פרוטוקול יעיל למיקרוסקופיית מיקום מולקולה בודדת בגרעעיני ארבידופסיס

המחקר שלי מתמקד בעריכת אפיגנום ובהמחשת ארגון הכרומטין בגרעיני ארבידופסיס באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה על. השיטות הקיימות אינן מותאמות להדמיית STORM. פרוטוקול זה משפר את טוהר הגרעינים, עקביות התווית, הרכבת הדגימה ויציבות הדמיה.

הוא חל על Arabidopsis thaliana ומערכות צמחים נוספות לחקר ארגון גרעיני, מבנה כרומטין ואפיגנטיקה ברזולוציה גבוהה. כדי להתחיל, הניחו צלחת תרביות בעלת שש בארות על קרח מתחת למכסה האדים. מערבבים את תמיסת הקיבוע המכילה 4% נפח בנפח, פורמלדהיד מיוצב במתנול 0.1% טריטון X100 ו-PBS.

הוסיפו כארבעה מיליליטר של תמיסת קיבוע קרח לכל באר מתחת למכסה האדים. באמצעות מלקחיים נקיים, הסר את שתילי הערבידופסיס שנמצאים בין שמונה לחמישה עשר ימים לאחר הנביטה ממוצק של מורשיגה וסקוג, או מדיום MS. טבלו מיד את השתילים בתמיסת הקיבוע והניחו כ-20 שתילים בכל באר.

השתמש בשלוש בארות כדי לקבל מספיק חומר לכל דגימה. הניחו את הפלטה בתא ואקום מלא בקרח וסגרו אותה. מרח ואקום בין מינוס 0.6 בר למינוס 0.8 בר למשך 15 דקות כדי להסיר אוויר כלוא ולאפשר חדירה עמוקה של הקיבע לרקמות הצמח.

לאחר מכן, שחרר לאט את השואב. ערבבו את הדגימה ומרחו את הוואקום למשך 15 דקות נוספות. מתחת למכסה האדים, הסר את תמיסת הקיבוע עם פיפטה.

שטפו כל באר שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת תחת ערבוב עדין עם חמישה מיליליטר של PBS קר קרח. אחרי הכביסה, הסר את ה-PBS. באמצעות מלקחיים, העבר את הרקמה הקבועה לצלחת פטרי בגודל 120 על 120 מילימטר והוסיף 50 מיקרוליטר של בופר בידוד גרעינים לשתילים הקבועים.

עם להב, חתוך את הרקמה הקבועה. באמצעות אותו להב, גרדו את הרקמה הקצוצה לקצה אחד של צלחת הפטרי. הוסיפו 600 מיקרוליטר של בופר בידוד גרעינים ושטפו כל רקמה שנדבקה ללהב.

העבר את תערובת הרקמה לצינור הומוגנייזר Dounce בנפח שני מיליליטרים וליטף חמש עד עשר פעמים עם העלי הקטן. לאחר מכן, ליטפו עם העלי הגדול עד שהוא נע חלק בתוך הצינור, בדרך כלל דורשים חמש עד עשר משיכות. סנן את הדגימה ההומוגנית דרך מסנן רשת של 30 מיקרומטר לצינור של 50 מיליליטר.

העבר את הסינון לצינור חדש בנפח 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את המתלים למשך 10 דקות ב-800G באמצעות הרמפה הנמוכה ביותר גם להאצה וגם להאטה. לאחר הצנטריפוגה, שימו לב כי כדור קטן לבן נראה בין שברי הרקמה הירוקה.

השליכו את הסופרנטנט והחזירו את הכדור ב-600 מיקרוליטר של בופר בידוד גרעינים. צנטריפוגה שוב ל-10 דקות ב-800G והסר את הסופרנטנט. לאחר שטיפה מלאה של הפסולת הירוקה, אחסן את השפניה של הגרעינים המבודדים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך מקסימום של שבוע וצבע את הגרעינים בנוגדנים רצויים.

חממו את תמיסת האגרוז הנמסה של 1.5% במשקל בנפח בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת כדי להמיס את האבקה ולקבל תמיסה שקופה. Vortex לזמן קצר כדי להבטיח ערבוב מלא. קיררו את התמיסה ושמרו עליה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני שאתם ממשיכים להימנע מפירוק החום של בופר החמצן של הגלוקוז.

לאחר שתמיסת האגרוז עם התכה נמוכה מגיעה ל-37 מעלות צלזיוס, יש להכין את בופר STORM על ידי הוספת 100 מילימולר מרקפטואתילאמין וגלוקוז אוקסידאז לאגרוז עם התכה נמוכה כדי להגיע לריכוז סופי פי 1 ולערבב את התמיסה בעדינות. הניחו 10 מיקרוליטרים מתערובת הגרעינים על כיסוי 1.5H מטופל באוזון, שעבר טיפול במשך 20 דקות במערכת ניקוי אוזון אולטרה סגולה. חכה שלוש דקות כדי לאפשר לגרעינים להניח על טופס הכיסוי.

לאחר מכן, הסר את הנוזל העודף והמתין שתי דקות. הוסיפו 10 מיקרוליטר של האגרוז המוכן עם התכה נמוכה לכיסוי הכיסוי ומיד כסו עם סלייד מיקרוסקופ. אטום את הכיסוי באמצעות חומר איטום סיליקון.

מערבבים כמויות שוות של תמיסה A ותמיסה B בצלחת פטרי קטנה באמצעות קצה מיקרופיפטה. מרחו את התערובת על קצוות הכיסוי כדי לאטום את הדגימה. תן לאטימת הסיליקון להתקשות במשך חמש דקות.

התקן את שקופית הדגימה על המיקרוסקופ ומצא פוקוס. אתר ומתמקד בגרעין. הפעל מודול לשמירת מיקוד אם הוא זמין כדי להבטיח יציבות במהלך רכישות ארוכות.

בחר אזור שבו ננו-יהלום אחד או כמה ממוקמים ליד הגרעין כדי לשפר את תיקון ההסטה במהלך השיקום. להדמיה בשני צבעים, התחל ברכישה עם ערוץ אורך גל ארוך יותר ואז עבור לערוץ הקצר יותר כדי להשלים את ההדמיה. עבדו את ערימות התמונות הגולמיות ב-ThunderSTORM באמצעות התאמת גאוסיאן עם הערכת ריבועים משוקללים ויצירת תמונות משוחזרות.

יש להחיל סינון המבוסס על סיגמא ואי-ודאות מתחת ל-30 ננומטר כדי לשמור על מיקומים מדויקים ולהסיר רעש. לבסוף, לבצע תיקון סטיית דגימה באמצעות מתאם צולב ThunderSTORM או אלגוריתם COMET ואישור הסטה מינימלית בתמונות המשודרות. גרעינים בודדו משתילי טבע בני 15 יום, מסומנים בנוגדנים משניים מצומדים AF647 וצובעו נגדית ב-Hoechst H33258.

הדמיה קונפוקלית הראתה מספר גרעינים מבודדים ושמורים היטב עם פסולת מינימלית, עם הכרומוסנטרים והגרעין הניתנים להבחנה ברורה. אות RNA פולימראז II נעדר מהכרומוזנטרים ומהגרעין. הקרנות בעוצמה מקסימלית ושיחזורי SMLM תואמים חשפו פרטים מבניים של RNA פולימראז II וסימון DNA, כולל אזורים מוגדלים המראים מבנים עדינים יותר.

סינון לוקליזציה המבוסס על סיגמא ואי-ודאות שיפר את הגדרת אותות RNA פולימראז II ו-DNA בהשוואה ללוקאליזציות שזוהו. ושיפור נוסף לאחר תיקון הסטייה שמרו על המבנה המשופר הזה. סינון המבוסס על ערכי סיגמא הסיר לוקליזציות עם רוחבים מותאמים קטנים או גדולים מדי.

ניתוח קורלציה טבעת פורייה הראה שהרזולוציה בערוץ AF647 השתפרה מ-90.1 ל-47.7 ננומטר לאחר הסינון, בעוד שערוץ JF549 השתפר מ-56.6 ל-27.9 ננומטר. שמירה על שלמות גרעינית תוך מזעור פסולת ופלואורסצנציה ברקע היא קריטית להשגת הדמיה איכותית של מולקולה בודדת. מחקרים עתידיים יכולים לקשר בין ארכיטקטורה גרעינית לוויסות גנים בתנאים סביבתיים או התפתחותיים.