שיטה אופטימלית לבידוד אפיתל שופכה של נקבות עכבר לניתוח תא יחיד ואימונופלואורסצנציה

הקבוצה שלנו מעוניינת לחקור דפוסי אפיתל במערכת הגניטורינרים. פרוטוקול זה מייצג שיטה אופטימלית לבידוד רירית האפיתל של שופכת השופכה של הנקבה לניתוח מולקולרי ותאי במורד הזרם. השיטות המתוארות במאמר זה יסייעו במחקר על רירית השופכה הנשית ותפקידה בהגנה חיסונית.

כדי להתחיל, הניחו את העכבר הנקבה CD1 שהורשמה בגיל 6 עד 12 שבועות במצב שכיבה על שולחן הניתוח. רסס 70% אתנול על הבטן כדי להרטיב את השיער. באמצעות מלקחיים, הרימו את העור בבטן.

לאחר מכן, עם מספריים קטנים, מבצעים חתך אנכי לכיוון הגוף התחתון, שמסתיים בפתח השופכה החיצוני. זהו את שלפוחית השתן והרימו אותה בעדינות עם מלקחיים, כדי לוודא שהיא ריקה וללא שתן. באמצעות מספריים, גוזמים את השומן ורקמת החיבור סביב שלפוחית השתן כדי לחשוף את המבנה בצורת פרפר במקום שבו שתי עצמות הערווה מתחברות בסימפיזיזה הערווה.

הבחינו בשופכה שעוברת מתחת לסימפיזיס הערווה. אחר כך להרים את הסימפיזה הערווה עם מלקחיים ולחתוך אותו עם מספריים. הסר את שברי עצם הערווה כדי לחשוף את השופכה הדקה השוכנת על המשטח הגוני של דופן הנרתיק.

בעזרת מלקחיים דקים, משכו בעדינות את השלפוחית כלפי מעלה מחלל הגוף. העבירי מספריים בין השופכה לדופן הנרתיק כדי להפריד בין דרכי השתן למערכת הרבייה. שמרי על מתח קל בשלפוחית השתן תוך חיתוך לאורך גב השופכה כדי להפריד אותה מדופן הנרתיק.

המשך לחתוך לפתח השופכה הדיסטלי כדי לקבל את השופכה המלאה של העכבר, באורך של 1.2 עד 1.5 סנטימטרים. לאחר מכן, הפריד את השופכה מהשלפוחית על ידי חתך יחיד בצוואר השלפוחית. בריכה של ארבע עד חמש שופכות בצלחת פטרי סטרילית המכילה HBSS טרי ללא סידן ומגנזיום.

תחת מיקרוסקופ ניתוח, גזמו את השומן והרקמה המחברת סביב השופכה באמצעות מלקחיים דקים ומספריים. לאחר מכן, עם מספריים, חתוך כל שופכה לרוחב לשני חלקים שווים בגודל. הנח את חלקי הטישו על מסננת רשת ניילון של 100 מיקרון.

שטפו את חלקי הרקמה עם מיליליטר אחד של HBSS, ואז העבירו אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של 1% טריפסין שהוכן ב-HBSS בתוספת אנטיביוטיקה ואנטימיקוטיקות. לאחר מכן, דגרו את הדגימה על רוטטור במהירות של 30 סיבובים לדקה וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 דקות. לאחר העיכול, הוסף לצינור 10 מילימולר מגנזיום כלוריד שהוכן ב-HBSS, ואחר כך 10 מיקרוגרם למיליליטר של DNAse שהכנתי ב-PBS.

דגרו את הצינור למשך 15 עד 30 דקות על רוטטור הממוקם בתוך תנור היברידיזציה של 37 מעלות צלזיוס. כדי לכבות את הטריפסין, העבר את רקמות השופכה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 10% סרום כבשים ב-HBSS בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, העבר את רקמות השופכה לצינור חדש המכיל HBSS קר קרח, ואז לצלחת פטרי סטרילית המכילה HBSS קר מאוד.

בעת צפייה בדגימה תחת מיקרוסקופ, החזק קצה אחד של חלק השופכה עם זוג מלקחיים. באמצעות זוג מלקחיים נוסף, מעבירים לאורך כל חלק השופכה כדי להוציא את שכבת האפיתל השקופה. עבדו חלק מהיריעות האפיתל המבודדות של השופכה ישירות לצורך צביעת אימונוס שלמה כדי להמחיש תאי אפיתל ומקרופאגים הקשורים לאפיתל במקום.

השתמשו בפיפטה פלסטיק קטנה כדי להעביר את חלקי האפיתל בטיפה של HBSS מבודדת מארבע עד חמש שופכות עכברים לתוך צלחת פטרי סטרילית. השתמש במספריים כדי לטחון את האפיתל לחתיכות קטנות. העבר את שברי האפיתל הטחונים לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח שני מיליליטר המכיל 1.5 מיליליטר של תמיסת עיכול אקווטאז מחוממת מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

דגור את הדגימה על סיבוב ב-37 מעלות למשך שעה. לאחר הדגירה, העבר את כל התכולה לצינור צנטריפוגה בנפח חמישה מיליליטרים המכיל שני מיליליטרים של בופר שטיפה, המורכב מ-1X PBS ללא סידן ומגנזיום ו-1% BSA. צנטריפוגה את המתלה בטמפרטורה של 600 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס באמצעות רוטור דלי מתנדנד.

לאחר מכן, שאיפת הסופרנטנט באמצעות שואב אבק עדין. לאחר מכן השתמשו בפיפטה של קצה פילטר אחד מיליליטר כדי להחזיר את הפלט למיליליטר אחד של בופר שטיפה. שבור את הכדור על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עד שהגושים הופכים לקטנים יותר.

העבר את המתלה דרך מחטים ברוחב 23.5 ו-26.5, כל אחת מחוברת למזרק של מיליליטר עם ארבע פעימות לכל מחט. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של בופר שטיפה כדי להרטיב את פני השטח של מסנן הפרדה מקדים של 30 מיקרון הממוקם מעל צינור של 5 מיליליטר. באמצעות המזרק שמחובר למחט 26.5 גייג', העבר מיליליטר אחד מהמתלה התא דרך המסנן.

אחר כך שטוף את הצינור עם מיליליטר אחד של בופר שטיפה והעבר דרך הפילטר. הפכו את התאים בצנטריפוגה בטמפרטורה של 600 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס באמצעות רוטור דלי מתנדנד. שאפו את הסופרנטנט.

החזירו את הכדור ל-100 מיקרוליטר של בופר שטיפה והוסיפו 100 מיקרוליטר של בופר פירוק תאי דם אדומים. אחרי בדיוק שלוש דקות, הוסיפו ארבעה מיליליטר של בופר שטיפה וערבבו. קצור את התאים בצנטריפוגה בטמפרטורה של 600 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס באמצעות רוטור דלי מתנדנד.

הסר את הסופרנטנט לפני שתושיית את הכדור מחדש ב-50 עד 200 מיקרוליטר של בופר שטיפה, תלוי בגודל הכדור. מערבבים אליקו של חמישה מיקרוליטר של תאים עם חמישה מיקרוליטרים של טרייפן בלו והעמיסו את התערובת להמוציטומטר כדי להעריך את תפוקת התאים ועמידותם. להעריך את הקיימות של התאים ולכמת אוכלוסיות תאים שונות באמצעות ציטומטריית זרימה.

תרב תאים בודדים אפיתל שופכה במטריצת ממברנה בסיסית ובמדיום התרחבות אורגנואידי ליצירת אורגנואידים אפיתל תלת-ממדיים בשופכה. לבצע צביעת המטוקסילין אאוזין וצביעת חיסון פלואורסצנטית על מקטעים אורגנואידיים מוטמעים כדי להמחיש מבנה אורגנואידי והרכב תאי. מעטפות האפיתל של השופכה המבודדות היו בעלות שקיפות גבוהה יותר מאשר רקמת הסטרומל לאחר ההפרדה.

צביעת מערכת חיסון שלמה של מעטפת האפיתל הראתה סימון חזק עם נוגדן E-cadherin CDH1. סימון היריעות עם הנוגדן ל-F480 הראה שהמקרופאגים יוצרים מבנים דנדריטיים מתפצלים בין תאי האפיתל של השופכה. תאים בודדים שבודדו מאפיתל השופכה הראו עמידות גבוהה עקבית על ידי הדרת טריפאן בלו על המוסציטומטר וציטומטריית זרימה באמצעות צבע רפאים V450 הריאקטיבי של אמינים.

התאים המבודדים הכילו אוכלוסיית תאי אפיתל מועשרים לאחר שהגיעו לתאים החיים. כ-1.3% מתאי החיסון החיוביים ל-CD45 ו-1.18% מקרופאגים נצפו בתסעיפי תא יחיד. תאי אפיתל בודדים מבודדים מהשופכה נשארו חיוניים ויצרו אורגנואידים במטריצה תלת-ממדית עם צמיחת אורגנואידים שנצפתה עד היום השישי בתרבית.

צביעת המטוקסילין אאוזין הפגינה שתי מורפולוגיות מובחנות של אורגנואידים אפיתל בשופכה, כולל אורגנואידים חלולים גדולים ואורגנידים מוצקים קטנים יותר. גם האורגנואידים החלולים וגם המוצקים של האורגנואידים האפיתליים בשופכה היו מסודרים ובוטאו בשכבת הבסיס KRT5 ו-P63. הם הביעו KRT-13 בשכבות התא הסופרבאסלית והבינונית.

האורגנואידים שנוצרו מהשופכה הקרובה הראו שיעור גבוה יותר של אורגנואידים חלולים, בעוד שהאורגנואידים מהשופכה הדיסטלית יצרו יותר כדורים מוצקים. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור סוגי תאי שופכה ויכולת ההתחדשות העצמית של תאי אפיתל מהשופכה הפרוקסימלית והדיסטלית. אחד השיקולים החשובים ביותר בפרוטוקול זה הוא ניתוח מדויק של שופכה באורך מלא ועיכול אנזימטי מיטבי להשגת תאי אפיתל שופכה בריאים לניתוח במורד הזרם.

תאי האפיתל המיוצרים על ידי פרוטוקול זה יכולים לשמש למספר יישומים, כולל ריצוף RNA חד-תאים, ריצוף RNA בכמויות גדולות, ציטומטריית זרימה, צביעת חיסון ותרבות אורגנואידים.