Name: מכתים חלבונים גל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-08T02:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: למד ארבע שיטות מכתים חלבונים ג'ל: Coomassie Blue, כסף, SYPRO Orange ו-SYPRO Ruby. השווה רגישות וקלות שימוש לצורך ויזואליזציה אפקטיבית של חלבונים לאחר אלקטרופורזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

פרוטוקול טקסט מלא לגישה זו ניסיוני זמין <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471142720/cp/cpmb/article/mb1006/current/abstract" target="_blank">הפרוטוקולים נוכחי בביולוגיה מולקולרית</a> .

למחברים אין הצהרות לגבי ניגודי עניינים.

מכתים חלבונים ג&#39;ל

Staining Proteins in Gels

בעקבות ההפרדה על ידי שיטות electrophoretic, חלבונים בג&#39;ל ניתן להבחין באמצעות שיטות צביעה שונות. יחידה זו מתארת ​​פרוטוקולים לאיתור חלבונים על ידי ארבע שיטות פופולרי. מכתים Coomassie הכחול הוא שיטה קלה ומהירה. כסף מכתים, בעוד זמן רב יותר, באופן משמעותי יותר רגיש ולכן יכול לשמש כדי לזהות כמויות קטנות יותר של חלבון. מכתים פלורסנט היא אלטרנטיבה פופולרית נהלים מכתים מסורתי, בעיקר משום שהוא רגיש יותר מכתים Coomassie, ולעתים קרובות הוא רגיש כמו מכתים כסף. הכתמה של חלבונים עם SYPRO כתום SYPRO רובי הם הפגינו גם כאן.

בעקבות ההפרדה על ידי שיטות electrophoretic, חלבונים בג&#39;ל ניתן להבחין באמצעות שיטות צביעה שונות. הכתמה של חלבונים עם Coomassie כחול, מכתים כסף, SYPRO אורנג&#39;, SYPRO רובי הם הפגינו וידאו.

בעקבות הפרדה בשיטות אלקטרופורזה, ניתן לזהות חלבונים בג'ל באמצעות מספר שיטות צביעה. יחידה זו מתארת פרוטוקולים עבור...

בסרטון קודם בשם Electrophoretic Separation of Proteins, הדגמנו כיצד ניתן להפריד תערובת מורכבת של חלבונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. בסרטון זה, נראה לכם ארבע שיטות שונות לצביעת ג'ל לצורך ויזואליזציה של מיקום החלבונים בג'ל. שלום, אני שון גאלגר מ-UVP, העובד עם מרכז הפרוטאומיקה כאן במכון ללימודים גבוהים KEG.היום אדגים לכם מספר טכניקות לוויזואליזציה של חלבונים לאחר הפרדה באלקטרופורזה. אלו כוללות צביעת Coomassie blue, צביעת כסף, Cyro Orange ו-Cyro Ruby. לכן, נתחיל תחילה ב-Coomassie blue.גילוי פסי חלבון בג'ל באמצעות צביעת Coomassie blue מבוסס על קישור לא ספציפי של צבע. במקרה זה, Coomassie brilliant blue G 250. בשיטה זו, חלבונים שהופרדו בג'ל פוליאקרילאמיד נשטפים באמצעות מים בדרגת טוהר גבוהה.לאחר מכן, מיקום החלבונים מזוהה באמצעות צביעת kamasi blue על בסיס מים. סף הגילוי הוא 0.3 עד מיקרוגרם אחד לכל פס חלבון. כדי להתחיל, השתמשו בג'ל poly acrylamide שבו הופרדו חלבונים באמצעות אלקטרופורזה.תוך כדי ערבוב איטי, הניחו את ג'ל הפוליאקרילאמיד במיכל פלסטיק מלא ב-300 milliliters של מים בדרגת טוהר גבוהה. השאירו למשך חמש דקות. השליכו את המים וחזרו על הפעולה פעמיים נוספות לאחר השטיפה השלישית.שפכו את המים וכסו את הג'ל בתמיסת צביעה של Kamasi blue למשך שעה תוך כדי ערבוב איטי. לאחר שעה של צביעה, שפכו את תמיסת הצביעה. שטפו את הג'ל קצרות על ידי הנחתו בכ-200 milliliters של מים למשך 30 דקות. בשלב זה, ניתן לשמור את הג'ל במים לצורך דימות עתידי.ניתן לייבש את הג'ל בשלב זה כדי לשמור תיעוד קבוע של הג'ל. לשם כך, הניחו את הג'ל על שני דפים של נייר סינון Watman בעובי 3 mm וכסו את החלק העליון בניילון נצמד. לאחר מכן, ייבשו במייבש ג'ל קונבנציונלי למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של כ-80 °C.שיטת צביעה נוספת לחלבונים היא צביעה בכסף, אותה נדגים כעת. אף ששיטת הצביעה ב- Coomassie blue היא פשוטה ומהירה יותר, צביעה בכסף רגישה באופןconsiderable יותר, עם סף גילוי של 0.3 nanograms BSA. גילוי פסי חלבון בג'ל באמצעות צביעה בכסף תלוי בקישור של כסף לקבוצות כימיות שונות בחלבון.הפרוטוקול הבא מבוסס על ערכת הצביעה בכסף Silver Quest מבית Invitrogen. הפרוטוקול נגזר מפרוטוקול הצביעה המהירה, שנמשך כ-30 דקות, ומייצג אחת משיטות הכימיה הרבות המבוססות על ערכות לצביעה בכסף התואמות למספקטרומטריית מסות. במקרה זה, נשתמש ב-mini gel יצוק מראש מבית Invitrogen לפני תחילת הצביעה בכסף.יש להקפיד על הרכבת כפפות בכל עת כדי למנוע זיהום מטביעות אצבעות. הניחו את הג'ל בתבנית העמידה למיקרוגל עם 100 milliliters של מים בדרגת רהיט (reagent grade water). שטפו קצרות ואז שפכו את המים.לאחר מכן, הוסיפו 100 milliliters של חומר מקבע, המורכב מ-40% ethanol ו-10% acetic acid במים בדרגת טוהר גבוהה, וחממו במיקרוגל למשך 30 שניות. תהליך החימום במיקרוגל מקצר את שלבי האינקובציה הדרושים על ידי האצת הקישור והצביעה. בנקודה זו, הניחו את הג'ל על שייקר ונערו באיטיות למשך חמש דקות.לאחר חמש דקות, שפכו את חומר הקיבוע, הוסיפו 100 milliliters של 30% ethanol לשטיפת הג'ל, חממו במיקרוגל למשך 30 seconds, ולאחר מכן הניחו את הג'ל על שייקר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, שפכו את ה-ethanol. כעת הוסיפו 100 milliliters של ריאגנט רגישות (sensitizing reagent), חממו במיקרוגל למשך 30 seconds, ולאחר מכן הניחו על שייקר למשך שתי דקות.לאחר שתי דקות, שפכו את ריאגנט ההרגשה. הוסיפו 100 milliliters של מים בדרגת ריאגנט, חממו במיקרוגל למשך 30 שניות, והניחו על שייקר למשך שתי דקות. שפכו את הנוזל וחזרו על הפעולה לסך הכל שני מחזורי שטיפה.כעת הוסיפו 100 milliliters של תמיסת צביעה, חממו במיקרוגל למשך 30 שניות וערבבו בעדינות למשך חמש דקות. לאחר חמש הדקות, שפכו את תמיסת הצביעה. הוסיפו 100 milliliters של מים בדרגת רהיט (reagent grade water), דלגו על שלב המיקרוגל והניחו ישירות על שייקר למשך 20 עד 60 שניות.שפכו את המים והוסיפו מיד 100 milliliters של תמיסת הפיתוח, ופתחו עד להופעת פסי חלבון נראים לעין. כאשר הרקע נותר נקי, תהליך זה יארך כחמש עד 10 דקות. בשלב זה, הוסיפו 10 milliliters של תמיסת עצירה (stopper solution) למפתח כדי לעצור את הפיתוח ולהשיג את התוצאות המיטביות.צלמו את הג'ל בהקדם האפשרי, שכן עשויים להתרחש שינויים קלים בעוצמת הצבע ועלייה באלמנטים לא ספציפיים ברקע. עם הזמן, הג'ל שאתם רואים מכיל חלבונים שיוריים לאחר electro blotting. ייבשו את הג'ל כדי לשמור תיעוד קבוע או אחסנו אותו בשקית פלסטיק אטומה. כעת, נדגים שיטה לצביעה פלואורסצנטית של ג'לים.לצבעים פלואורסצנטיים יש מספר יתרונות על פני צביעות חלבון מסורתיות. צביעות ג'ל לחלבונים מסוג Cipro orange, אותן נפרט כאן, יכולות לזהות ננוגרם אחד עד שניים של חלבון לרצועה. רגישות זו גבוהה יותר מזו של צביעת Coomassie brilliant blue ודומה לרגישותן של טכניקות צביעה בכסף רבות.צביעה פלואורסצנטית היא תהליך פשוט הדורש פחות זמן עבודה מאשר פרוטוקולי צביעה בכסף טיפוסיים, והיא נשלמת תוך פחות משעה. ניתן להדמות חלבונים צבועים באמצעות טרנסילומינטור UV סטנדרטי של 300 ננומטר או סורק לייזר. במקרה זה, נשתמש שוב בג'ל mini precast של Invitrogen כדי להכין ולהפריד חלבונים באמצעות SDS page.אולם השתמשו ב-0.05% SDS במערך ההרצה (running buffer) במקום ב-0.1% SDS הרגיל, וזאת כדי להפחית את הפלואורסצנציה של הרקע. כדי להתחיל את הליך הצביעה, שפכו תמיסת צביעה פלואורסצנטית מסוג cipro orange לתוך צלחת פלסטיק קטנה המתאימה לג'ל מיני סטנדרטי אחד או שניים. השתמשו בכ-50 milliliters של תמיסת הצביעה.חשוב לציין שיש לנקות ולשטוף היטב את כלי הצביעה לפני השימוש, שכן חומרי ניקוי עלולים להפריע לצביעה. כעת, מקמו את הג'ל בתוך תמיסת הצביעה. כסו את המכל בנייר אלומיניום כדי להגן על הצבע מאור חזק.נער את הג'ל בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 40 עד 60 דקות. השלך את תמיסת הצביעה ולאחר מכן שטוף את הג'ל למשך פחות מדקה בעזרת 7.5% acetic acid, בכמות של כ-100 milliliters, כדי להסיר את הצבע העודף מפני הג'ל. השהה את הג'ל באמצעות דגירה למשך לילה ב-0.1% tween 20 כדי להנחית ולצלם את פסי החלבון. הנח את הג'ל המסומן פלואורסצנטית ישירות על transluminator סטנדרטי של 300 nanometer או על transluminator של אור כחול.בשלב הבא, נדגים שיטת סמירה פלואורסצנטית חלופית, המשתמשת בצבע הפלואורסצנטי Cipro ruby. שיטת הסמירה ב-Cipro ruby תוכננה במקור לשימוש בדו-ממדי (2D page), אך הוכחה כסמירה הרגישה ביותר לג'ל חלבונים ב-SDS page חד-ממדי סטנדרטי. כדי להתחיל, העבירו את הג'ל לכלי פוליפרופילן או PVC נקי בגודל מתאים.הדגירו את הג'ל בכמות המתאימה של צבע โปรטאין cipro ruby לג'ל ללא דילול, תוך써 ערבוב עדין ורציף במכשיר ניעור אורביטלי במהירות של 50 RPMs. כסו את הג'ל והדגירו למשך שלוש שעות לפחות. העבירו את הג'ל לכלי צביעה נקי ושטפו אותו פעם אחת בתמיסה של 10% methanol ו-7% acetic acid, לאחר מכן אספו את הג'ל והחזירו אותו למכשיר הניעור למשך 30 דקות.כדי להפחית את הפלואורסצנציה של הרקע ולהגביר את הרגישות, הג'ל מוכן כעת לצפייה ולצילום. אני רוצה להודות לכם על צפייתכם בפרוטוקולים של היום. הצגנו בפניכם מספר הליכים שונים להדמיית חלבונים לאחר אלקטרופורזה.חלקן רגישות מאוד, כגון צביעה פלואורסצנטית וצביעת כסף, ואחרות הן שגרתיות, כגון צביעת kamasi blue. חשוב לזכור כי טוהר הרכיבים הוא קריטי. שימוש במים מזוקקים במיוחד (ultra pure water) הוא אף הוא חשוב מאוד, כמו גם התזמון של כל אחד מהשלבים.עליכם להקדיש לכך תשומת לב רבה כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. זהו כל הסיפור, ובהצלחה בסדרת הניסויים הבאה שלכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול קצר מכתים חלבון עם Coomassie מבריק כחול (CBB) G-250 ב ג'לים polyacrylamide מתואר ללא שימוש בממיסים אורגניים או חומצה אצטית כמו הנהלים מכתים קלאסית עם CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

וידאו זה יהיה פופולרי colloidal Coomassie G-250 פרוטוקול מכתים פי...

מהיר רגיש Colloidal Coomassie G-250 מכתים עבור חלבונים ג&#39;ל polyacrylamide

פרוטוקול שלנו מדגים כיצד למזוג ג 'ל חלבון מרובים בכל פעם על ידי מיחזור Invitrogen Nupage קלטות Novex minigel וחומרים זולים שנרכשו בחנות שיפוץ הבית. שיטה זו חסכונית יעילה כולל דרך לאחסן את הג'לים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. על ידי מחדש באמצעות קלטות ג'ל פלסטיק של ג'ל זמינים מסחרית, מעבדות הפועלות ג'ל חלבון תכופים יכול לחסוך בעלויות משמעותיות לעזור לסביבה.

לשפוך והפעלה Gel חלבון על ידי שימוש חוזר קלטות מסחריים

קבוצת ישר קדימה שיטות לבודד לקבוע את זהותו של החלבונים הנפוץ ביותר בא לידי ביטוי בשרירי השלד. אודות 800 נקודות הם להבחין על ג'ל דו מימדי של השריר 10 מ"ג; זה מאפשר להגדרה של ביטוי המגדר חלבון ספציפי. שיטות אלה ייתן תוצאות המקבילה רוב הרקמות.

שרירי השלד מין Dimorphism מ Proteomics

בסרטון זה, אנו מדגימים שיטת צביעת כסף של ג'לים polyacrylamide עבור הדמיה של חלבון הכולל באמצעות בדיקות פלואורוגניות.

צביעת כסף פלואורסצנטית: טכניקה להמחשת סך החלבון בג'ל פוליאקרילאמיד

סרטון זה מדגים טכניקת הפרדה מבוססת פוליאקרילאמיד דנטורינג עבור חלבונים. טכניקה זו מסייעת בזיהוי ראשוני של חלבונים על בסיס משקלם המולקולרי.

נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח חלבונים: טכניקה להפריד ולדמיין חלבונים על בסיס משקל מולקולרי

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט חלוקה לרמות של פלורסנט חדש מכתים טכניקה לגילוי חלבון סה בג'לים לזיהוי. הפרוטוקול מנצל בדיקה קרינה פלואורסצנטית ספציפיים יון כסף מדליק, אשר מגלה Ag+-חלבון מכלולי ומונע הגבלות מסוימות של כתמי כסף הדפסות כסף מסורתי.

צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

כאן נתאר פרוטוקול עבור שיטה כללית. צ'ייס הדופק המאפשר ניתוח קינטי של קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים להיות בעקבות בתאים חיים.

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

חלבונים חיוניים לפתוגנזה של חיידקים, ומאפשרים פלישה והתחמקות חיסונית. מיצוי חד-שלבי של חלבונים ציטופלזמיים וממברנה של חיידקים בצורתם הפעילה הוא מטריד. מאמר וידאו זה מדגים מיצוי של חלבונים תאיים שלמים של לפטוספירה לניתוח זימוגרפיה לאיתור ואפיון ג'לטינאזות.

מיצוי חד-שלבי וניתוח זימוגרפי של ג'לטינזות חיידקיות

וידאו זה מדגים כל הר אימונוהיסטוכימיה, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של אנטיגן ניתן דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי ג'יין דוד וטום Jessell.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

למד ארבע שיטות מכתים חלבונים ג'ל: Coomassie Blue, כסף, SYPRO Orange ו-SYPRO Ruby. השווה רגישות וקלות שימוש לצורך ויזואליזציה אפקטיבית של חלבונים לאחר אלקטרופורזה.

מכתים חלבונים ג'ל

גלה סרטונים נוספים