עקרונות אתר ספציפיות recombinase (SSR) טכנולוגיה
29 במאי 2008
הופעתו של אתר ספציפי טכנולוגיה recombinase (SSR) ומערכת Cre / לקס הובילה להתקדמות רבים בתחום הביולוגיה המולקולרית, וכן הוכיחה את עצמה ככלי רב ערך להערכת תפקוד גן חיות טרנסגניות. בראיון זה מתאר את מנגנון רקומבינציה אתר ספציפי על ידי Cyclization recombinase (Cre) וכיצד להשתמש אנזים זה הוביל לפיתוח של mutagenesis מותנה, אשר יש יתרונות משמעותיים על פני המסורתיים לדפוק את אסטרטגיות.
שלום, שמי הוא פרנק בוקולץ. אני מוביל קבורה כאן במכון Max PL לביולוגיה מולקולרית של התא וגנטיקה. ועבודתנו מתוחזקת.
עבודתנו מורכבת משני היבטים. האחד עוסק בסריקת RNA I, והשני עוסק בפיתוח רקומבינאזה ספציפית לאתר עבור הנדסת גנום מתקדמת.
הרקע שלי הוא כביולוג, ביולוג מולקולרי, ולמדתי ביולוגיה. לאחר מכן המשכתי לדוקטורט במעבדות הביולוגיה המולקולרית האירופיות (EMBL) בהיידלברג, ולאחר מכן ביצעתי פוסט-דוקטורט בסן פרנסיסקו ב-UCSF עם מייק בישוף, שם עסקתי במודלים של בעלי חיים ללוקמיה. מכון מקס פלאנק כאן בדרסדן מנסה לשלב, נניח, לפחות שני היבטים שונים, שהם ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של התא, בתוך הניסיון – ובסיסית, אני חושב שניתן לומר שהנושא המרכזי שלהם הוא לנסות להבין כיצד תאים יוצרים רקמות.
זוהי למעשה המטרה הכללית של המכון כאן ב-Ston. אנו עובדים על שני תחומים בעיקר. תחום אחד עוסק בביצוע סריקות RNAi, במטרה לזהות תפקודיים חדשים של גנים שלא אופיינו בעבר בתהליכים ביולוגיים.
הנושא השני עוסק בהנדסה גנומית במטרה לפתח טכנולוגיות המאפשרות הנדסה מתוחכמת של גנומים באמצעות רקומבינז ספציפי לאתר. למרות שהרקומבינז הספציפי לאתר התגלה, הייתי אומר, בשנות השמונים – למשל, רקומבינז ה-cre שאנו עובדים איתו התגלה בתחילת השמונים. זהו למעשה חלבון של פאג חיידקי. כלומר, הוא מגיע במקור מפאג חיידקי, שזה בעצם וירוס המדביק חיידקים.
אם כן, זה רחוק מאוד ממה שנעשה כיום, אך הוכר במהירות שאנזימים אלו יכולים למלא פונקציות מעניינות מאוד שניתן להשתמש בהן גם באורגניזמים אחרים. רקומבינזים ספציפיים לאתר (site-specific Recombinases) הם חלבונים הנקשרים ל-DNA; הם נקשרים באופן ספציפי לרצף מסוים של DNA, וכאשר הם נקשרים לרצפי מטרה אלו, הם מסוגלים לחתוך את ה-DNA ולאחר מכן גם לסדר מחדש את האתרים, כך שהם מבצעים ביסודו של דבר את תהליך הליגציה. ושוב, ניתן לסדר מחדש רצפי DNA באמצעות רקומבינציה ספציפית לאתר זו, בדומה למספריים ודבק, כך שניתן לחבר רצפי DNA באופן שבו לא היו מחוברי קודם לכן.
אם כן, רקומיבינזות ספציפיות לאתר, כפי שציינתי, התגלו במקור בחיידקים או בפאגים של חיידקים, ולאחר מכן נבדק אם הן פועלות גם באורגניזמים אחרים. באופן מעניין, הן ביצעו את תפקידן גם באורגניזמים אחרים.
לכן, אם קיים באורגניזם אתר מטרה לרקומבינאזה ספציפית לאתר, אשר הנדסתם לתוכו, למשל, אזי אנזימים אלו ימלאו את תפקידם. שימוש בולט מאוד ברקומבינאזות ספציפיות לאתר הוא במיוחד באלו שאינן זקוקות לקופקטורים, כגון רקומבינאזת flip או רקומבינאזת cre, ששימשה אותנו כנקודת התחלה לעבודה עליה אנו מדברים כאן היום. הן פועלות ללא קופקטורים.
ואם תבטאו אותם, למשל, בבעל חיים, או בתאים של בעל חיים, הם יוכלו למצוא את הרצפים שהם מזהים באורגניזם זה, ואז ביסודו של דבר לגזור ולהדביק שם, ולהסיר רצפים מסוימים. לכן, מה שנעשה, או היכן שאנזים זה שימש בהצלחה, הוא במה שנקרא מוטגנזה מותנית בעכברים, למשל. נניח שיש לכם גן שאתם יודעים שהוא גן מעניין, ואתם רוצים לדעת מהי הפונקציה של גן זה.
ניסוי בולט מאוד הוא יצירת מה שנקרא עכבר נוק-אאוט (knockout mouse). עבור אלו שראו לאחרונה, טכנולוגיה זו זיכתה השנה למעשה בפרס נובל, והיא משמשת לביצוע מחיקה של גן בעכבר. עם זאת, לעיתים ניתן לגלות כי כאשר מבצעים נוק-אאוט לגן בבעל חיים, הגן הוא גן חיוני והעכבר ימות בשלב מוקדם מאוד של העוברגנזה.
כעת, נתון זה מעיד על כך שהגן שלך הוא חשוב מאוד, אך הוא אינו מסביר באמת מהי התפקוד שלו. לכן, דרך נפוצה מאוד כיום לגלות זאת היא לבצע מה שנקרא knockout מותנה. הפעולה כוללת הכלאת אתרי מטרה עבור רקומבינזים ספציפיים לאתרים אלו משני צדי הגן הנחקר.
וזה אומר שבשפני עכברים אלה, הגן יבטא כפי שקורה בעכברי פרא (wild type). אך כעת, אם תבצעו הכלאה של עכברים אלו עם עכבר המבטא את ה-CRE recombinase, למשל תחת פרומוטור ספציפי לרקמה, תוכלו למחוק את הגן המדובר רק בתאים ספציפיים שתוכלו להגדיר מראש בהתבסס על המקום שבו הרקומבינאז מבוטא. מניסויים אלו אנו יודעים גם ששילובי רקומבינציה אלו יכולים להיות יעילים מאוד במחיקת רצפים מאורגניזמים שלמים.
וזה היה תנאי מוקדם לרעיון שלנו לנסות ולפתח רקומבינאז הגוזר באתר שהגדרנו מראש, מה שהיווה עד כה אחת המגבלות העיקריות בפיתוח נוסף של רקומבינאז ספציפי לאתר; היה צורך להנדס את אתר זיהוי המטרה אל תוך הגנום של תא של אורגניזם שרצית להשתמש בו. לכן חשבנו, האם נוכל לפרוץ את המחסום הזה?
בבסיס העניין עומדת אבולוציה מולקולרית. נכון לעכשיו, למיטב ידיעתי, רקומבינזים ספציפיים לאתר אינם משמשים לטיפול. זאת, כפי שציינתי, בעיקר מכיוון שבני אדם אין אתר מטרה שיזוהה על ידי אף אחד מהרקומבינזים הקיימים בטבע.
לכן יש לשנות אותם תחילה כדי שניתן יהיה להשתמש בהם במסגרת טיפולית. נכון לעכשיו, אנו נמצאים רק בראשית הדרך בבדיקת האפשרות שדבר זה יהיה אפשרי כלל. הזמן יגלה אם נהיה מסוגלים לפתח את האנזימים הללו לשימוש טיפולי, והזמן יגלה אם הדבר אפשרי או לא.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בהתפתחויות בביולוגיה מולקולרית שהביאה טכנולוגיית רקומבינזה ספציפית לאתר (SSR), ובמיוחד מערכת ה-Cre/lox. הוא מדגיש את מנגנון הרקומבינציה הספציפית לאתר על ידי רקומבינזת ציקליזציה (Cre) ואת תפקידה במוטגנזה מותנית, המציעה יתרונות משמעותיים על פני אסטרטגיות נוק-אאוט מסורתיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה מולקולרית
- גנטיקה
- הנדסת גנום
רקע
- טכנולוגיית רקומבינאזה ספציפית לאתר שינתה את מהותם של תהליכי הערכת תפקוד גנים.
- מערכת ה-Cre/lox היא כלי מרכזי במחקרי בעלי חיים טרנסגניים.
- מוטגנזה מותנית מאפשרת מניפולציה ממוקדת של גנים.
- לאסטרטגיות נוק-אאוט (knockout) מסורתיות יש מגבלות שביכולתה של טכנולוגיית SSR לתת להם מענה.
מטרת המחקר
- לחקור את המנגנון של רקומבינציה ספציפית לאתר (site-specific recombination).
- לדון ביתרונות של מוטגנזה מותנית.
- להדגיש את היישומים של טכנולוגיית SSR במחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ראיונות עם מומחים בתחום.
- דיון ביישומים של טכנולוגיית SSR.
- ניתוח של מנגנון מערכת Cre/lox.
- סקירה של התקדמויות בהנדסת גנום.
תוצאות עיקריות
- טכנולוגיית SSR הובילה להתקדמויות משמעותיות בביולוגיה מולקולרית.
- מערכת Cre/lox יעילה להערכת תפקוד גנים.
- מוטגנזה מותנית מציעה גמישות רבה יותר משיטות מסורתיות.
- המחקר ממשיך להתפתח עם פיתוחן של טכניקות SSR מתקדמות.
מסקנות
- טכנולוגיית SSR היא כלי בעל ערך למחקר גנטי.
- מוטגנזה מותנית שינתה את הגישות למניפולציה של גנים.
- סביר שבידי מחקרים עתידיים יתרחבו היישומים של טכנולוגיית SSR.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכנולוגיית רקומבינאזה ספציפית לאתר (SSR), המודגמת על ידי מערכת Cre/lox, מאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת ומותנית, ונותנת מענה ישיר לאתגר של תיקוף פונקציונלי של גנים במערכות ביולוגיות מורכבות. יכולת זו היא קריטית להפחתת סיכונים במטרות טיפוליות ולהבהרת תפקוד גנים ברקמות רלוונטיות למחלה, ובכך היא תומכת בהתקדמות בביטחון דרך שלבי הגילוי המוקדמים ונקודות התפנית הפרה-קליניות. מוטגנזה מותנית מונחית SSR משפרת את קבלת ההחלטות בניהול תיק המטרות על ידי כך שהיא מאפשרת חקירה של גנים באופן ספציפי לרקמה ולזמן, ללא סיכוני התמותה הכרוכים בביטויי knockout מסורתיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף תפקודי של גנים מועמדים ברקמות ספציפיות או בשלבי התפתחות שונים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות להסרה מבוקרת של גנים ובדיקת מסלולים ביולוגיים.
- מסייע בהגברת הביטחון החזוי בבחירת מטרה על ידי התגברות על מגבלות של קטלניות עוברית.
- משפר את תעדוף הפורטפוליו על ידי הבחנה בין תפקודי גנים חיוניים לבין תפקודים התלויים בהקשר.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מודלים גנטיים שעברו ולידציה לצורך סריקה פנוטיפית ופיתוח בדיקות בהמשך התהליך.
- מסטנדרט את הרקעים הגנטיים לקבלת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- מאפשר יצירה ניתנת להרחבה (scalable) של מודלים של נוק-אאוט מותנה לצורך סריקה של פלטפורמות.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות במערכות מוגדרות גנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם מניפולציה גנטית עם רקמות הרלוונטיות למחלה עבור מחקרי ביומרקרים תרגומיים.
- שומר על רצף משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני על ידי אפשור מוטגנזה מותנית.
- מפחית סיכון ביולוגי במודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לשליטה גנטית מדויקת בזמן ובמרחב.
- משפר את הערך הניבוי לבדיקת השערות טיפוליות in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
טכנולוגיית SSR משלבת שלבים החל מגילוי ראשוני, דרך זיהוי מועמדים (lead identification) ועד למחקר פרה-קליני, ובכך מספקת פלטפורמה לשימוש חוזר למחקרי תפקודי גנים מונחי-השערה.
- ביולוגיית גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות כריתה מותנית של גנים.
- סריקה: מספקת מודלים שחזירים ומוגדרים גנטית לפיתוח מערכי בדיקה חסונים.
- אנליזה: מאפשרת השוואה כמותית של פנוטיפים על רקעים גנטים מבוקרים.
- מחקר תרגומי: מסייעת בהתאמת מודלים גנטיים לרקמות ולסמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מספקת גישה מודולרית וניתנת להרחבה לשימוש חוזר במגוון מטרות ואינדיקציות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה למניפולציה גנטית למען שחזור ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) וקידום פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון על ידי הבהרת תפקוד הגן בהקשרים ביולוגיים רלוונטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה מולקולרית ובהנדסת מודלים של בעלי חיים.
- דורש גישה למערכות רקומבינז מתוקפות ולתשתיות להנדסה גנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדאית בין צוותים להבטחת שחזור של יצירת המודלים.
- יש לשקול את ההתאמה של אתרי המטרה לרקומבינז באורגניזמים או ברקמות שונות.
- מגבלות נוכחיות כוללות את הצורך באתרי מטרה מהונדסים ומחסור ביישום טיפולי ישיר.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:33
Personal Background / Training
1:02
Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, Dresden
2:00
Site-specific recombinase technology: origins
3:23
Site-specific recombinase technology: conditional gene knockout
6:24
Site-specific recombinase technology towars therapy
