ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

ניתן להפריד חלבונים בודדים מתערובות חלבונים מורכבות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל, ובאופן ספציפי באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, הידועה גם כ-PAGE; חלבונים נעים בתגובה לשדה חשמלי דרך נקבוביות במטריצת הג'ל. השילוב של גודל נקבוביות הג'ל, המטען, הגודל והצורה של החלבון קובע את קצב נתירותו של החלבון. בסרטון זה, נדגים שיטה להפרדה אלקטרופורטית של חלבונים.

שלום, אני ד"ר Bobul Chakravarti מהמרכז לפרוטאומיקה של Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences. היום אראה לכם הליך לביצוע אלקטרופורזה של ג'ל בממד אחד (1D gel electrophoresis). אז בואו נתחיל.

ראשית, הרכיבו את מבנה הלוחות ("sandwich") של מכשיר האלקטרופורזה בהתאם להוראות היצרן, תוך שימוש בשתי לוחיות זכוכית נקיות ובשני ספייסרים של 1.5 millimeter. כעת, נעלו את מבנה הלוחות למעמד היציקה. לאחר מכן, הכינו את תמיסת ג'ל ההפרדה כפי שמתואר בפרוטוקולים הנוכחיים.

הוסיפו לתמיסה את הכמות המצוינת של ammonium per sulfate 10% ו-teed וערבבו בעדינות לאיחוד. בשל הריכוז הגבוה של אקרילאמיד, אין צורך בניקוי גזים (degassing). באמצעות פיפטה פלסטית חד-פעמית של 10 מיליליטר, מרחו מיד את תמיסת ג'ל ההפרדה על ה"סנדוויץ'" לאורך קצהו של אחד המרווחים, עד שגובה התמיסה בין לוחות הזכוכית יהיה כ-11 סנטימטרים.

בשלב הבא, השתמשו בפיפטה אחרת כדי לכסות לאט את החלק העליון של הג'ל בשכבה בעובי של כסנטימטר אחד של מים רוויי isobutyl alcohol או מים מזוקקים. בצעו זאת על ידי הזרמה עדינה של המים כנגד הדופן של אחד המפרידים (spacers), ולאחר מכן כנגד השני, והניחו לג'ל להתממר (polymerize) במשך 30 עד 60 דקות. בטמפרטורת החדר, שכבת המים העליונה מבטיחה שהג'ל של ה-acrylamide יתממר בקו ישר.

לאחר שהג'ל עובר פולימריזציה, ניתן למזוג את ג'ל הריכוז (stacking gel). ראשית, שפכו את שכבת המים המזוקקים, ולאחר מכן שטפו עם 1x Tris-HCl ב-SDS ב-pH של 8.8. כעת הכינו את תמיסת ג'ל הריכוז כפי שמפורט בפרוטוקולים הנוכחיים.

בשלב הבא, באמצעות פיפטת פלסטיק, הזרמו באיטיות את תמיסת ג'ל הריכוז (stacking gel) למרכז ה"סנדוויץ'" לאורך קצהו של אחד המרווחים, עד שגובה התמיסה ב"סנדוויץ'" יהיה כסנטימטר מהחלק העליון של הפלטות. הקפידו לא להכניס בועות אוויר אל תוך ג'ל הריכוז. לאחר מזיגת הג'ל, הכניסו מסרק טפלון של 0.75 מילימטר לתוך שכבת תמיסת ג'ל הריכוז.

המתינו עד שתמיסת ג'ל הריכוז (stacking gel) תפולימריז במשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר; כעת ניתן להכין את דגימות החלבון. כדי להתחיל בהכנת דגימות החלבון, דללו חלק מדגימת החלבון המיועדת לניתוח ביחס של אחד לאחד עם בופר דגימות SDS בריכוז 2X.

עבור תמיסות חלבון מהולות, שקלו להשתמש בתערובת של בופר דגימות 6X SDS עם חלבון ביחס של חמישה לאחד. אם הדגימה היא משקע חלבון (protein pellet), המיסו את החלבון ב-50 עד 100 microliters של בופר דגימות 1X SDS. כעת, חממו את הדגימות למשך שלוש עד חמש דקות ב-100 degrees Celsius בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה בעלת פקק הברגה אטום, בתוך אמבט מים.

בשלב הבא, הוצאו בזהירות את מסרק הטפלון מבלי לקרוע את דפנות בארות הפולי-אקרילאמיד. לאחר הוצאת המסרק, שטפו את הבארות ב-1X SDS electrophoresis buffer. לאחר מכן, מלאו את הבארות ב-1X SDS electrophoresis buffer באמצעות פיפטה.

לאחר ששטפו ומילאו את הבארים בבופר, הצמידו את סנדוויץ' הג'ל לתא הבופר העליון. בהתאם להוראות היצרן, מלאו את תא הבופר התחתון בכמות המומלצת של בופר electrophoresis SDS בריכוז one X. לאחר מכן, הניחו את הסנדוויץ' המחובר לתא הבופר העליון בתוך תא הבופר התחתון.

כעת מלאו לחלוטין את תא הבאפר העליון בבאפר electrophoresis XSDS אחד, כך שבארות הדגימות של ג'ל הריכוז (stacking gel) יהיו מלאות בבאפר. הג'ל מוכן כעת לטעינה באמצעות פפט אוטומטית של 25 או 100 microliter עם טיפים לטעינת ג'ל; טענו דגימת חלבון לאחת או יותר מהבארות על ידי הנחה זהירה של הדגימה כשכבה דקה בתחתית הבארות. טענו את בארות הביקורת עם סממני משקל מולקולרי (molecular weight standards).

בנוסף, הוסיפו נפח שווה של תמיסת דגימה 1X SDS לכל הבארים הריקות כדי למנוע התפשטות של הנתיבים הסמוכים. כעת אנו מוכנים להתחיל באלקטרופורזה של הג'ל. כדי להריץ את הג'ל, חברו את ספק הכוח לתא והריצו אותו בזרם קבוע של 30 mA עבור ג'ל מסוג slab בעובי 1.5 millimeters.

לאחר שצבע המעקב menthol blue הגיע לתחתית ג'ל ההפרדה, נתקו את ספק הכוח. כעת, לאחר שהרצת הג'ל הסתיימה, שפכו את באפר האלקטרופורזה והסירו את תא הבאפר העליון יחד עם ה"סנדוויץ'" של הג'ל המחובר אליו. כוונו את הג'ל כך שסדר בארי הדגימות יהיה ידוע.

לאחר מכן, הוציאו את ה"סנדוויץ'" מתא הבופר העליון והניחו אותו על גיליון נייר סופג או נייר מגבת. לאחר מכן, החליקו בזהירות את אחד המרווחים עד למחציתו מקצה ה"סנדוויץ'" לאורך כל אורכו. השתמשו במרווח החשוף כמנוף כדי להפריד את לוחית הזכוכית, ובכך לחשוף את הג'ל בזהירות.

הוציאו את הג'ל מהפלטה התחתונה. גזרו משולש קטן מאחת הפינות של הג'ל כדי למנוע איבוד של כיוון הנתיבים (lanes) במהלך הצביעה והייבוש. הליך האלקטרופורזה של הג'ל הושלם כעת.

כעת ניתן לעבד את הג'ל באמצעות פרוצדורות שונות לגילוי חלבונים. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להפריד חלבונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. וזהו זה.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוי שלכם.