הדמיה כמותית של תאים חיים של צורת גרעין ודינמיקת כרומטין במהלך ההתפתחות ולחץ סביבתי בשורש Arabidopsis thaliana

המחקר שלנו בוחן גנים ומנגנונים המאפשרים התאוששות שורשים ארוכת טווח מלחץ אוסמוטי כדי לחזק את הגידולים מפני בצורת. למרות שפותח לשורשי ארבידופסיס, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למערכות עם קווי סימון חלבונים פלואורסצנטיים. קבלו את לוחות הצמיחה המכילים שתילי Arabidopsis thaliana המוכנים להדמיה.

פיפטה של 60 מיקרוליטר מים טהורים על מחסנית זכוכית. הניחו שלושה שורשי שתיל A.thaliana בני שישה ימים במים. הנח כיסוי בגודל 22x22 מילימטר בגודל 1.5 מעל השורשים מבלי לכסות את העלים.

במיקרוסקופ קונפוקלי, הגדר את זמן החשיפה ללייזר ל-1,000 מילישניות. בהגדרות המשלב לייזר, כוון את הלייזר של 488 ננומטר ל-50% עבור הדמיית חלבון פלואורסצנטי ירוק, או GFP. הגדר את לייזר 561 ננומטר ל-50% עבור הדמיית חלבון פלואורסצנטי אדום, או RFP.

צילם את הדגימה באמצעות עדשת אובייקטיב 20X ללא זום אופטי. הגדר את גודל הצעד של פרוסת ה-Z ל-0.3 מיקרומטר. הגדר את מרווח ההדמיה לדקה אחת, ואת משך ההדמיה הכולל ל-10 דקות.

אתר את השורשים ובחר עד 20 פרוסות Z. ללכוד תמונות 16 ביט. התחל את רכישת הטיימלפס ושמור את הזמן כקובץ TIFF באמצעות דחיסה ללא אובדן.

העבר את הנתונים שנרכשו למחשב לניתוח. פתח את תוכנת ImageJ או Fiji. לחץ וגרר את קובץ ה-VSI לחלון היישום הראשי של ImageJ או Fiji.

בשרשרת אפשרויות הייבוא של Bio Formats, לחץ על OK בפינה הימנית התחתונה. לאחר מכן, בהנחיית אפשרויות הסדרה של Bio Format, ודא שסדרה 1 נבחרה. לחץ על OK בפינה השמאלית התחתונה.

לאחר טעינת התמונה, חלק את האותות על ידי בחירת תמונה. בחר צבע ובחר ערוצים מפוצלים. צפו בחלונות נפרדים שנוצרו עבור גרעינים מסומנים ב-GFP וכרומטין מסומן ב-RFP.

קבע איזה משני חלונות התמונה מתאים לכרומטין. לאחר לחיצה על חלון תמונת הכרומטין, החלו את פעולת פרויקט Z על ידי בחירת תמונה, בחירת מחסניות, ואז לחיצה על פרויקט Z מהחלון הראשי של ImageJ. שנה את סוג ההקרנה לעוצמה מקסימלית.

ודא ש-All Time Frames פעיל, ולחץ על OK כדי ליצור את ההקרנה. פתח את תפריט הניגודיות על ידי לחיצה על Control Shift C, או בחירת Image ובחירת Adjustment, ואז לחיצה על בהירות או ניגודיות מהחלון הראשי של ImageJ. הזז את מוט המינימום שמאלה עד שהכרומטין נראה בבירור.

נווט לפלאגינים. לחץ על החץ למטה בתפריט התוספים כדי לגלול לאפשרות המעקב. בחר מעקב ולחץ על TrackMate.

אשר שההגדרות מדויקות של הכיול ולחץ על הבא. בחר בגלאי סף ולחץ על הבא. עברו לפריים האחרון של הטיימלפס בחלון התמונה.

לחץ על אוטומטי ליד סף העוצמה ולחץ על תצוגה מקדימה. כוון את סף העוצמה ולחץ על תצוגה מקדימה. חזור על תהליך ההתאמה והתצוגה המקדימה עד שכל הכרומטין כלול עם מינימום רעש, ולחץ על הבא.

אפשרו לזיהוי הסף הראשוני להשלים, ולוחצים על הבא. כוון ידנית את הסף עד שרק כרומטין נראה, ולחץ על הבא. כוון את תצוגת התמונה הפלואורסצנצית ולחץ על הבא.

בחר ב-LAP Tracker פשוט ולחץ על הבא. הגדר את מרחק הקישור המקסימלי ל-5 מיקרון, מרחק מקסימלי של סגירת פער ל-15 מיקרון, מרווח מסגרת מקסימלי לסגירת פער ל-1, ולחץ הבא. אפשר למעקב להשלים.

התבונן במסלולים המוצגים בחלון התמונה המקורי ולחץ על הבא. לחץ על כפתור הירוק פלוס בפינה השמאלית התחתונה כדי ליצור פילטר. בחר מספר מקומות במצב המסלול.

כוון את מחוון הסף. ודא שמצב המסנן מוגדר למעלה, ואז לחץ על הבא. לחץ על כפתור 'מסלולים' בתחתית דף אפשרויות התצוגה.

בחר ייצוא ל-CSV. התעלם מדף התכנון המובנה ולחץ על הבא. בדוק את תוצאות ניתוח TrackMate.

לחץ על Capture Overlay ואז בחר ב-Execute. שמור את הסרטון על ידי בחירת קובץ ולחיצה על Save As, ואז בחירת GIF. תאי שורש שטופלו במלח נראו במתח, ומוקדי המרכז נראו גדולים יותר מאשר בתנאי ביקורת.

מהירות הכרומטין הייתה גבוהה משמעותית בתנאי בקרה מאשר בתנאי טיפול בנתרן כלוריד של 100 מילימולר. פרוטוקול זה מאפשר מעקב וכימות של תנועת חלבונים מסומנים פלואורסצנטית לאורך זמן בשורשי האראבידופסיס. האתגר החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא קבלת תמונות באיכות גבוהה, שכן הלבנת תמונות וסטיית דגימות עלולות להקשות על המעקב.

מחקרים עתידיים אמורים לחקור את המנגנונים שמאחורי תנועת הכרומטין המופחתת שנצפתה במחקר שלנו.