הבינוי השרשה של מערכת Microinfusion לאספקה מתמשכת של סוכני Neuroactive.
17 במרץ 2008
כפי חקירה המוח הופך מתוחכם יותר, חקירה של מבנים מוחיים המעגלים דורש שיפור רמות של דיוק רזולוציה גבוהה יותר. פיתחנו שיטה להכנת ואת ההשתלה של מערכת עירוי כרונית בתוך המוח ניצול microcannula בורוסיליקט בקוטר טיפ של 50 מיקרון.
שלום, שמי מיילס קנינגהאם. יחד עם רייאן אוקונור וסידני וונג, נדגים את בנייתו של מערכת מיקרו-אינפוזיה להגשה רציפה של חומרים נוירו-אקטיביים. עבודה זו בוצעה במעבדה לשחזור עצבי בבית החולים מקליאן, בית הספר לרפואה של הרווארד.
אנו מבקשים להודות לקרן Sydney rbe ול-Narsad על תמיכתם הנדיבה. מצאנו שניתן להחדיר סוכנים נוירו-אקטיביים באופן מהימן לאתרים מוגדרים במוח באמצעות מיקרו-קנולה מזכוכית בורו-סיליקט שנמשכה, עם קוטר קצה הקטן פי 5 עד 10 מזו של קנולות הזרקה קונבנציונליות. בשקופית זו, אנו מציגים קנולת אינפוזיה נפוצה מפלדת אל חלודה לצד מיקרו-קנולה שייצרנו כאן במעבדה.
הפחתה זו בגודל קנולת ההחדרה מתרגמת להפחתה דרמטית בטראומה לאזור המוח הנחקר. שיטות קונבנציונליות רבות גורמות למעשה לנגע באזור העניין או בתוכו, דבר המעמיד את תוקפם של כל תוצאה בסימן שאלה. ניתן לראות כאן בלוח A את מידת ההרס של האזור המקומי שנגרמה על ידי קנולה בעלת קוטר של 0.32 מילימטר, בהשוואה לקנולה של 50 מיקרון בלוח B. תצלומי הגדלה נמוכה אלו הם של דגימות רטובות של חתכי Vibram ללא צביעה.
חתכים אלה נצבעו לאחר מכן ב-h and e וצולמו בהגדלה גבוהה יותר. כדי להמחיש עוד יותר את ההפחתה בנזק לרקמה באמצעות המיקרו-קנולה, רכיבי מערכת המיקרו-אינפוזיה הם משאבת an zet mini Osmo עם ווסת זרימה מפלדת אל חלון ששפתה הוסרה. שני עד שלושה סנטימטרים של צינור פוליאתילן, מיקרו-קנולה מסוג BOA silicate המיוצרת בהתאמה אישית, ותיל מוליך בכיול 28, וזוהי מערכת המיקרו-אינפוזיה המורכבת ומוכנה להשתלה.
במקרה זה נעשה שימוש במסיק (polar) אנכי סטנדרטי של פיפטה כדי ליצור מיקרו-קנולות עם המפרטים הרצויים. מסיקים אופקיים מתאימים אף הם. צינורית בורו-סיליקט ממוקמת ומקובעת על ידי שינוי הטמפרטורה של גוף החימום ושל מתיחת המוט.
ניתן לשחזר באופן מהימן מיקרו-קנולות עם קטריים ספציפיים וקישורי גבעול ארוכים ומסוגים. צינור הסיליקה של Bora מחומם ומופעל לחץ עדין כדי להקטין את מידת הכיפוף הרצויה בצינור. כיפוף זה מבוצע במרחק מהקצה של המיקרו-קנולה המתאים לעומק יעד המוח הרלוונטי, תוך מתן מרווח מעל הגולגולת.
האורך הסופי של צינור הקצה של מיקרו-קנולה זו, בכיפוף, הוא כ-9 עד 10 מילימטרים. ככל הנראה לא שבע רצון מהתוצאה, רייאן מחדיר מחדש את המיקרו-קנולה כדי לבצע כיוון עדין ולדייק את זווית הכיפוף שם.
התוצאה טובה בהרבה בעת שימוש בעיפרון יהלום. סידני מדגימה שיטה לחיתוך צינור הסיליקת בורון בערך חמישה מילימטרים פרוקסימלית לכיפוף, תוך כדי החזקה יציבה של הצינור על משטח קשיח כאשר החלק הדיסטלי של המיקרו-קנולה חופשי להשקיע מעבר לקצה המשטח. היא חורצת את הצינור היקפית.
לאחר מכן, על ידי הפעלת לחץ עדין, היא שוברת את הפיתול בצורה נקייה בממשק החרוץ. ניתן לצבוע את הקצה השקוף והדק של הקניולה בדיו קבוע כדי לסייע בוויזואליזציה. במהלך הניתוח תחת הגדלה, קצה המיקרו-קניולה נגזר באמצעות מספרי מיקרו-דיסקציה לקוטר הרצוי.
ניתן לאשר את קוטר הקצה באמצעות עדשה לעין או מיקרוסקופ. חוטי יישור רדיאליים מוכנים מחוט פלדה אל-חלודה במידה 28, הנחתך לאורכים של כ-3 סנטימטרים. לאחר מכן, משתמשים בפינצטה כדי ליצור וו קטן בקצה כל חוט, בקוטר של כ-2 מילימטרים.
חוטי היישור מונחים בצלחת פטרי יחד עם קטעי צינור פוליאתילן באורך של שניים עד שלושה סנטימטרים בתוך המיקרו-קנולות. ניתן להרכיב את מערכת המיקרו-הזרקה באמצעות מכשירים הנפוצים ברוב המעבדות. פינצטות מיקרו, פינצטות רגילות, מספריים כירורגיים ותפסני עקירה (hemostats) מונחים על סמרטול כירורגי לצורך עיקור.
המכשירים, רכיבי מערכת המיקרו-אינפוזיה, וכן מספר דפי נייר אלומיניום מעוקרים באמצעות אוטוקלאב סטנדרטי. מודולטור הזרימה מוצא בזהירות מאריזתו ומונח בצלחת פטרי סטרילית. הוא מוחזק בבטחה בעזרת פליירים המוסטטיים, והאבזץ הפלסטי מוסר מצינור המודולטור העשוי פלדת אל חלד באמצעות מספריים.
גם את משאבת האוסמוזה המיניאטורית מוציאים מאריזתה ומניחים בצלחת פטרי סטרילית. את צינור הפלדה שאינה מחלידה מחדירים לתוך צינור הפוליאתילן בעומק של כשני עד שלושה מילימטרים, ואת השניים אוטמים יחד באמצעות אפוקסי המופעל על ידי אור. לעבודות עדינות אנו משתמשים ב-Lummi bond מהמעבדה הנוירולוגית שלי; אנו ממלאים מזרק של 1 CC ב-Lummi bond ומשתמשים במחט gauge 27 כקומי אפליקטור; תחת תאורה חזקה, ה-Lumon נרפא תוך שניות ספורות.
ממלאים את המשאבה האוסמוטית המזערית על ידי החזקתה במצב אנכי, והזרקה זהירה באמצעות מחט המילוי המסופקת על ידי היצרן. אנו ממליצים לעקוב אחר נפח הנוזל המוזרק למשאבה ו/או לשקול את המשאבה לפני ואחרי המילוי כדי להבטיח שהמשאבה מלאה לחלוטין ואינה פגומה. שימו לב כי איננו ממליצים להשתמש במשאבות שוב.
לאחר מכן, מוכנסים את המודולטור המלא עם צינור הפוליאתילן המחובר אליו לתוך המשאבה האוסמוטית המיניאטורית. נוזל בתוך המשאבה יידחף אל תוך צינור הפוליאתילן בעת הכנסת מודולטור הספוג. יש לרשום את המרחק הראשוני של צינור הפוליאתילן המולא בנוזל, ויש לצפות לעלייתו לאחר הפעלת המשאבה עם אינקובציה ותמיסת סליין סטרילית בטמפרטורה של 39 °C לאחר 12 שעות של אינקובציה.
המשאבה האוסמוטית המיניאטורית הפעילה מושקעת בתמיס saline סטרילית, המספקת סביבה חסרת אוויר לשלבים הסופיים של בניית מערכת המיקרו-אינפוזיה. מזרק המחובר לצינור פלסטיק בעובי קטן ומלא באותו תמיסה שנמצאת במשאבה משמש להוצאת האוויר מהחלק הריק של צינור הפוליאתילן. יש לוודא שהאוויר בתוך המיקרו-קנולה הוצא.
באופן דומה, ייתכן שיהיה צורך בהרחבה מסוימת של הקצה הדיסטלי של צינור הפוליאתילן באמצעות פינצטות מיקרו, ולאחר מכן מוכנס הקצה הפרוקסימלי של המיקרו-קניולה. כעת המערכת כולה נקייה מאוויר או מנפח מת, וניתן להוציאה מאמבט הסליין ולייבש אותה בעזרת גזה סטרילית. לאחר מכן ממיסים Luma bond כדי לקבע את המיקרו-קניולה לצינור הפוליאתילן. כדי להפחית את קצב הזרימה של המיני-משאבה האוסמוטית בכשליש, שופכים פאראפין חם סטרילי לצלה קטנה של פטרי ומטביעים בה לזמן קצר את החצי הפרוקסימלי של המיני-משאבה האוסמוטית.
ניגוב של עודפי פאראפין, והחזרת מערכת המיקרו-אינפוזיה לתוך תמיסת סליין סטרילית לאחסון עד לניתוח. רגע לפני ההשתלה הכירורגית, מחברים את תיל ההובלה לכיפוף של המיקרו-קנולה.
הציר האורכי של תיל המנחה מיושר עם חלק המיקרו-קנולה שייכנס לרקמת המוח ומקובע באמצעות לומון. במצב זה, ניתן להניח את מערכת המיקרו-אינפוזיה על זרוע המניפולטור של המכשיר הסטריאוטקסי.
חוט המדריך מקובע באמצעות תפס של זרוע מניפולטור, והמשאבה קשורה מלמעלה בלולאת תפר סטרילית. דבר זה יתמוך במשקל שלה ויאפשר את יישורו המדויק של המיקרו-קנולה בניצב לפני השטח של הגולגולת על ידי כיפוף זהיר של חוט המדריך בעזרת פינצטה; לאחר מכן ניתן להשתיל את מערכת המיקרו-אינפוזיה באמצעות הליך סטריאוטקסי סטנדרטי. צינור ה-boel מקובע לפני השטח של הגולגולת באמצעות דבק.
אנו משתמשים ב-den mat Jaron כדי לעצב פדסטל (pedestal) בעל פרופיל נמוך. לאחר מכן, נגזרו את שארית תיל ההובלה הבולטת מעל ההכנה כך שתהיה גלויה בקו אחד עם פני השטח של הפדסטל. באמצעות גלגל חיתוך המחובר למקדחה במהירות גבוהה, ניתן להניח את המשאבה האוסמוטית המיניאטורית באופן תת-עורי בין שכבות העור של בעל החיים.
השיטה הנוכחית מציעה מספר יתרונות לעומת טכניקות מסורתיות. ניתן לבנות אותה בהתאמה אישית כדי להתאים למין ולגיל של בעל החיים הניסויי. ניתן לעצב את צינורית הסיליקה כך שתתאים לפני השטח של גולגולת בעל החיים.
לפיכך, בזכות קיבוע מאובטח בפרופיל נמוך המבטל את הצורך בבסיס גולגולתי גדול, ניתן לסגור את הפצע הניתוחי בקלות מעל בסיס המיקרו-אינפוזיה המקוצר, ובכך להפחית את הסיכון לזיהום ואת אי-הנוחות של בעל החיים, תוך שדרישת שטח פנים קטן יותר לקיבוע המערכת לגולגולת. לפיכך, ניתן לבצע הליכים נוספים או עוקבים ללא הפרעה מבסיס גדול יותר. חשוב מכל, שיטה זו מפחיתה את הפולשנות והטראומה לסביבה המקומית של אתר האינפוזיה, ובכך ממזערת את אפקט הצופה.
אלו הם השינויים שהתצפית הפעילה תגרום לתופעה הנצפית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להכנה ולהשתלה של מערכת עירוי כרונית בתוך המוח. תוך שימוש במיקרו-קנולה מבורוסיליקט עם קוטר קצה של 50 microns, טכניקה זו מאפשרת דיוק משופר בהחדרת חומרים נוירו-אקטיביים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- הנדסת מוח
- נוירופרמקולוגיה
רקע
- התקדמויות במדעי המוח דורשות שיטות מדויקות לחקר מבנה המוח.
- מערכות הובלה מסורתיות עשויות להיות חסרות את הרזולוציה הנדרשת.
- מערכות מיקרו-הזרקה יכולות לשפר את הובלתם של חומרים נוירו-אקטיביים.
- מחקר שנערך בבית החולים McLean, בית הספר לרפואה של הרווארד.
מטרת המחקר
- להדגים את בנייתו של מערכת עירוי מיקרוסקופית.
- לאפשר הזרקה רציפה של חומרים נוירו-אקטיביים לאתרים ספציפיים במוח.
- לשפר את דיוק ההזרקה של חומרים נוירו-אקטיביים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור של מיקרוקנולה מזכוכית בורוסיליקט.
- השוואה בין המיקרוקנולה לבין קנולות עירוי קונבנציונליות מפלדת אל חלודה.
- טכניקות השתלה כרונית להגשה ממושכת.
- תמיכה מבית היסוד Sydney rbe ומנרסד.
תוצאות עיקריות
- למיקרו-קניולות יש קוטר קצה הקטן פי 5 עד 10 מקניולות קונבנציונליות.
- הוכח כי הן מאפשרות הובלה אמינה של חומרים נוירו-אקטיביים לאתרים מוגדרים במוח.
- דיוק משופר במתן חומרים נוירו-אקטיביים.
- פוטנציאל לשיפור התוצאות במחקרים בתחום מדעי המוח.
מסקנות
- מערכת המיקרו-אינפוזיה שפותחה מייצגת התקדמות משמעותית במתודולוגיות של מדעי העצב.
- מערכות הובלה משופרות יכולות לסייע להשגת תוצאות מחקר מדויקות יותר.
- יישומים עתידיים עשויים להרחיב את השימוש במערכות מיקרו-אינפוזיה במגוון מחקרים במדעי העצב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה עבור מנהלים
החדרה מדויקת של חומרים נוירו-אקטיביים לאתרים ספציפיים במוח היא קריטית לתיקוף מטרות (target validation) ולהסרת סיכונים מכניסטיים בתהליך גילוי תרופות למדעי העצבים. מערכת מיקרו-אינפוזיה זו מפחיתה את הפולשנות ואת הטראומה לרקמה, ובכך משפרת את מהימנות הנתונים ואת הביטחון בתוצאות התרגומיות במודלים פרה-קליניים. העיצוב הניתן להתאמה אישית והפרופיל הנמוך תומכים בשימוש רחב על פני מינים שונים ומגוון עיצובי מחקר, ובכך מייעלים את תהליך מיון הפורטפוליו.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות עם השפעה מינימלית של הצופה הנובעת מטראומה כירורגית.
- ערך תפעולי: תומך בהגשה הדירה של תרכובות לצורך תיקוף של מעורבות המטרה in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספקת פלטפורמה סטנדרטית להגשה ממושכת של חומרים פעילים במחקרי תגובה למספר (dose-response).
- ערך תפעולי: מקלה על מוכנות הבדיקה באמצעות ייצור והשתלה עקביים של מיקרוקנולה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם למערכות רלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות להגשה כרונית במודלים מדויקים מבחינה אנטומית.
- ערך תפעולי: מפחית שונות הנובעת מדלקות ומגורמים מבלבלים של נגעים, ובכך משפר את הניבוי הפרה-קליני.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
השיטה משתלבת בביולוגיה של הגילוי באמצעות בדיקת השערות, סריקה באמצעות הובלה כמותית, ומחקר תרגומי על ידי תמיכה ברציפות טרום-קלינית תוך הפחתת רעש ביולוגי.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת תיקוף מדויק של מטרות על ידי מזעור נגעים מבלבלים באזורי מוח רלוונטיים.
- סריקה: מספקת חומרים עם הדירות גבוהה, התומכת בתוצאות אמינות של סריקת תרכובות.
- אנליזה: מייצרת חשיפה כמותית של חומרים נוירו-אקטיביים, המסייעת בניתוח השוואתי של מצבים.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות לתיקוף פרה-קליני על ידי הפחתת גורמים כירורגיים מבלבלים המסיחים אותות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת הניתנת לשימוש חוזר להזרקה כרונית במגוון פרויקטים של נוירו-פרמקולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות הפחתת עמימות מכנית הנובעת מטראומה כירורגית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות ייצור מותאם אישית של מיקרו-קניולות.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי הגברת תוקף הנתונים במחקרי תיקוף מטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון באמצעות שיפור יחס האות לרעש בשלב הפרה-קליני.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במשיכת מיקרו-פיפטות מזכוכית ועיצובן באמצעות חום.
- דורש גישה למיקרו-פורג' (microforge), למכשור סטריאוטקסי ולטכניקות עבודה אספטיות.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור מימדי הקנולות ופרוטוקולי ההשתלה.
- כולל שיקולי התאמה למבני גולגולת ועומקי מטרה משתנים בין מינים שונים.
- מוגבל על ידי שלבי ייצור ידניים שעלולים להשפיע על הספיק (throughput) ללא הכשרה מודרכת באמצעות וידאו.
