אימונולוקליזציה תלת-ממדית במיוציטים של תירס

המחקר שלנו מתמקד בפיתוח גישה תלת-ממדית (3D) לבדיקת מייוציטים זכריים בתירס ולהדמיות של חלבונים מייוטיים בתאים בודדים. מלבד תירס, ניתן להחיל פרוטוקול זה לבדיקת מייוציטים באורז, שיפון, שעורה וחיטה. כדי להתחיל, השג צמחי תירס בשלב V13, כאשר התפרחים עדיין גדלים בתוך הגבעול.

במהלך השבוע של קיבוע האtoNumber המיאוטי, לחצו בעדינות על הגבעול המורחב באזור הבליטה תוך כדי חבישת כפפות, כדי לבדוק אם הוא רך מספיק לחיתוך. לאחר הכנת התמיסות המגבפות (buffers) הדרושות, הכינו תא לחות על ידי הנחת חמישה עד 10 מגבונים נייר לחים בתוך קופסת פלסטיק. הסירו עודפי מים מהתא.

בעזרת להב תער, חתוך את הגבעול בגובה התפרח (inflorescence) כדי לחשוף את ענפי הנישוא (tassel) וענפים צדדיים. לאחר דיסקציה ואיסוף של הענפים הצדדיים, עטוף אותם במגבות של תא הלחות תוך שמירה על התא בטמפרטורת החדר. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו, אסוף אבקנים טריים מהפרחים לתוך צלחת פטרי średnica 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר של 1X buffer A או BA. זהה את שלבי המיוזה על סמך הגודל והצבע.

לאחר העברת האבקנים לצחנית פטרי חדשה בקוטר 35 מילימטר, הוסיפו לאבקנים שלושה מיליליטר של תמיסת קיבוע. אטמו את צחנית הפטרי באמצעות פאראפילם כדי למנוע התאיידות של פורמלהיד. הניחו את צחנית הפטרי בקוטר 35 מילימטר על גבי צחנית פטרי גדולה יותר הממוקמת על שייקר סיבובי, והגדירו מהירות של 40 עד 60 RPM בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.

שטפו את האבקנים באמצעות 3 milliliters של 1XBA. לאחר העברת האבקנים לכלי פטרי קטן, אטמו את כלי הפטרי והניחו אותו על שייקר סיבובי בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות, כאשר המהירות מכוונת ל-40 עד 60 RPM. בעזרת פינצטה נקייה, העבירו את האבקנים לכלי פטרי קטן של 35 millimeter המכיל 3 milliliters של 1XBA.

לאחר שסגרתם את צלחת הפטרי בחוזקה עם parafilm, הניחו את צלחת הפטרי הקטנה בתוך צלחת פטרי גדולה יותר. לאחר כיסויה בנייר אלומיניום, שמרו את הדגימה בטמפרטורה של 4°C עד למועד השימוש. ביום הראשון, הכינו 2 mL של תמיסת acrylamide על ידי ערבוב של נפחים שווים של acrylamide ו-2XBA.

בצעו דגזינג (Degas) של תמיסת האקרילאמיד תחת ואקום למשך חמש עד 10 דקות לפני הוספת נתרבית סולפית ואמוניום פרסולפט. העבירו מנות של 100 µL של תערובת של אקרילאמיד ו-XBA בריכוז 2X ביחס של אחד-לאחד למבחנות של 1.5 mL, בהתאם למספר השקופיות שהוכנו. הניחו פיסות פאראפילם בגודל שני סנטימטר על שני סנטימטר מעל צלחת פטרי והמקמו אותן תחת סטריאומקרוסקופ.

לאחר קיטום קצה הפיפטה בעזרת מספריים, העבירו בפיפטה 50 microliters של תמיסת BA עם אבקנים על גבי ה-parafilm. העבירו בפיפטה 25 microliters של תמיסת BA לאזור אחר של ה-parafilm. לאחר החזקת האבקנים בעזרת פינצטה, חתכו את קצותיהם בעזרת סכין מנתחים.

לאחר סחיטת המיוציטים, השתמשו בפיפט כדי להעביר אותם אל טיפת BA של 25 µL וערבבו בעדינות. העבירו בפיפט 10 µL מתערובת המיוציטים אל לביש 유리 (cover slip) נפרד. הוסיפו במהירות 5 µL של sodium sulfite ו-5 µL של ammonium per sulfate למבחנה של 1.5 mL המכילה acrylamide ו-2XBA.

טפטפו חמישה µL מתערובת זו על לביבת הזריקה וערבבו אותה עם המיוציטים. הניחו לביבת זריקה מצופה פולי-ליזין מעל, בזווית של 45 מעלות. לאחר המתנה של 30 עד 50 דקות לפולימריזציה מלאה בטמפרטורת החדר, הפרידו בזהירות בין לביבות הזריקה באמצעות להב תער.

לאחר מכן, הניחו אותם כאשר צד הפד פונה כלפי מעלה בתוך צלחת פטרי. שטפו את כיסוי הזריקה (cover slip) ב-1 mL של 1XPBS מועשר ב-1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, או EDTA, ו-1% Triton בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. הכינו ושלבו נוגדנים ראשוניים ממינים מארחים שונים כדי להבטיח אותות מובחנים במהלך הגילוי.

הוסיפו 50 µL של הנוגדן הראשוני המדולל למרכז זכוכית הכיסוי המכילה את הפד. לאחר מכן, הניחו את צלח הפטרי בתא לחות למשך לילה. ביום השני, הכינו 500 mL של בופר שטיפה המכיל 1× PBS, 0.1% Tween 20, ו-1 mM EDTA.

בעזרת פיפטה, הסר את התמיסה לאחר דגירה לילה. שטוף את לבישת הזכוכית פעמיים עם 1 mL של בופר שטיפה. לאחר הסרת הבופר, הוסף שוב 1 mL של בופר שטיפה ודגור למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

חזור על שלב שטיפה זה שבע פעמים נוספות. לאחר השטיפה האחרונה, כסה את הצלחת והשאר אותה למשך הלילה בתא לחות. הכן את הנוגדנים המשניים על ידי דילולם ביחס של 1:50 בבuffer חסימה.

לאחר הסרת תמיסת השטיפה, יש להוסיף 50 µL של הנוגדן המשני המדולל למרכזו של כל פד. לאחר מכן, יש להניח את צלחת הפטרי בתא לחות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת התמיסה מהבאר, יש לשטוף ארבע פעמים עם 1 mL של בופר שטיפה, למשך שעה אחת בכל פעם, בטמפרטורת החדר.

שטפו את הבאר עם 1 mL של PBS למשך 10 דקות וחזרו על תהליך זה פעמיים נוספות. הוסיפו לבאר 500 µL של DAPI, שהוכן בריכוז סופי של 1 µg/mL, והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הוצאת הזהב המוארך מטמפרטורה של 4 °C, הפשירו אותו עד שיגיע לטמפרטורת החדר.

שטפו את השקופיות עם 1 mL של PBS למשך 30 דקות וחזרו על הפעולה פעמיים. לאחר הסרת תמיסת השטיפה האחרונה, הוסיפו שתי טיפות של prolonged antifade במרכז הרפידה. לאחר הרמת זכוכית הכיסוי מהבאר, הצמידו אותה לשקופיות המסומנות.

באמצעות ואקום, הסירו עודפי גליצרין מקצות הזכוכית המכסה ואטמו בשתי שכבות של לק ציפורניים. בחנו את השקופיות תחת מיקרוסקופ תוך שימוש באורכי גל עירור ובמסננים מתאימים לצילום תמונות. צביעת DAPI הראתה גרעין ברור וצביעת כרומטין, לצד צביעה ציטופלזמית טבעית חלשה יותר של DNA פלסטידי ומיטוכונדריאלי.

היעדר AFD1 (Absence of first division one), ASY1 (asynaptic one) ו-ZYP1 (Zipper1) על הכרומוזומים ובציטופלזמה במהלך שלב ה-preleptinema. בשלבים מאוחרים יותר, האות התרכז על הכרומוזום, בעוד שכמות ניכרת של ZYP1 נותרה בציטופלזמה לפני השלמת הסינפסיס. הקוהסין המיוטי AFD1 יצר מבנה ליניארי רק לאחר שלב ה-zygonema.

במקביל להיווצרותם של חוטים ליניאריים של הקומפלקס הסינפטונמלי. אות ה-ASY1 הפך לחלש יחסית לאחר ש-ZYP1 ו-AFD1 נטענו למבנים ליניאריים. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבחון קו-לוקליזציה ודינמיקה של חלבונים, לוקליזציה תת-תאית טבעית, ארכיטקטורה כרומוזומלית תלת-ממדית, התקדמות ומסגור של שלבי המיוזה.

האתגר המרכזי בפרוטוקול זה הוא בחירה קפדנית של שילובים תואמים של נוגדנים ראשוניים ומשניים. ניתן להרחיב מחקרים על בסיס עבודה זו על ידי השוואת המיוזה בזכרים ובנקבות כדי לחקור את המנגנון המולקולרי העומד בבסיס ה-athelchasmi.