חדש בנפח 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את המתלים למשך 10 דקות ב-800G באמצעות הרמפה הנמוכה ביותר גם להאצה וגם להאטה. לאחר הצנטריפוגה, שימו לב כי כדור קטן לבן נראה בין שברי הרקמה הירוקה.
השליכו את הסופרנטנט והחזירו את הכדור ב-600 מיקרוליטר של בופר בידוד גרעינים. צנטריפוגה שוב ל-10 דקות ב-800G והסר את הסופרנטנט. לאחר שטיפה מלאה של הפסולת הירוקה, אחסן את השפניה של הגרעינים המבודדים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך מקסימום של שבוע וצבע את הגרעינים בנוגדנים רצויים.
חממו את תמיסת האגרוז הנמסה של 1.5% במשקל בנפח בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת כדי להמיס את האבקה ולקבל תמיסה שקופה. Vortex לזמן קצר כדי להבטיח ערבוב מלא. קיררו את התמיסה ושמרו עליה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני שאתם ממשיכים להימנע מפירוק החום של בופר החמצן של הגלוקוז.
לאחר שתמיסת האגרוז עם התכה נמוכה מגיעה ל-37 מעלות צלזיוס, יש להכין את בופר STORM על ידי הוספת 100 מילימולר מרקפטואתילאמין וגלוקוז אוקסידאז לאגרוז עם התכה נמוכה כדי להגיע לריכוז סופי פי 1 ולערבב את התמיסה בעדינות. הניחו 10 מיקרוליטרים מתערובת הגרעינים על כיסוי 1.5H מטופל באוזון, שעבר טיפול במשך 20 דקות במערכת ניקוי אוזון אולטרה סגולה. חכה שלוש דקות כדי לאפשר לגרעינים להניח על טופס הכיסוי.
לאחר מכן, הסר את הנוזל העודף והמתין שתי דקות. הוסיפו 10 מיקרוליטר של האגרוז המוכן עם התכה נמוכה לכיסוי הכיסוי ומיד כסו עם סלייד מיקרוסקופ. אטום את הכיסוי באמצעות חומר איטום סיליקון.
מערבבים כמויות שוות של תמיסה A ותמיסה B בצלחת פטרי קטנה באמצעות קצה מיקרופיפטה. מרחו את התערובת על קצוות הכיסוי כדי לאטום את הדגימה. תן לאטימת הסיליקון להתקשות במשך חמש דקות.
התקן את שקופית הדגימה על המיקרוסקופ ומצא פוקוס. אתר ומתמקד בגרעין. הפעל מודול לשמירת מיקוד אם הוא זמין כדי להבטיח יציבות במהלך רכישות ארוכות.
בחר אזור שבו ננו-יהלום אחד או כמה ממוקמים ליד הגרעין כדי לשפר את תיקון ההסטה במהלך השיקום. להדמיה בשני צבעים, התחל ברכישה עם ערוץ אורך גל ארוך יותר ואז עבור לערוץ הקצר יותר כדי להשלים את ההדמיה. עבדו את ערימות התמונות הגולמיות ב-ThunderSTORM באמצעות התאמת גאוסיאן עם הערכת ריבועים משוקללים ויצירת תמונות משוחזרות.
יש להחיל סינון המבוסס על סיגמא ואי-ודאות מתחת ל-30 ננומטר כדי לשמור על מיקומים מדויקים ולהסיר רעש. לבסוף, לבצע תיקון סטיית דגימה באמצעות מתאם צולב ThunderSTORM או אלגוריתם COMET ואישור הסטה מינימלית בתמונות המשודרות. גרעינים בודדו משתילי טבע בני 15 יום, מסומנים בנוגדנים משניים מצומדים AF647 וצובעו נגדית ב-Hoechst H33258.
הדמיה קונפוקלית הראתה מספר גרעינים מבודדים ושמורים היטב עם פסולת מינימלית, עם הכרומוסנטרים והגרעין הניתנים להבחנה ברורה. אות RNA פולימראז II נעדר מהכרומוזנטרים ומהגרעין. הקרנות בעוצמה מקסימלית ושיחזורי SMLM תואמים חשפו פרטים מבניים של RNA פולימראז II וסימון DNA, כולל אזורים מוגדלים המראים מבנים עדינים יותר.
סינון לוקליזציה המבוסס על סיגמא ואי-ודאות שיפר את הגדרת אותות RNA פולימראז II ו-DNA בהשוואה ללוקאליזציות שזוהו. ושיפור נוסף לאחר תיקון הסטייה שמרו על המבנה המשופר הזה. סינון המבוסס על ערכי סיגמא הסיר לוקליזציות עם רוחבים מותאמים קטנים או גדולים מדי.
ניתוח קורלציה טבעת פורייה הראה שהרזולוציה בערוץ AF647 השתפרה מ-90.1 ל-47.7 ננומטר לאחר הסינון, בעוד שערוץ JF549 השתפר מ-56.6 ל-27.9 ננומטר. שמירה על שלמות גרעינית תוך מזעור פסולת ופלואורסצנציה ברקע היא קריטית להשגת הדמיה איכותית של מולקולה בודדת. מחקרים עתידיים יכולים לקשר בין ארכיטקטורה גרעינית לוויסות גנים בתנאים סביבתיים או התפתחותיים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article introduces a streamlined and reproducible protocol for Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM), specifically direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), to visualize chromatin architecture in nuclei isolated from Arabidopsis thaliana. The workflow addresses technical challenges in plant sample preparation, enabling nanoscale imaging of chromatin domains, histone modifications, and nuclear organization with enhanced clarity and reproducibility.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Super-resolution microscopy
- Chromatin organization
Background
- Confocal fluorescence microscopy is limited by diffraction, restricting resolution in chromatin studies.
- Super-resolution techniques like SMLM overcome these limitations, providing nanoscale insights.
- dSTORM is widely used in mammalian systems but less so in plants due to sample preparation challenges.
- Improved protocols are needed to facilitate SMLM in plant nuclei.
Purpose of Study
- To develop a reproducible workflow for SMLM imaging of plant nuclei.
- To enable high-resolution visualization of chromatin modifications and nuclear architecture in Arabidopsis thaliana.
- To lower technical barriers for applying super-resolution microscopy in plant biology.
Methods Used
- Fixation of Arabidopsis seedlings to preserve nuclear morphology.
- Gentle tissue chopping and centrifugation to enrich for intact nuclei.
- Fluorophore labeling of isolated nuclei in liquid medium.
- Immobilization of nuclei on low-melting agarose pads for imaging stability.
Main Results
- The protocol minimizes background fluorescence and improves labeling consistency.
- Enhanced reproducibility is achieved across biological replicates.
- Preparations allow clear visualization of chromatin modifications and nuclear architecture at the nanoscale.
- The workflow facilitates studies of epigenetic regulation and nuclear topology in plants.
Conclusions
- This protocol establishes a methodological foundation for SMLM imaging in plant systems.
- It bridges the gap between plant and mammalian cell biology in super-resolution imaging.
- The approach opens new opportunities to study genome regulation and nuclear architecture in response to developmental and environmental cues in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Super-resolution imaging of chromatin architecture in plant nuclei addresses a critical gap in understanding epigenetic regulation and nuclear organization at the nanoscale. This streamlined SMLM protocol for Arabidopsis nuclei enables reproducible, high-resolution visualization, supporting predictive confidence in chromatin state analysis. The approach enhances early discovery and mechanistic de-risking for plant-based R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables nanoscale interrogation of chromatin domains and histone modifications in plant nuclei.
- Supports functional validation of epigenetic targets by visualizing nuclear architecture changes.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct observation of chromatin organization.
- Improves predictive confidence in linking nuclear structure to gene regulation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized sample preparation for reproducible super-resolution imaging workflows.
- Delivers quantitative, high-clarity readouts of chromatin modifications for assay development.
- Enables consistent labeling and imaging across biological replicates, supporting screening scalability.
- Prepares validated plant nuclear systems for downstream compound or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin imaging outputs with translational biomarker discovery in plant systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of epigenetic interventions.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying nuclear topological changes under different conditions.
- Provides mechanistic insights relevant to environmental and developmental response studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early chromatin hypothesis testing to preclinical validation of epigenetic mechanisms in plants.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of chromatin organization and nuclear architecture.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables precise measurement of chromatin modifications and nuclear features for comparative studies.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling biomarker alignment in plant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging workflow adaptable to diverse plant research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in chromatin state analysis.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for epigenetic target programs in plant R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of plant-based discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and plant nuclear isolation.
- Needs access to dSTORM-capable imaging platforms and fluorophore labeling reagents.
- Demands cross-team standardization of fixation, labeling, and immobilization protocols.
- May require adaptation for different plant species or tissue types.
- Sample stability and background minimization are critical for reproducible outputs.
