Electroporation של mycobacteria

אסטרטגיות פתוגניות מיקובקטריאליות נותרו לא מובנות היטב את קצב הצמיחה האיטי של רוב המינים. האופי הבלתי חדיר של דופן התא והסכנות בעבודה עם פתוגנים מקשים על מחקר מיקובקטריה, והם אחראים במידה רבה להבנה הלקויה שלנו של אורגניזמים אלה. בסרטון זה נדגים את טכניקת האלקטרופורציה, הכוללת הכפפת תאים לדחף חשמלי קצר וגבוה, המאפשר כניסת DNA.

זוהי השיטה הנפוצה ביותר להחדרת DNA לתאים מיקובקטריאליים. היי, אני רון גוד מהמעבדה של טניה פאריש מהמרכז למחלות זיהומיות בעטלפים ובית הספר לרפואה ורפואת שיניים של לונדון. היום נראה לכם נוהל להפעלת מיקרובקטריות אלקטרו.

במעבדה שלנו אנו חוקרים מיקרובקטריום שחפת, אולם מאחר שהוא פתוגני מאוד ודורש מתקני בלימה של C3, נראה לכם את השיטה הזו במיקרובקטריום הלא פתוגני m Mcma. אז בואו נאכל כמה חיידקים. כדי לאכול מיקובקטריה, אנו צריכים לייצר תאים מוכשרים.

חשוב לזכור כי מיקובקטריות פתוגניות מהוות סכנה ביולוגית חשובה. לכן, כל התרבות והמניפולציה הגנטית חייבות להתבצע בהכלה מתאימה. מתקנים בתוך ארון בטיחות מסוג 1 הערכת סיכונים חייבת להוות את החלק הראשון של כל ניסוי עם מיקובקטריות פתוגניות.

כדי להכין אותם, אנו מתחילים בתרבית שנשמרה במעבדה על מדיומים מוצקים כמו למקו, מקדחה חיסון, חמישה מיל למקו המכילים מרק טווין עם לולאה מלאה במיקובקטריה. מאחר שמיקובקטריה רבים גדלים לאט יחסית, חשוב מאוד לשמור על טכניקה אספטית טובה כדי למנוע זיהום של תרביות אלה בחיידקי פטריות שיכולים לגדול במהירות מעבר למיקובקטריה. לעתים קרובות זה חכם להקים תרביות כפולות למקרה שאחד מהם יזדהם.

לתאי מיקובקטריה יש נטייה להתקבץ יחד בתרבית בשל מעטפת השעווה העבה שלהם. מערבולת ותוספת של חומר ניקוי לא יוני כגון מדיום טווין 82 מפחית את הגושים ומספק השעיה הומוגנית יותר של תאים. לאחר החיסון, דגרו את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול במאה סל"ד למשך הלילה.

לאחר שתרבות המתנע גדלה, חסנו תרבית בקנה מידה גדול כמאה מיל למקו בבקבוק חרוטי של 250 מיל עם דילול של 1 עד 100 של תרבית הלילה. המשיכו לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות במשך כ-16 עד 24 שעות, ואז ניתן לבדוק את הצפיפות האופטית באמצעות הספקטרופוטומטר. אם הוא קורא 0.8 לאחד, התאים נמצאים בשלב היומן האופטימלי של הצמיחה שלהם.

לאחר מכן, דגרו את התאים על הקרח במשך 1.5 שעות לפני הקציר, מה שיעזור להגדיל את יעילות הטרנספורמציה פי ארבעה. יותר. דגירה על קרח גורמת ליעילות מופחתת. לאחר מכן, קצרו את התאים על ידי יציקת התרביות לצינורות צנטריפוגה גדולים.

סובב ב -300 גרם למשך 10 דקות לאחר הצנטריפוגה שטפו את התאים שלוש פעמים בקור קרח, 10% גליצרול מפחית את הנפח בכל פעם, כך שעבור נפח תרבית של מאה ארוחות, 20 ארוחות משמשות לשטיפה הראשונה, לאחר מכן 10 מיל ולבסוף חמישה מיל לשטיפה האחרונה. לאחר השטיפות, החייאה משהה את התאים באחד עד 10 עד 10 עד מאה מהנפח המקורי של קור קרח. 10% גליצרול בשלב זה, ניתן להקפיא תאים, להקפיא ולאחסן במינוס 70 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

יעילות הטרנספורמציה עולה לרוב לאחר הקפאת התאים. לפני השימוש בתאים מוכשרים אלה, יש להפשיר אותו, לקצור אותו על ידי צנטריפוגה ולהשעות אותו מחדש בגליצרול טרי של 10% לפני השימוש. על מנת לבצע מצעד אלקטרו, ems mag an electro, שהוא מכשיר שיכול לספק דופק מתח גבוה של 2.5.

משתמשים בקילו-וולט. חיידקים ו- DNA ממוקמים באלקטרופורציה, קובטה. ולמרות שהפער או אורך הנתיב עשויים להיות זהים בקובטות שונות, הם משתנים ביחס לנפח שהם יכולים להכיל.

אנו משתמשים באופן שגרתי ב-200 מיקרוליטר של תאים ב-0.2 סנטימטר כדי לאכול את התאים. ראשית, הכינו את דגימת ה-DNA כך שתהיה נקייה ממלחים ומזהמים אחרים. זה חשוב כדי למזער את הסיכוי לקשת במהלך אלקטרופורציה.

לפני נקבוביות חיידקים, ודא שדגימות ה-DNA שלך הן בטוהר גבוה. יחס הספיגה של שני 60 לשניים 80 צריך להיות קרוב ל-1.8. הוסף 0.5 עד חמישה מיקרוגרם של ה-DNA נטול המלח בנפח של לא יותר מחמישה מיקרוליטר לתרחיף מיקרובקטריאלי של 200 מיקרוליטר, ניתן לכלול אלקטרופורציה בקרה ללא DNA כדי לבדוק את תדירות המוטציות העמידות לאנטיביוטיקה.

לאחר מכן השאירו את התערובת על קרח למשך 10 דקות. זה יפחית את נוכחותם של תאי חיים בדגימה ומלחים בתמיסת ה-DNA, מה שימזער את הקשת לאחר דגירה של הקרח, יפיץ מחדש את התאים ביסודיות עם פיפטה או מערבולת לפני דופק המתח הגבוה כדי להשעות מחדש את התאים ולהבטיח ערבוב של ה-DNA. כל גוש של התאים יוביל לקשתות ויפחית את יעילות הטרנספורמציה.

לאחר מכן, העבירו את התערובת ל-0.2 סנטימטר אלקטרודה מקוררת מראש. שוב, הקפד לא להכניס בועות לתערובת. גם כדי להפחית קשתות.

ודא שהחלק החיצוני של ה-qve יבש לחלוטין לפני הכנסתו לתא הדופק. לאחר ייבוש יסודי של ה-qve וכאשר התנגדות בקר הדופק מוגדרת לאלף אוהם, הנח את ה-qve בתא האלקטרופורציה. לאחר מכן, לאחר הגדרת המתח ל-2.5 קילו-וולט, הפעל את הדופק עד שנשמע צפצוף, המציין שהקבל ב-QVE השתחרר.

קבוע זמן גדול מ-10 יצביע על אלקטרופורציה מוצלחת. אלקטרופורציה לא מוצלחת מסומנת בדרך כלל על ידי קשתות, הגורמות לניצוץ, שלעתים קרובות ניתן להימנע ממנו. על ידי שינוי ההתנגדות בבקר הדופק, החזירו את וטרינר ה-Q לקרח למשך 10 דקות.

לאחר הדגירה, העבירו את תרחיף התאים לבקבוק אוניברסלי סטרילי המכיל חמישה מילים של מרק למקו TW. חשוב לדלל את התאים לפחות פי עשרה מיד לאחר הדופק כדי לעזור לתאים להתאושש ולהגדיל את ההישרדות של הטרנספורמציה. לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש, ואז הם מוכנים לציפוי לאחר הדגירה, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה ב-3000 גרם למשך 10 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, בצע דילול מתאים של ההשעיה במרק למקו כך שכל צלחת תקבל 30 עד 300 מושבות. חשוב לוודא שמושבות עמידות נוצרו מתא בודד, לכן ודא שהתאים מושעים היטב לפני הציפוי. אם התאים אינם מדוללים, זה יכול להיות קשה מאוד לדמיין מושבות עמידות באמת על רקע מדשאה של תאים רגישים מצלחת כעת תאים על מקדחת למקו עם האנטיביוטיקה המתאימה.

הם דוגרים על הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס עד שהמושבות נראות לעין. זה ייקח שלושה עד חמישה ימים לאחר שהמושבות גדלו. ספרו את הטרנספורמציה.

כדי לחשב את יעילות הטרנספורמציה. מספר גורמים משפיעים על יעילות הטרנספורמציה. אלה כוללים את שלב הצמיחה של תאים בעת קצירת אמצעי אלקטרופורציה, וחוזק השדה וקבוע הזמן של הדופק המועבר.

היעילות של טכניקת האלקטרופורציה תלויה גם בבחירת ה-DNA לטרנספורמציה, ולעיתים בבחירת הסמן הניתן לבחירה. אנו משיגים באופן שגרתי יעילות של 10 עד החמישית, עד 10 עד השישית למיקרוגרם, DNA, באמצעות עמידות להיגרומיצין או סטרפטומיצין במאגמה של EMS. עכשיו כדי לגדל את השנאים מפספסים את המיקובקטריות האלקטרופוטריות על מדיום מוצק פלוס ברירה.

אנטיביוטיקה דוגרת ב-37 מעלות למשך יומיים-שלושה. לאחר הדגירה של יומיים-שלושה, אתה יכול לנתח טרנספורמטורים כנדרש עבור רוב היישומים, יש לפלס ולנתח שלושה טרנספורמנטים. חשוב לבדוק את זהותו של פלסמיד כרומוזומלי נוסף לאחר הטרנספורמציה.

מכיוון שמחיקות וסידורים מחדש נפוצים, זה עתה הראיתי לך כיצד לבצע אלקטרוליט של מאגמה של מיקובקטריום. אם אתה מתכוון לבצע הליך זה עם מיקרובקטריות פתוגניות, זכור להשתמש באמצעי בטיחות מתאימים. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.