Name: עקרונות אתר ספציפיות recombinase (SSR) טכנולוגיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-29T12:11:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: למדו את מנגנון ה-Cre/lox לשילוב גנים ספציפי באתרים. טכנולוגיית ה-SSR מאפשרת מוטגנזה מותנית ומהווה יתרון על פני שיטות נוקאאוט מסורתיות במחקר גנטי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עקרונות אתר ספציפיות recombinase (ssr) טכנולוגיה

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

אתר ספציפי recombinase (SSR) הטכנולוגיה מאפשרת מניפולציה של מבנה הגן כדי לחקור את תפקוד הגן הפך לכלי אינטגרלי של הביולוגיה המולקולרית. אתר ספציפי recombinases הם חלבונים אשר נקלטות על ידי רצפי DNA יעד מובחנים. המערכת Cre / לקס תוארה לראשונה בשנות ה 1980 של ב bacteriophages. Cre recombinase הוא סוג אני topoisomerase המזרז אתר ספציפי רקומבינציה של דנ&quot;א בין שני loxP (מוקד P1-X ומעלה) באתרים. מערכת ה Cre / לקס אינו דורש שום cofactors. רצפים LoxP מכילים אתרי קישור נפרדים עבור recombinases Cre המקיפים רצף הליבה כיוונית בה רקומבינציה וגם סידור מתרחש. כאשר התאים מכילים אתרי loxP ומבטאים את recombinase Cre, אירוע רקומבינציה מתרחשת. פעמיים גדילי דנ&quot;א נחתך בשני אתרים loxP ידי recombinase Cre, מחדש, ligated (&quot;מספריים ודבק&quot;). מוצרים של האירוע רקומבינציה תלוי בכיוון היחסי של רצפים סימטרית. טכנולוגיית SSR משמש לעתים קרובות ככלי לחקור את תפקוד הגן. הנה הגן של עניין הוא מוקף עם Cre היעד אתרי loxP (&quot;floxed&quot;). חיות הן חצו אז עם חיות המבטא את recombinase Cre בשליטת היזם רקמות ספציפיות. ברקמות המבטאים את recombinase Cre הוא נקשר רצפים היעד excises הגן floxed. המחיקה גן מבוקרת מאפשרת חקירה של הפונקציה גנים ברקמות ספציפיות בנקודות זמן שונות. ניתוח של תפקוד הגן העסקת טכנולוגיית SSR --- mutagenesis מותנה - יש יתרונות משמעותיים על פני דפיקה-outs המסורתי שבו המחיקה הגן לעתים קרובות קטלני.

הופעתו של אתר ספציפי טכנולוגיה recombinase (SSR) ומערכת Cre / לקס הובילה להתקדמות רבים בתחום הביולוגיה המולקולרית, וכן הוכיחה את עצמה ככלי רב ערך להערכת תפקוד גן חיות טרנסגניות. בראיון זה מתאר את מנגנון רקומבינציה אתר ספציפי על ידי Cyclization recombinase (Cre) וכיצד להשתמש אנזים זה הוביל לפיתוח של mutagenesis מותנה, אשר יש יתרונות משמעותיים על פני המסורתיים לדפוק את אסטרטגיות.

עקרונות אתר ספציפיות recombinase (SSR) טכנולוגיה

טכנולוגיית רקומבינזה ספציפית לאתר (SSR) מאפשרת מניפולציה של מבנה הגן כדי לחקור את תפקוד הגן, והפכה לכלי בלתי נפרד של ביולוגיה מולקולרית...

שלום, שמי הוא פרנק בוקולץ. אני מוביל קבורה כאן במכון Max PL לביולוגיה מולקולרית של התא וגנטיקה. ועבודתנו מתוחזקת.עבודתנו מורכבת משני היבטים. האחד עוסק בסריקת RNA I, והשני עוסק בפיתוח רקומבינאזה ספציפית לאתר עבור הנדסת גנום מתקדמת.הרקע שלי הוא כביולוג, ביולוג מולקולרי, ולמדתי ביולוגיה. לאחר מכן המשכתי לדוקטורט במעבדות הביולוגיה המולקולרית האירופיות (EMBL) בהיידלברג, ולאחר מכן ביצעתי פוסט-דוקטורט בסן פרנסיסקו ב-UCSF עם מייק בישוף, שם עסקתי במודלים של בעלי חיים ללוקמיה. מכון מקס פלאנק כאן בדרסדן מנסה לשלב, נניח, לפחות שני היבטים שונים, שהם ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של התא, בתוך הניסיון – ובסיסית, אני חושב שניתן לומר שהנושא המרכזי שלהם הוא לנסות להבין כיצד תאים יוצרים רקמות.זוהי למעשה המטרה הכללית של המכון כאן ב-Ston. אנו עובדים על שני תחומים בעיקר. תחום אחד עוסק בביצוע סריקות RNAi, במטרה לזהות תפקודיים חדשים של גנים שלא אופיינו בעבר בתהליכים ביולוגיים.הנושא השני עוסק בהנדסה גנומית במטרה לפתח טכנולוגיות המאפשרות הנדסה מתוחכמת של גנומים באמצעות רקומבינז ספציפי לאתר. למרות שהרקומבינז הספציפי לאתר התגלה, הייתי אומר, בשנות השמונים – למשל, רקומבינז ה-cre שאנו עובדים איתו התגלה בתחילת השמונים. זהו למעשה חלבון של פאג חיידקי. כלומר, הוא מגיע במקור מפאג חיידקי, שזה בעצם וירוס המדביק חיידקים.אם כן, זה רחוק מאוד ממה שנעשה כיום, אך הוכר במהירות שאנזימים אלו יכולים למלא פונקציות מעניינות מאוד שניתן להשתמש בהן גם באורגניזמים אחרים. רקומבינזים ספציפיים לאתר (site-specific Recombinases) הם חלבונים הנקשרים ל-DNA; הם נקשרים באופן ספציפי לרצף מסוים של DNA, וכאשר הם נקשרים לרצפי מטרה אלו, הם מסוגלים לחתוך את ה-DNA ולאחר מכן גם לסדר מחדש את האתרים, כך שהם מבצעים ביסודו של דבר את תהליך הליגציה. ושוב, ניתן לסדר מחדש רצפי DNA באמצעות רקומבינציה ספציפית לאתר זו, בדומה למספריים ודבק, כך שניתן לחבר רצפי DNA באופן שבו לא היו מחוברי קודם לכן.אם כן, רקומיבינזות ספציפיות לאתר, כפי שציינתי, התגלו במקור בחיידקים או בפאגים של חיידקים, ולאחר מכן נבדק אם הן פועלות גם באורגניזמים אחרים. באופן מעניין, הן ביצעו את תפקידן גם באורגניזמים אחרים.לכן, אם קיים באורגניזם אתר מטרה לרקומבינאזה ספציפית לאתר, אשר הנדסתם לתוכו, למשל, אזי אנזימים אלו ימלאו את תפקידם. שימוש בולט מאוד ברקומבינאזות ספציפיות לאתר הוא במיוחד באלו שאינן זקוקות לקופקטורים, כגון רקומבינאזת flip או רקומבינאזת cre, ששימשה אותנו כנקודת התחלה לעבודה עליה אנו מדברים כאן היום. הן פועלות ללא קופקטורים.ואם תבטאו אותם, למשל, בבעל חיים, או בתאים של בעל חיים, הם יוכלו למצוא את הרצפים שהם מזהים באורגניזם זה, ואז ביסודו של דבר לגזור ולהדביק שם, ולהסיר רצפים מסוימים. לכן, מה שנעשה, או היכן שאנזים זה שימש בהצלחה, הוא במה שנקרא מוטגנזה מותנית בעכברים, למשל. נניח שיש לכם גן שאתם יודעים שהוא גן מעניין, ואתם רוצים לדעת מהי הפונקציה של גן זה.ניסוי בולט מאוד הוא יצירת מה שנקרא עכבר נוק-אאוט (knockout mouse). עבור אלו שראו לאחרונה, טכנולוגיה זו זיכתה השנה למעשה בפרס נובל, והיא משמשת לביצוע מחיקה של גן בעכבר. עם זאת, לעיתים ניתן לגלות כי כאשר מבצעים נוק-אאוט לגן בבעל חיים, הגן הוא גן חיוני והעכבר ימות בשלב מוקדם מאוד של העוברגנזה.כעת, נתון זה מעיד על כך שהגן שלך הוא חשוב מאוד, אך הוא אינו מסביר באמת מהי התפקוד שלו. לכן, דרך נפוצה מאוד כיום לגלות זאת היא לבצע מה שנקרא knockout מותנה. הפעולה כוללת הכלאת אתרי מטרה עבור רקומבינזים ספציפיים לאתרים אלו משני צדי הגן הנחקר.וזה אומר שבשפני עכברים אלה, הגן יבטא כפי שקורה בעכברי פרא (wild type). אך כעת, אם תבצעו הכלאה של עכברים אלו עם עכבר המבטא את ה-CRE recombinase, למשל תחת פרומוטור ספציפי לרקמה, תוכלו למחוק את הגן המדובר רק בתאים ספציפיים שתוכלו להגדיר מראש בהתבסס על המקום שבו הרקומבינאז מבוטא. מניסויים אלו אנו יודעים גם ששילובי רקומבינציה אלו יכולים להיות יעילים מאוד במחיקת רצפים מאורגניזמים שלמים.וזה היה תנאי מוקדם לרעיון שלנו לנסות ולפתח רקומבינאז הגוזר באתר שהגדרנו מראש, מה שהיווה עד כה אחת המגבלות העיקריות בפיתוח נוסף של רקומבינאז ספציפי לאתר; היה צורך להנדס את אתר זיהוי המטרה אל תוך הגנום של תא של אורגניזם שרצית להשתמש בו. לכן חשבנו, האם נוכל לפרוץ את המחסום הזה?בבסיס העניין עומדת אבולוציה מולקולרית. נכון לעכשיו, למיטב ידיעתי, רקומבינזים ספציפיים לאתר אינם משמשים לטיפול. זאת, כפי שציינתי, בעיקר מכיוון שבני אדם אין אתר מטרה שיזוהה על ידי אף אחד מהרקומבינזים הקיימים בטבע.לכן יש לשנות אותם תחילה כדי שניתן יהיה להשתמש בהם במסגרת טיפולית. נכון לעכשיו, אנו נמצאים רק בראשית הדרך בבדיקת האפשרות שדבר זה יהיה אפשרי כלל. הזמן יגלה אם נהיה מסוגלים לפתח את האנזימים הללו לשימוש טיפולי, והזמן יגלה אם הדבר אפשרי או לא.

principles-of-site-specific-recombinase-ssr-technology

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

נוכחי HIV-1 אסטרטגיות לפעול כדי לדכא את מחזור החיים של נגיפי אבל לא יעיל למיגור זיהום. כאן, אנו מראים כי recombinase מהונדסים יכולים הבלו ביעילות משולב DNA HIV-1 proviral מן הגנום של תאים נגועים.

ראיון: HIV-1-DNA כריתה Proviral שימוש recombinase התפתח

חלבון שמרי המיטוכונדריה nucleoid, Mgm101, הוא חלבון רקומבינציה Rad52 מסוג שיוצר טבעות oligomeric גדולות. פרוטוקול מתואר להכין Mgm101 רקומביננטי המסיס באמצעות חלבון מחייב מלטוז (MBP) תיוג אסטרטגיה בשילוב עם חילופי קטיון וכרומטוגרפיה הדרת גודל.

הכנה של חלבון רקומבינציה Mgm101 ידי אסטרטגיה תיוג מבוססת MBP

ניתן להשתמש במתודולוגיות מיקוד גנים כדי ליצור עכברים טרנסגניים עם אללים נוק-אאוט, נוק-אין ומתויגים.  כאן, אנו מתארים שיטה משופרת של קומבינר מחדש ב-E. coli, שאנו מכנים 'תת-שיבוט פלוס הכנסה', שניתן להשתמש בה כדי ליצור וקטורים מכוונים לגנים מותאמים אישית במהירות.

Subcloning Plus ההכנסה (SPI) - Recombineering שיטה חדשה לבנייה המהירה של וקטורי גן המיקוד

המיני-וקטור של ה-DNA הסגור קוולנטית ליניארית (LCC) הוא וקטור העברת גנים לא ויראלי המציע יעילות טרנספקציה גבוהה ורלוונטי לכל יישום העברת DNA. מערכת הייצור פשוטה, מהירה וניתנת להרחבה in vivo. הפרוטוקול הבא מספק הוראות חזותיות שלב אחר שלב לייצור מיני-מחרוזות DNA.

הפקה של DNA פעמיים תקועים Ministrings

כאן אנו מדווחים על שיטת עריכת גן מהירה ויעילה מבוססת על RMCE שעבר על מקורות AAVS1 של תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) המשפרת על מערכות שתוארו לעיל. באמצעות טכניקה זו, קווי isogenic יכולים להיוצר במהירות ובאמינות ללימודים השוואתיים נכונים, הקלת מחקר בתיווך transgenesis עם hPSCs.

הדור מהיר ויעיל של תאי גזע פלוריפוטנטיים רקומביננטי אנושי ידי recombinase בתיווך המרת קלטת ב<em&gt; AAVS1</em&gt; לוקוס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לזיהוי רקומבינציה הומולוגית אירועים שהתרחשו במהלך בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג בדרום ו/או ה-PCR. שיטה זו היא כשניסחתי את הדור של nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן II גנטי החלפת העכבר מודלים בטכנולוגיה המסורתית עובריים מבוססי תאי גזע הומולוגי בתיווך רקומבינציה מיקוד.

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

ניתן לפתח את הגבלת הגבלות עם ספציפיות רצף חדש מאנזימים המספרים על רצף מנוון באופן חלקי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כי השתמשנו בהצלחה כדי לשנות את הספציפיות הרצף של האנזים NlaIV. מרכיבי המפתח של הפרוטוקול הם ממדר החוץ של התגובה שעתוק/תרגום ומבחר של משתנים עם משתני רצף חדש.

האבולוציה בבימויו של הגבלת מגבלות על הגבלה עם ספציפיות יותר מחמירות

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

כאן אנו מדווחים על דור של Tre recombinase דרך האבולוציה, בבימויו מולקולרית. Tre recombinase מזהה רצף מוגדר מראש היעד בתוך רצפי LTR provirus של HIV-1, וכתוצאה מכך כריתה לבין מיגור provirus מ תאים אנושיים נגועים. אמנם עדיין בחיתוליו, אבולוציה מולקולרית מכוונת תאפשר יצירה של אנזימים אישית שישמש כלי הניתוח המולקולרי ורפואה מולקולרית.

אבולוציה מולקולרית של recombinase Tre

לפני שתנסה ניתוח, מנתח חדש צריך הכשרה בטכניקות ניתוח מושגי יסוד. מאמר זה יציג שיקולים כירורגי בסיסי בדגש על מכרסמים.

עקרונות של ניתוח מכרסמים למנתח חדש

למדו את מנגנון ה-Cre/lox לשילוב גנים ספציפי באתרים. טכנולוגיית ה-SSR מאפשרת מוטגנזה מותנית ומהווה יתרון על פני שיטות נוקאאוט מסורתיות במחקר גנטי מתקדם.

עקרונות אתר ספציפיות recombinase (SSR) טכנולוגיה

גלה סרטונים נוספים