Name: הדמיה של תאים חיים ומעקב תאים בודדים למעקב אחר דינמיקת שיבוטים ומעברי גורל באורגנידים במעי אדם ועכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: למד הדמיה של תאים חיים ומעקב תאים בודדים באורגנידים במעי אדם ועכברים. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר החלטות גורל תאיות ודינמיקת שיבוטים ברזולוציית תא בודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
	<li>Barker N, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 2007;449(7165):1003-7.</li>
	<li>Clevers H. Shifting paradigms in tissue stem cell biology: insights from the intestine. Cell. 2026;189(3):706-24.</li>
	<li>Betjes MA, Kok RNU, Tans SJ, van Zon JS. Cell tracking with accurate error prediction. Nat Methods. 2025;22(11):2400-10.</li>
	<li>Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009;459(7244):262-5.</li>
	<li>Sato T, et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett&#39;s epithelium. Gastroenterology. 2011;141(5):1762-72.</li>
	<li>He GW, et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of Paneth cell formation. Cell Stem Cell. 2022;29(9):1333-45.e6.</li>
	<li>Artegiani B, et al. Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR-Cas9 precision genome editing. Nat Cell Biol. 2020;22(3):321-31.</li>
	<li>Celotti M, et al. Protocol to create isogenic disease models from adult stem cell-derived organoids using next-generation CRISPR tools. STAR Protoc. 2024;5(3):103189.</li>
	<li>Krueger D, et al. Epithelial tension controls intestinal cell extrusion. Science. 2025;389(6764).</li>
	<li>Buissant des Amorie JR, et al. Intestinal tuft cell subtypes represent successive stages of maturation driven by crypt-villus signaling gradients. Nat Commun. 2025;16(1):6765.</li>
	<li>Huang L, et al. Tuft cells act as regenerative stem cells in the human intestine. Nature. 2024;634(8035):929-35.</li>
	<li>Wang D, et al. Interferon-responsive intestinal BEST4/CA7+ cells are targets of bacterial diarrheal toxins. Cell Stem Cell. 2025;32(4):598-612.e5.</li>
	<li>Jain A, et al. Morphodynamics of human early brain organoid development. Nature. 2025;644(8078):1010-9.</li>
	<li>Krotenberg Garcia A, van Rheenen J, Suijkerbuijk SJE. Generation of mixed murine organoids to model cellular interactions. STAR Protoc. 2021;2(4):100997.</li>
	<li>Krotenberg Garcia A, et al. Active elimination of intestinal cells drives oncogenic growth in organoids. Cell Rep. 2021;36(1):109307.</li>
	<li>Serra D, et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 2019;569(7754):66-72.</li>
	<li>de Medeiros G, et al. Multiscale light-sheet organoid imaging framework. Nat Commun. 2022;13(1):4864.</li>
	<li>Huelsz-Prince G, et al. Mother cells control daughter cell proliferation in intestinal organoids to minimize proliferation fluctuations. eLife. 2022;11.</li>
	<li>Zheng X, et al. Organoid cell fate dynamics in space and time. Sci Adv. 2023;9(33).</li>
	<li>Okkelman IA, Foley T, Papkovsky DB, Dmitriev RI. Live cell imaging of mouse intestinal organoids reveals heterogeneity in their oxygenation. Biomaterials. 2017;146:86-96.</li>
	<li>Gros A, et al. A quantitative pipeline for whole-mount deep imaging and analysis of multi-layered organoids across scales. eLife. 2026;14.</li>
	<li>Nagarajan S, Naganathan SR. Pushing the limits of automated cell tracking. Nat Methods. 2025;22(11):2236-8.</li>
	<li>Kok RNU, et al. OrganoidTracker: efficient cell tracking using machine learning and manual error correction. PLoS One. 2020;15(10).</li>
	<li>Martinez-Silgado A, et al. Differentiation and CRISPR-Cas9-mediated genetic engineering of human intestinal organoids. STAR Protoc. 2022;3(3):101639.</li>
	<li>van der Linden FH, Okkelman IA, Ioannou M, Dmitriev RI. A turquoise fluorescence lifetime-based biosensor for quantitative imaging of intracellular calcium. Nat Commun. 2021;12(1):7159.</li>
	<li>Okkelman IA, Foley T, Papkovsky DB, Dmitriev RI. Extracellular Ca2+-sensing fluorescent protein biosensor based on a collagen-binding domain. ACS Appl Bio Mater. 2020;3(8):5310-21.</li>
	<li>Nguyen NTB, et al. Lactate controls cancer stemness and plasticity through epigenetic regulation. Cell Metab. 2025;37(4):903-19.e10.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104-500</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-05</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (40um)&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542140</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>עם בקרת אקלים לטמפרטורה ו-CO2</td></tr><tr><td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME)</td><td>R&amp;D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>Glass bottom plates</td><td>CellVis</td><td>P24-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NEPA electroporation system</td><td>NEPAGENE</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>NucSpot Live</td><td></td><td></td><td>צבע גרעין חי אדום רחוק</td></tr><tr><td>Noggin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>N002</td><td></td></tr><tr><td>OrganoidTracker</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://organoidtracker.org/</td></tr><tr><td>p2T-CAG-mT2TP</td><td>homemade</td><td></td><td>פרוטוקול ליצירת הפלסמיד DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-iRFP-IRES-PuroR</td><td>homemade</td><td></td><td>פרוטוקול ליצירת הפלסמיד DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-mCherry-IRES-BlastR&nbsp;</td><td>homemade</td><td></td><td>פרוטוקול ליצירת הפלסמיד DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-22</td><td>Peprotech</td><td>200-22</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human R-spondin 1</td><td>Thermo Fisher</td><td>120-38-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin</td><td>Thermo Fisher</td><td>250-38-100UG</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>R001</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td></td><td></td><td>צבע DNA חי אדום רחוק</td></tr><tr><td>SB202190 (p38 inhibitor)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>Suspension plate for organoid culture</td><td>Greiner</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Wnt surrogate</td><td>U-Protein Express</td><td>&nbsp;custom order</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3A conditioned medium</td><td>homemade</td><td></td><td>ייצור מדיום מותנה של Wnt3A ניתן למצוא כאן:&nbsp; https://doi.org/10.1002/cpim.106</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה של תאים חיים ומעקב תאים בודדים למעקב אחר דינמיקת שיבוטים ומעברי גורל באורגנידים במעי אדם ועכברים

Live-Cell Imaging and Single-Cell Tracking to Monitor Clonal Dynamics and Fate Transitions in Human and Murine Intestinal Organoids

The intestinal epithelium undergoes rapid self-renewal through stem cell division, cell differentiation, and migration. Understanding how individual cells ...

המחקר שלנו מתמקד בבדיקה של האופן שבו תאים בודדים מקבלים החלטות לגבי גורלם ומתאמים את התנהגותם בתוך האפיטליום המעי שמתחדש מעצמו. מיקרוסקופיה של אור אינה יכולה להבחין בסמן נפוץ, לדוגמה, מדף הממברנה של תא או השלד התאי, ולייחס אותו באופן מדויק לתא אחד או לשכניו. אך אורגנואידים פסיפסים יכולים למעשה לסייע במגבלה זו.ראשית, השג את הריאגנטים הדרושים ואת קווי האורגנואידים המעיים עם רפורטר פלואורסצנטי מאושרים של עכברים ובני אדם. העבר את שני קווי האורגנואידים למצע מותנה ב-Wnt שלושה ימים לפני יצירת האורגנואידים הפסיפסתיים (mosaic organoids) כדי לעודד התרחבות של תאי גזע ולמקסם את חיוניות התאים במהלך הדיסוציאציה. הכן 5% BME ב-DMEM. צפה כל באער של פלטת 48 באערים ב-20 microliters של BME המוכן כדי לספק שכבה דביקה דקה להיצמדות תאים, ולאחר מכן הדגר ב-37 degrees Celsius למשך שעה אחת. לאחר מכן, המס את ה-BME על ידי הוספת מצע בסיס קר מהקרח. אסוף אורגנואידים מכל קו בנפרד על ידי סנטריפוגציה ב-300 g למשך חמש דקות ב-4 degrees Celsius. בצע דיסוציאציה של האורגנואידים לתאים בודדים על ידי הדגרתם בתמיסה אנזימטית לניתוק תאים למשך 5 עד שבע דקות במקלח מים ב-37 degrees Celsius. באמצעות פ pipette P1000, בצע פיפטינג חוזר של התרחיף כדי לסייע בדיסוציאציה מכנית. עקוב אחר הדיסוציאציה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. עצור את התגובה על ידי הוספת עודף של מצע בסיס קר מהקרח כאשר נראים בעיקר תאים בודדים או פרגמנטים קטנים של אורגנואידים המכילים 2 עד 10 תאים. לאחר מכן, השק את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-300 g למשך חמש דקות ב-4 degrees Celsius. הער את חיוניות התאים וספור את התאים החיוניים באמצעות שיטת הדחה של trypan blue. שלב את שתי אוכלוסיות התאים ביחס הרצוי כדי להגיע לסך של 300,000 תאים ב-500 microliters של מצע מותנה ב-Wnt, מועשר ב-10 micromolar Y-27632 dihydrochloride עבור אורגנואידים פסיפסתיים של עכברים, או מצע הרחבה אנושי עבור תרביות של אורגנואידים פסיפסתיים אנושיים. ערבב היטב על ידי פיפטינג עדין. לאחר מכן, הסר את מצע הציפוי מפלטות 48 הבאערים וזרע את תרחיף התאים לתוך הבאערים המצופים. סנטריפוג את הפלטה ב-200 g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, והדגר ב-37 degrees Celsius. הכן טיפ של פ pipette P200 על ידי כיפופו. לאחר 24 שעות, נתק מכנית את שכבת התאים על ידי גירוד עם טיפ הפיפט המכופף, ולאחר מכן שטוף היטב עם מצע בסיס קר מהקרח. אסוף את האגרגטים שנותקו על ידי סנטריפוגציה ב-300 g למשך שלוש דקות ב-4 degrees Celsius, ללא גזירה מכנית נוספת. השהה מחדש את האגרגטים ב-BME ופזר אותם לנשאי דגימות התואמים לדימוי. תרבל את האגרגטים שנזרעו במצע ENR עבור עכברים ובמצע הרחבה אנושי עבור אורגנואידים פסיפסתיים אנושיים.השתמשו בתאי דימוי בעירת זכוכית כדי להבטיח תאימות אופטית עם עדשות קונפוקאליות בעלות מפתח מספרי גבוה. פזרו את תרחיף האורגנואידים-BME ככיפה דקה קרוב למרכז תחתית הזכוכית. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 4 degrees Celsius למשך 5 עד 10 דקות כדי לאפשר לאורגנואידים לשקוע לעבר תחתית הזכוכית בעזרת כוח הכבידה. העבירו את הפלטה לטמפרטורה של 37 degrees Celsius והמתינו 20 עד 30 דקות עד שה-BME יתגבש. הוסיפו 500 microliters של מצע גידול שחומם מראש לכל באר. אפשרו לאורגנואידים להתאושש ולבסס את המורפולוגיה שלהם למשך לפחות 24 שעות לפני תחילת הדימוי החי. רכשו תמונות time-lapse לטווח ארוך ובצעו מעקב של תא בודד ושחזור שושלת לצורך ניתוחים המשכיים.היווצרות פסיפס מוצלחית אופיינה בהתפלגות מסוג "מלח ופלפל" או בגבולות מוגדרים בין שתי האוכלוסיות, בהתאם לדרגת הדיסוציאציה שנעשה בה שימוש. דיסוציאציה יסודית של תאים בודדים הניבה פסיפסים מסוג מלח ופלפל, בעוד שפרגמנטציה עדינה שימרה צבירים קלונליים קטנים. כאשר תאים שכנים שאינם מסומנים מקיפים תא בודד המבטא רב-מרקאס (reporter) רלוונטי, ניתן לייחס באופן חד-משמעי את הדינמיקה של השלד התאי שלו במהלך נדידה, חלוקה או אקסטרוזיה לאותו תא. רב-מרקאסים גרעיניים של H2B סייעו בזיהוי של קונסטלציות תאים מלמדות בתוך הפסיפס, ומדידות לרמת התא, כגון קצב חלוקה לאורך החיים ודינמיקה של עוצמת הרב-מרקאס, הופקו מנתוני המעקב. תאי גובלט הפעילו ושמרו על ביטוי גבוה של MUC2-mNeonGreen לאורך תקופת הדימוג, בעוד שתאי פנת (Paneth cells) הראו הפעלה ראשונית של MUC2-mNeonGreen, ולאחריה ירידה הדרגתית באות והפעלה מאוחרת יותר של DEFA5-dsRed. כימות של תאים בודדים אישר מעבר רצפי זה ברמת התאים הבודדים. עקומות עוצמה ממוצעות על פני מספר תאים במעקב אישרו כי דפוס זה היה עקבי ברמת האוכלוסייה, כאשר אבות-טיפוס של תאי פנת הראו קשר הפוך אופייני בין אותות MUC2-mNeonGreen ל-DEFA5-dsRed.פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבחון כיצד תא בודד מעצב מחדש את השלד התאי שלו, למשל במהלך חלוקה, במהלך נדידה, או למשל, במהלך דחיקה (extrusion) ברקמה שלמה. שיקול מרכזי הוא בחירת יחס הסימון, שכן תאי דווח (reporter cells) דלילים מבודדים אותות של תא בודד, בעוד שתאים דלילים שאינם מסומנים חושפים את תגובות הסביבה. מחקרים עתידיים יכולים לשלב סמני גורל (fate reporters) עם סימון פסיפס (mosaic labeling) באורגנואיד אחד כדי לקשר בין התחייבויות לגורל לבין דינמיקת השלד התאי של תא בודד.

live-cell-imaging-single-cell-tracking-to-monitor-clonal-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

בפרוטוקול וידאו זה אנו נותנים הסבר שלב אחר שלב על התמרה לנטי-ויראלית באורגנואידים של אפיתל המעי הראשוני ועל עיבוד וניתוח במורד הזרם של תרביות אלה על ידי RT-PCR כמותית, מיקרו-מערך RNA ואימונוהיסטוכימיה.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

פרוטוקולים לתרבית תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC), טרנספקציה חולפת של סמנים פלואורסצנטיים של צמיחת מיקרו-צינוריות, הדמיית תאים חיים וניתוח אוטומטי של דינמיקת צמיחת מיקרו-צינורות בין-פאזיים.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדינמיקה של היווצרות צירים והתקדמות mitotic. היישום שלנו של הדמיה זמן לפקיעה מאפשר למשתמש לזהות תאים בשלבים שונים של mitosis, לעקוב ולזהות פגמים mitotic, ולנתח את הדינמיקה הציר ואת הגורל mitotic cell בעת חשיפה לתרופות נגד mitotic.

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

את כל המבנה תלת-ממדי ואת התוכן התאי של אורגנואידים, כמו גם את הדמיון הפנוטיפיק שלהם לרקמות המקוריות ניתן ללכד באמצעות פרוטוקול הדמיה תלת-ממדי ברזולוציה של תא יחיד המתואר כאן. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של אורגנואידים המשתנים במקור, גודל וצורה.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

אנו מציגים שיטה לרכישת קורסי זמן לכתב פלואורסצנטי מתאים בודדים באמצעות מערכים micropatterned. הפרוטוקול מתאר הכנת מערכים חד-תאיים, התקנה ותפעול של מיקרוסקופיית זמן-לשגות של סריקת תאים חיים וכלי לניתוח תמונות בקוד פתוח לצורך בחירה מראש אוטומטית, בקרה חזותית ומעקב אחר קורסי זמן פלואורסצנטיים משולבים בתאים לכל אתר הידבקות.

הדמיית תא חי של מערכים חד-תאיים (LISCA) - טכניקה רב-תכליתית לכימות קינטיקה תאית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזיהוי מינים של חמצן תגובתי (ROS) באורגנוידים של מורין במעיים באמצעות הדמיה איכותית ובדיקות ציטומטריה כמותית. עבודה זו יכולה להיות מורחבת באופן פוטנציאלי לבדיקות פלואורסצנטיות אחרות כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות נבחרות על ROS.

ניתוח עקה חמצונית באורגנוידים מעיים מורין באמצעות גשושית פלואורוגנית רגישה למינים של חמצן תגובתי

למד הדמיה של תאים חיים ומעקב תאים בודדים באורגנידים במעי אדם ועכברים. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר החלטות גורל תאיות ודינמיקת שיבוטים ברזולוציית תא בודד.

הדמיה של תאים חיים ומעקב תאים בודדים למעקב אחר דינמיקת שיבוטים ומעברי גורל באורגנידים במעי אדם ועכברים

גלה סרטונים נוספים