במבחנה פליטת אור הדמיה vivo ג'ין הכתב של בתאי גזע עובריים אנושיים

in vivo, היווצרות טרטומה היא תקן הזהב לקביעת הפלוריפוטנטיות או היכולת של התא ליצור את כל שלוש שכבות הנבט. טרטומות מהוות גם מכשול גדול להשתלת תאי גזע, וכיום מעט ידוע על היווצרותן בקינטיקה של גדילה. לאחר שתאים לא ממוינים מושתלים בסביבה המארחת, הפיתוח של מדווח ביולומינסנט , העברת גנים ומכשיר מצמד מטען רגיש במיוחד או צילום CCD איפשר הערכה חוזרת ונשנית לא פולשנית של נדידת מיקום התאים, התפשטות והתמיינות in vivo.

בסרטון זה, נדגים פרוטוקול מפורט למעקב יעיל אחר התפשטות תאי גזע עובריים אנושיים מושתלים בעכבר חי. היי, אני קיט וילסון מהמעבדה של ג'וזף וו במחלקות לרפואה ורדיולוגיה באוניברסיטת סטנפורד. היום נראה לכם נהלים להדמיית תאי גזע עובריים אנושיים, הן במבחנה והן לאחר השתלה בעכבר חי.

הליכים אלה כוללים את השלבים הבאים הדמיה ביולומינסנציה במבחנה של תאי גזע עובריים אנושיים, הכנת עכבר והזרקת תאי גזע להדמיה in vivo והדמיה ביולומינסנציה in vivo של תאים מושתלים. אז בואו נתחיל בסקירת כמה ממרכיבי המפתח של הליכים אלה. על מנת לבצע הדמיה ביולומינסנציה של תאי גזע עובריים אנושיים, תחילה עליך להשיג תאים המבטאים ביציבות גנים מדווחים על EL לוציפראז כגון לוציפראז גחלילית, המונעים על ידי מקדם מכונן כמו יוביקוויטין או תרבית אלפא אחת, תאי גזע עובריים אנושיים חיוביים ל-EL לוציפראז בתנאים ללא מזין.

בדרך כלל אנו עוקבים אחר פרוטוקול תא Y הסטנדרטי ומשתמשים בשש צלחות באר מצופות במטריג'ל באמצעות מדיה במצב או מדיה מסחרית ללא מזין. כדי לזהות את התאים החיוביים של לוציפראז, תצטרך לבקש מהמדווח לבדוק את לוציפר, שכבר מוכן לעשות זאת. אליקוט לוציפר בתכשירים של 1 עד 1.5 מיליליטר בריכוז סופי של 45 מיליגרם למיליליטר.

שמור על מינוס 20 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש והימנע מחשיפה לאור על ידי כיסוי במגבת נייר כאשר אינו באחסון. כדי לדמיין את התאים החיוביים ללוציפראז, נשתמש בשתי מערכות הדמיה שונות. עבור ההליך במבחנה, נשתמש במערכת הדמיה סטרילית, Xeno IVUS 50, ועבור in vivo, נעבור למרכז סטנפורד להדמיה in vivo כדי להשתמש ב-Xeno IVUS 200.

מערכת זו כוללת מכשיר איזוף לורין משולב ותא אינדוקציה להרדמה זמנית של בעלי חיים קטנים. אוקיי, יש לי את עצמי. בואו נעבור להדמיה ביולוגית במבחנה.

להדמיית ביולומינסנציה במבחנה, חשוב לשמור על תנאים סטריליים. לכן, מערכת ההדמיה צריכה להיות סטרילית, רצוי בחדר תרבית תאים. לפני ההדמיה, הסר את המדיה התאית והוסף מספיק PBS כדי לכסות את התאים.

לדוגמה, הוסף מיליליטר אחד של PBS לכל באר של צלחת שש בארות המכילה את תרביות תאי הגזע העובריים האנושיים שלך. היחס בין דרין ל-PBS צריך להיות אחד ל-100. אז הוסף 10 מיקרוליטר דרין הפשרה לכל באר של צלחת שש הבארות.

זכור לסנן את הדרין לפני שאתה מוסיף לתרביות שלך. לאחר המתנה של דקה אחת, הכנס את הצלחת לתא, ולאחר מכן צלם תמונה באמצעות זמן החשיפה של 10 שניות, התאם את זמן החשיפה. אם האות רווי או חלש מדי, אות הביו-לומינסנציה משקף את מספר התאים, כך שניתן לבצע בדיקות כימות המתאמות את האות עם מספרי תאים שונים.

אלה תמונות שנלקחו מבדיקת כימות טיפוסית. בפינה השמאלית העליונה יש שדה בהיר של כמה מושבות תאי גזע עובריים אנושיים. אנו יודעים שהתאים האלה נושאים את הגן המדווח שלנו מכיוון שהם זוהרים בירוק לאחר מעשה.

מיון הצבע הכחול הוא כתמים מטומטמים. הפאנל התחתון מציג בארות תרבותיות עם מספר הולך וגדל של תאים. מספרי התאים נמצאים בקורלציה עם אות ביולומינסנציה כפי שניתן לראות בגרף זה.

מתאם זה נותן לנו מבחן כמותי למחצה למעקב אחר התפשטות תאים in vivo. אוקיי, זה נוהל במבחנה. עכשיו בואו נעבור להדמיית ביולומינסנציה in vivo.

כדי לדמות את היווצרות הטרטומה in vivo, נזריק את תאי הגזע העובריים האנושיים שלנו המבטאים את הגן המדווח על לוציפראז גחלילית לתוך גבו של עכבר מחליק ונצלם תמונות ביולומינסנט עם מערכת ה-IVU. כאשר אתה מוכן להשתיל את התאים, השתמש בחלל הדיסק או בקולגנאז כדי לשחרר את שטיפת התאים מספר פעמים ולהשעות אותם בתערובת של אחד לאחד של גורם גדילה, מטריג'ל מופחת ו-DMM. בדרך כלל, אנו מערבבים תחילה את התאים עם DMM צונן ולאחר מכן מוסיפים את המטריגל.

עבור כל אתר תת עורי, אנו מזריקים 200,000 תאים תלויים בנפח של 50 עד 100 מיקרוליטר של תערובת המטריגל DMM. ניתן לכוונן את מספר התא בהתאם ליישום שלך. זכרו לשמור הכל על קרח לפני ההזרקה.

לאחר שהתאים מוכנים, אנו מרדימים את העכבר על ידי הנחתו בתיבת האינדוקציה. עם זרימת איזו פלואור מופעלת. לאחר כדקה העכבר מורדם וניתן להניח אותו על שולחן הניתוחים עם איזו פלואור רציף.

מכיוון שעבור פלואורסצנטיות אוטומטיות באופן טבעי ועלולות לטשטש את התמונה הביולוגית, נצטרך להסיר את השיער מהצד האחורי של העכבר. הדרך הקלה ביותר לעשות זאת היא להשתמש במכונת גילוח חשמלית, אך ניתן גם להשתמש בג'לים להסרת שיער, לנגב באלכוהול כדי לעקר את העור לאחר מכן. לאחר מכן, צייר את תרחיף התאים של מאה מיקרוליטר במזרק מחטים בגודל 23 עד 27 עובדות בצורה הטובה ביותר מכיוון שהן לא ייסתמו בתאים.

כעת, הזריקו את התאים מתחת לעור לגב העכבר מכיוון שהעור די רפוי. השתמש באגודל ובאצבע המורה כדי לצבוט ולמתוח את האזור שברצונך להזריק. יש להזריק ממש מתחת לעור ולהקפיד לא לנקב עמוק מדי.

כמו כן, נסו למנוע מהמחט להחליק החוצה ממקום ההזרקה תוך כדי לחיצה על הבוכנה. זה ימנע יצירת חור בעור שדרכו התאים יכולים לדלוף. אם אתה מנסה להזריק שוב לאחר הזרקת התאים, המתן כמה שעות כדי לאפשר לעכבר להתעורר ולהתרוצץ לפני שתחזיר אותו למצב שינה.

להדמיית ביולומינסנציה, פעולה זו מונעת רעילות איזופלורן. אוקיי, עכשיו אנחנו מוכנים להמשיך עם הדמיה ביולומינסנציה in vivo של התאים המוזרקים. עבור מחקרי ההדמיה הבאים, נשתמש בעכבר שכבר החל להראות היווצרות של טרטומה להדמיית ביולומינסנציה של בעלי חיים שלמים.

אנו מבצעים הזרקה תוך-צפקית של לוציפר במינון של 375 מיליגרם לק"ג משקל גוף. לכן, עלינו לשקול את החיה המורדמת כדי לחשב את המינון, להזריק את לוציפר השטר לתוך הצפק, ממש ליד קו האמצע, למשוך את המחט לאחור ולוודא שאין דם, מה שיהווה אינדיקציה לכך שנגרם לך נזק באיבר פנימי. אם העכבר מתחיל להתעורר, פשוט החזירו אותו לתא האינדוקציה והמתינו דקה או שתיים.

התכוננו להדמיה על ידי הנחת נייר שחור מט בקופסת ההדמיה כדי לסייע בספיגת כל אור, שאינו נפלט מתאי גזע עובריים אנושיים. עבור עכברים, אות הביו-לומינסנציה המקסימלי מתרחש בדרך כלל 15 עד 40 דקות לאחר ההזרקה. אז לאחר 10 עד 15 דקות, הנח את העכבר בצד האחורי כלפי מעלה בתא ההדמיה עם איזו פלואור.

התחל עם זמן חשיפה של 10. אם האות רווי, נסה להקטין את זמן החשיפה. אם חלש מדי, הגדל את החשיפה.

לאחר שזמן חשיפת האות עבר אופטימיזציה עבור העכבר, התחל לצלם את התמונות כל דקה עד שהאות יגיע למקסימום. הדבר נעשה בצורה הטובה ביותר על ידי שימוש בתוכנת ההדמיה כדי לבחור אזורי עניין המכסים את אתרי ההזרקה שלך. על ידי ניטור עוצמת האות בכל אזור עניין, אתה יכול בקלות לקבוע מתי האות מתחיל לרדת, מה שמצביע על כך שעוצמת האות המקסימלית הושגה.

אנחנו לוקחים את הממוצע של שלוש תמונות עוקבות שמתרחשות סביב המקסימום ומשתמשים בזה כערך הסופי שלנו. כאשר אתה מרוצה מהתמונות שלך, הסר את העכבר מאיזוף פלואור ואפשר לו להתעורר בכלוב שלו. בדרך כלל העכבר אמור להתעורר תוך 15 דקות.

לאחר מהלך הזמן הרצוי של תמונות ביולומינסנציה נרכש. ניתן להקריב את החיה בקטעי רקמה המשמשים להיסטולוגיה. אוקיי, עכשיו שסיימנו עם הליכי ההדמיה in vivo, אנחנו יכולים להסתכל מקרוב על התוצאות שלנו וגם להסתכל על כמה מחקרים קודמים מהמעבדה שלנו.

הנה תמונת ביולומינסנציה של שלושה עכברים עם טרטומות תת עוריות. נתוני אות הביו-לומינסנציה הונחו על תמונה בשחור-לבן של העכברים שנעשתה עבורנו באופן אוטומטי על ידי תוכנת ההדמיה. זוהי דוגמה לסוג ההדמיה האורכית האפשרית עם לוציפראז גחלילית.

במקרה זה, הזרקנו תאי גזע עובריים אנושיים ישירות ללב לאחר ההזרקה הראשונית. רוב התאים מתים במהלך השבוע שלאחר מכן, כפי שמוצג על ידי ירידה בביולומינסנציה מעל הלב. שימו לב, החץ השחור.

תאי הגזע העובריים האנושיים ששורדים את ההשתלה יוצרים בסופו של דבר טרטומה בלב שניתן לדמיין כאות העולה במהירות החל מסביבות היום ה-14. תבחין שביום השביעי יש אזור שני של ביולומינסנציה המסומן על ידי החץ האדום שמראה דליפה לבבית נוספת של תאי גזע עובריים אנושיים לתוך הבטן. זה נפוץ מאוד.

זה עתה הראינו לכם כיצד לרכוש תמונות ביולומינסנציה של תאי גזע עובריים אנושיים המבטאים ביציבות גן מדווח לוציפראז, הן במבחנה והן לאחר השתלה לעכבר חי. שיטה זו מאפשרת הדמיה וניטור חוזרים ונשנים של התפשטות התאים ללא צורך להקריב מספר רב של בעלי חיים עבור היסטולוגיה, מה שעלול להיות לא מדויק מטבעו לכימות התאים. בעת ביצוע הליך זה בעכבר, חשוב לזכור להשתמש בריכוז הנכון של דלוצ'י ולהימנע מהרוויה של תמונת ביולומינסנציה במרווחי חשיפה ארוכים מדי.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.