מכתים חלבונים ג'ל

בסרטון קודם שכותרתו הפרדה אלקטרופורטית של חלבונים, הדגמנו כיצד ניתן להפריד תערובת מורכבת של חלבונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. בסרטון זה נראה לכם ארבע שיטות שונות לצביעה בג'ל להמחשת מיקום החלבונים בג'ל. היי, אני שון גלאגר מ-UVP שעובד עם המרכז לפרוטאומיקה כאן במכון לתארים מתקדמים של KEG.

היום אראה לכם מספר טכניקות להמחשת חלבונים לאחר הפרדה על ידי אלקטרופורזה. זה כולל צביעת כסף כחול קמאסי, כתום סיירו ואודם סירו. אז בואו נתחיל עם קמאסי כחול תחילה.

זיהוי איסורי חלבון בג'ל על ידי צביעה כחולה של קמאסי תלוי בקישור לא ספציפי של צבע. במקרה זה, קמאסי כחול מבריק G 2 50. בשיטה זו, חלבונים המופרדים בג'ל פולי אקרילאמיד נשטפים באמצעות מים בטוהר גבוה.

לאחר מכן מזוהה מיקום החלבונים באמצעות כתם כחול קמאסי על בסיס מים. מגבלת הזיהוי היא 0.3 עד מיקרוגרם אחד לכל רצועת חלבון. כדי להתחיל, התחל עם ג'ל פולי אקרילאמיד בו הופרדו חלבונים באמצעות אלקטרופורזה.

תוך כדי תסיסה איטית, הניחו את ג'ל הפולי אקרילאמיד במיכל פלסטיק מלא ב-300 מיליליטר מים בטוהר גבוה. השאירו למשך חמש דקות. השליכו וחזרו על הפעולה פעמיים נוספות לאחר הכביסה השלישית.

יוצקים את המים ומכסים את הג'ל בתמיסת מכתים כחולה של קמאסי למשך שעה תוך כדי תסיסה איטית לאחר שעה של צביעה, יוצקים את תמיסת הצביעה. שוטפים את הג'ל בקצרה על ידי הנחת כ -200 מיליליטר מים למשך 30 דקות. בשלב זה, הג'ל עשוי להיות מאוחסן במים להדמיה עתידית.

ניתן גם לייבש את הג'ל בשלב זה כדי לשמור על תיעוד ג'ל קבוע. לשם כך, הניחו את הג'ל על שני גיליונות נייר סינון ווטמן שלושה מ"מ וכסו את החלק העליון בניילון. לאחר מכן יבש במייבש ג'ל קונבנציונאלי למשך שעה עד שעתיים בחום של כ-80 מעלות צלזיוס.

שיטת צביעת חלבון נוספת היא על ידי צביעת כסף, אותה נדגים בהמשך. למרות ששיטת הצביעה הכחולה של קמאסי קלה ומהירה יותר, צביעת כסף רגישה הרבה יותר עם מגבלת זיהוי של 0.3 ננוגרם BSA. זיהוי רצועות חלבון בג'ל על ידי צביעת כסף תלוי בקשירת הכסף לקבוצות כימיות שונות בחלבון.

הפרוטוקול הבא מבוסס על ערכת צביעת כסף Silver Quest מבית Vitrogen. הפרוטוקול נגזר מפרוטוקול הצביעה המהירה, כ-30 דקות ומייצג את אחת הכימיות הרבות מבוססות הערכה המשמשות לצביעה בכסף התואמות לספקטרומטריית מסה. במקרה זה, נשתמש במיני ג'ל טרומי בזכוכית לפני שנתחיל לצבוע כסף.

הקפד ללבוש כפפות בכל עת כדי למנוע זיהום טביעות אצבע. מניחים את הג'ל במגש בטוח למיקרוגל עם 100 מיליליטר מים בדרגת ריאגנט. שוטפים בקצרה ואז שופכים את המים.

לאחר מכן, הוסיפו 100 מיליליטר של קיבוע, המורכב מ-40% אתנול, 10% חומצה אצטית במים בטוהר גבוה ומיקרוגל למשך 30 שניות. תהליך המיקרוגל מקצר את שלבי הדגירה הדרושים על ידי האצת הכריכה והצביעה. בשלב זה, הניחו את הג'ל על שייקר ונדנדו לאט לאט במשך חמש דקות.

לאחר חמש דקות, שפכו את הקיבוע, הוסיפו 100 מיליליטר, 30% אתנול כדי לשטוף את מיקרוגל הג'ל למשך 30 שניות, ואז הניחו את הג'ל על שייקר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, שפכו את האתנול. כעת הוסיפו 100 מיליליטר של מיקרוגל מגיב רגיש למשך 30 שניות, ולאחר מכן הניחו על שייקר למשך שתי דקות.

לאחר שתי הדקות, שפכו את המגיב הרגיש. מוסיפים 100 מיליליטר במיקרוגל מים בדרגת ריאגנט למשך 30 שניות, ומניחים על שייקר למשך שתי דקות. יוצקים וחוזרים על הפעולה בסך הכל שני מחזורי כביסה.

כעת הוסיפו 100 מיליליטר תמיסת מכתים, מיקרוגל למשך 30 שניות והתסיסו לאט לאט במשך חמש דקות. לאחר חמש הדקות, שפכו את תמיסת הצביעה. הוסיפו 100 מיליליטר מים בדרגת ריאגנט, דלגו על המיקרוגל, צעדו והניחו ישירות על שייקר למשך 20 עד 60 שניות.

זורקים את המים ומוסיפים מיד 100 מיליליטר מהתמיסה המתפתחת ומתפתחים עד שרצועות החלבון נראות לעין. כשהרקע נשאר ברור, זה ייקח בערך חמש עד 10 דקות. בשלב זה, הוסף 10 מיליליטר של תמיסת פקק למפתח כדי לעצור את הפיתוח לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

צלם את הג'ל בהקדם האפשרי מכיוון שייתכנו שינויים קלים בעוצמת הצבע ועלייה באלמנטים רקע לא ספציפיים. עם הזמן, הג'ל שאתה רואה מכיל חלבונים שיוריים לאחר ספיגת אלקטרו, יבש את הג'ל כדי לשמור על תיעוד קבוע או לאחסן בשקית ניילון אטומה. לאחר מכן, אנו מדגימים שיטה לצביעה פלואורסצנטית של ג'לים.

לצבעים פלואורסצנטיים יש מספר יתרונות על פני כתמי חלבון מסורתיים. כתמי ג'ל חלבון כתום Cipro, שנתאר כאן יכולים לזהות ננוגרם אחד עד שניים של חלבון לכל רצועה. זה רגיש יותר מכתמים כחולים מבריקים של קמאסי ורגיש כמו טכניקות צביעה כסף רבות.

צביעה פלואורסצנטית היא פשוטה עם פחות ידיים בזמן מאשר פרוטוקולי צביעת כסף טיפוסיים והיא מושלמת תוך פחות משעה. ניתן לדמיין חלבונים מוכתמים באמצעות טרנס-לומינטור UV סטנדרטי של 300 ננומטר או סורק לייזר. במקרה זה, נשתמש שוב במיני ג'ל טרומי בvitrogen כדי להתחיל להכין ולהפריד חלבונים באמצעות דף SDS.

אך השתמש ב-0.05%SDS במאגר הריצה במקום ב-0.1% SDS הרגיל על מנת להפחית את הקרינה ברקע. כדי להתחיל בהליך הצביעה, שפכו תמיסת צביעה פלואורסצנטית כתומה cipro לכלי פלסטיק קטן עבור מיני ג'ל אחד או שניים בגודל סטנדרטי. השתמש בכ- 50 מיליליטר של תמיסת מכתים.

חשוב לציין כי יש לנקות ולשטוף כלים מכתימים היטב לפני השימוש מכיוון שכל חומרי ניקוי יפריעו להכתמה. כעת, הניחו את הג'ל בתמיסת הצביעה. מכסים את המיכל בנייר אלומיניום כדי להגן על הצבע מפני אור בהיר.

מערבבים בעדינות את הג'ל בטמפרטורת החדר למשך 40 עד 60 דקות. השליכו את תמיסת הצביעה ולאחר מכן שטפו את הג'ל למשך פחות מדקה עם חומצה אצטית 7.5%, כ-100 מיליליטר כדי להסיר את הכתם העודף משטח הג'ל, עצרו את הג'ל על ידי דגירה למשך הלילה ב-0.1% בין 20 כדי לדמיין ולצלם רצועות חלבון. הנח את הג'ל עם התווית הפלואורסצנטית ישירות על טרנס-לומינטור סטנדרטי של 300 ננומטר או על טרנס-לומינטור אור כחול.

לאחר מכן, נדגים שיטת צביעה פלואורסצנטית חלופית, המשתמשת בצבע פלואורסצנטי אודם Cipro. שיטת צביעת האודם של Cipro תוכננה במיוחד לשימוש בדף דו מימדי, אך הוכיחה את עצמה כצבע ג'ל חלבון הרגיש ביותר עבור דף SDS חד מימדי סטנדרטי. כדי להתחיל, העבירו את הג'ל לצלחת פוליפרופילן או PVC נקייה בגודל מתאים.

יש לדגור את הג'ל בכמות המתאימה של כתם ג'ל חלבון ציפרו רובי לא מדולל עם ערבול עדין מתמשך על שייקר אורביטלי במהירות של 50 סל"ד. יש לכסות את הג'ל ולדגור למשך שלוש שעות לפחות. מעבירים את הג'ל לכלי מכתים נקי ושוטפים אותו פעם אחת בתמיסת 10% מתנול, 7% חומצה אצטית, מתאוששים ומניחים את הג'ל בחזרה על הנדנדה למשך 30 דקות.

על מנת להפחית את הקרינה ברקע ולהגביר את הרגישות, הג'ל מוכן כעת לצפייה ולצילום. אני רוצה להודות לכם על שצפיתם בפרוטוקולים של היום היום. הראינו לך מספר הליכים שונים להדמיית חלבונים לאחר אלקטרופורזה.

חלקם רגישים מאוד, כמו צביעה פלואורסצנטית וכתמים כסופים, וחלקם שגרתיים כמו צביעה כחולה של קמאסי. חשוב לזכור שטוהר המגיב הוא קריטי. חשוב מאוד גם להשתמש במים טהורים במיוחד, וגם התזמון בכל אחד מהשלבים.

אתה צריך לשים לב לכך היטב כדי לקבל גם תוצאות הניתנות לשחזור. זהו ובהצלחה בסדרת הניסויים הבאה שלך.