Name: Electroporation של mycobacteria (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: למדו את פרוטוקול האלקטרופורציה המותאם להעברת DNA לחיידקי mycobacteria דרך דופן התא השעווה שלהם. השיטה מדגימה שימוש ב-Mycobacterium smegmatis ליצירת תאים כשירים ויעילות טרנספורמציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין הצהרות גילוי נחוצות.

electroporation של mycobacteria

Electroporation of Mycobacteria

שינוי יעילות גבוהה היא מגבלה עיקרית במחקר של mycobacteria. Mycobacterium הסוג יכול להיות קשה לשנות, זו נגרמת בעיקר על ידי קיר התא עבה דונגי, אך מורכב על ידי העובדה בטכניקות מולקולריות ביותר פותחו זנים בריחוק הקשורים כגון Escherichia coli ו - Bacillus subtilis. למרות המכשולים הללו, פלסמידים mycobacterial זוהו שינוי ה-DNA של מינים רבים mycobacterial עכשיו תוארו. השיטה המוצלחת ביותר עבור החדרת דנ&quot;א לתוך mycobacteria הוא electroporation. פרמטרים רבים לתרום טרנספורמציה מוצלחת; אלה כוללים את המין / זן, טבעו של ה-DNA להפוך, את הסמן לבחירה בשימוש, המדיום הצמיחה, את התנאים הדופק electroporation. שיטות אופטימיזציה עבור הפיכתה של שניהם איטי ואת המגדל מהיר מפורטים כאן. יעילות טרנספורמציה עבור mycobacterial מינים שונים לבחירה עם סמנים שונים מדווחים.

אסטרטגיות פתוגניים Mycobacterial להישאר ממעטים להבין. קצב הצמיחה האיטי ביותר של מינים, אופי בלתי חדיר של קיר התא, ואת הסכנות של עבודה עם פתוגנים לעשות mycobacteria קשה ללמוד אחראים במידה רבה להבנת העניים שלנו של אורגניזמים אלה. בסרטון זה נדגים את הטכניקה של electroporation, הכוללת תאים העמדת לדחף קצר חשמלי גבוה על מנת לאפשר את כניסתם של ה-DNA. זוהי השיטה הנפוצה ביותר עבור החדרת דנ&quot;א לתוך תאים mycobacterial.

Electroporation של mycobacteria

טרנספורמציה בעלת יעילות גבוהה היא מגבלה מרכזית בחקר המיקובקטריה. ניתן להתקשות בביצוע טרנספורמציה לשבט Mycobacterium; הדבר נובע בעיקר מ...

האסטרטגיות הפתוגניות של מיקובקטרים נותרו לא פחות ממעט מובנות בשל קצב הגדילה האיטי של מרבית המינים. טבעה הבלתי חדיר של דופן התא והסיכונים הכרוכים בעבודה עם פתוגנים הופכים את המיקובקטרים לקשים למחקר, והם האחראים העיקריים להבנה הדלה שלנו לגבי אורגניזמים אלו. בסרטון זה, נדגים את טכניקת האלקטרופורציה, הכוללת חשיפת תאים לדחף חשמלי קצר ועוצמתי, המאפשר חדירה של DNA.זוהי השיטה הנפוצה ביותר להחדרת DNA לתאי מיקובקטריה. שלום, אני רון גוד מהמעבדה של טניה פריש מהמרכז למחלות זיהומיות בבית החולים ובבית הספר לרפואה ולשחוד בלונדון. היום נראה לכם פרוטוקול לאלקטרופורציה של מיקובקטריה.במעבדתנו אנו חוקרים את microbacterium tuberculosis, אך מכיוון שהוא פתוגני מאוד ודורש מתקני הכלה ברמת C3, נדגים לכם טכניקה זו באמצעות microbacterium m Mcma שאינו פתוגני. אם כן, בואו נבצע אלקטרופורציה לחלק מהחיידקים. כדי לבצע אלקטרופורציה למייקובקטוריות, עלינו להכין תאים קומפטנטיים.חשוב לזכור כי מיקובקטריות פתוגניות מהוות סיכון ביולוגי משמעותי. לפיכך, יש לבצע את כל פעולות התרבית והמניפולציה הגנטית בסביבת הכלה מתאימה. מתקנים בתוך קבסי בטיחות (safety cabinet) ברמה 1. הערכת סיכונים חייבת להוות את השלב הראשון של כל ניסוי עם מיקובקטריות פתוגניות.כדי להכין אותם, נתחיל בתרבית שנשמרה במעבדה על מצעים מוצקים כגון lemko, auger inoculate, חמישה מיליליטר של Lemko המכיל tween broth עם לולאה מלאה ב-mycobacteria. מכיוון ש-mycobacteria רבים הם אורגניזמים בעלי גדילה איטית יחסית, חשוב מאוד לשמור על טכניקת עבודה אספטית טובה כדי למנוע זיהום של תרביות אלו בחיידקים או פטריות שיכולים לגדול במהירות רבה יותר מה-mycobacteria. לעיתים קרובות מומלץ להכין תרביות כפולות למקרה שאחת מהן תהפוך למזוהמת.לתאי Mycobacteria יש נטייה להתגושש בתרבית בשל המעטפת השומנית העבה שלהם. ערבוב בורטקס (Vortexing) והוספה של דטרגנט לא-יוני, כגון tween 82 medium, מפחיתים התגוששות זו ומספקים סספנסיה הומוגנית יותר של תאים. לאחר ההזרקה, דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור במהירות של 100 RPM למשך הלילה.לאחר שתרבית ההתנעה גדלה, חסנו תרבית בקנה מידה גדול של כ-100 ml של lemko tw בבקבוק קוני בנפח 250 ml, באמצעות דילול של 1:100 של התרבית מהלילה הקודם. המשיכו בדגירה בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור למשך כ-16 עד 24 שעות, ובשלב זה ניתן לבדוק את הצפיפות האופטית באמצעות ספקטרופוטומטר. אם הקריאה היא בין 0.8 ל-1, התאים נמצאים בשלב ה-log האופטימלי של הצמיחה.לאחר מכן, דגרו את התאים על קרח למשך 1.5 שעות לפני הקציר, דבר שיסייע להגדיל את יעילות הטרנספורמציה פי ארבעה. דגירה ממושכת יותר על קרח תביא לירידה ביעילות. לאחר מכן, קצרו את התאים על ידי מזיגת התרביות לתוך מבחנות צנטריפוגה גדולות.סובב במהירות של 300 Gs למשך 10 דקות. לאחר סבוב הצנטריפוגה, שטוף את התאים שלוש פעמים ב-10% glycerol קר בקרח, תוך הפחתת הנפח בכל פעם; כך שעבור נפח תרבית של 100 mL, השתמש ב-20 mL לשטיפה הראשונה, לאחר מכן ב-10 mL ולבסוף ב-5 mL לשטיפה האחרונה. לאחר השטיפות, השעה מחדש את התאים בנפח של 1:10 עד 1:100 מהנפח המקורי של 10% glycerol קר בקרח. בשלב זה, ניתן לחלק את התאים לאליקוטים, להקפיא אותם ולאחסנם בטמפרטורה של 70- °C לשימוש עתידי.יעילות הטרנספורמציה עולה לרוב לאחר הקפאת התאים. לפני השימוש בתאים קומפטנטיים אלו, יש להפשיר אותם, לאסוף אותם על ידי סנטריפוגציה ולסספנד אותם מחדש בגליצרין טרי בריכוז 10% לפני השימוש. על מנת לבצע אלקטרופורזה, יש להשתמש באלקטרופורטור, מכשיר המסוגל לספק פולס במתח גבוה של 2.5.נעשה שימוש בקילו-וולטים. חיידקים ו-DNA מונחים בקוביות אלקטרופורציה (cuvettes). ואף על אף שרווח הפער או אורך המסלול עשויים להיות זהים בקוביות שונות, הם משתנים ביחס לנפח שהן יכולות להכיל.אנו משתמשים באופן שגרתי ב-200 µL של תאים ב-0.2 cm qve כדי להגביר את התאים. ראשית, יש להכין את דגימת ה-DNA כך שתהיה נקייה ממלחים וממזהמים אחרים. דבר זה חשוב כדי למזער את הסיכוי להיווצרות קשת חשמלית במהלך electroporation.לפני ביצוע הפורציה של החיידקים, ודא שדגימות ה-DNA שלך הן בדרגת טוהר גבוהה. יחס הספיגה של 260 ל-280 צריך להיות קרוב ל-1.8. הוסף 0.5 עד 5 µg של DNA נטול מלחים, בנפח שאינו עולה על 5 µL, ל-200 µL של תרחף חיידקים. ניתן לכלול בקרת אלקטרופורציה ללא DNA כדי לבדוק את שכיחותם של מוטנטים העמידים לאנטיביוטיקה.לאחר מכן, השאירו את התערובת על קרח למשך 10 דקות. פעולה זו תפחית את נוכחות התאים החיים בדגימה ואת כמות המלחים בתמיסת ה-DNA, ובכך תמזער את התופעה של פריצת זרם (arcing) לאחר הדגירה על קרח; פזרו מחדש את התאים ביסודיות באמצעות פיפטה או וורטקס לפני פולס המתח הגבוה כדי להשעות מחדש את התאים ולהבטיח ערבוב של ה-DNA. כל התגבשות של התאים תוביל לפריצת זרם ותפחית את יעילות הטרנספורמציה.בשלב הבא, העבירו את התערובת לתא אלקטרודות (electrode gab qve) של 0.2 centimeter שקולל מראש. שוב, הקפידו שלא להחדיר בועות אוויר לתערובת. זאת גם כדי להפחית את היווצרות הקשתות החשמליות.יש לוודא שהחלק החיצוני של ה-qve יבש לחלוטין לפני השמתו בתא הפולסים. לאחר ייבוש יסודי של ה-qve, וכאשר התנגדות בקר הפולסים מוגדרת לאלף אוהם, יש להניח את ה-qve בתא האלקטרופורציה. לאחר מכן, הגדירו את המתח ל-2.5 kilovolts והפעילו את הפולס עד שנשמע צליל ביפ, המעיד על כך שהקבל ב-QVE התרוקן.קבוע זמן הגבוה מ-10 יעיד על הצלחת האלקטרופורציה. אלקטרופורציה שלא הצליחה מתאפיינת בדרך כלל בקשת חשמלית הגורמת לניצוץ, דבר שניתן לעיתים קרובות למנוע. על ידי שינוי ההתנגדות בבקר הפולסים, החזירו את ה-Q vet לקרח למשך 10 דקות.לאחר האינקובציה, העבירו את תרחיף התאים לבקבוק אוניברסלי סטרילי המכיל five mils של lemko TW broth. חשוב לדלל את התאים לפחות פי עשרה מיד לאחר הפולס כדי לסייע לתאים להתאושש ולהגביר את שרידות הטרנספורמנטים. לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים עד שלוש שעות, ואז הם מוכנים לזריעה במונחים של פלטות; לאחר האינקובציה, קצרו את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-3000 ×g למשך 10 דקות.לאחר הצנטריפוגציה, בצעו דילול מתאים של התרחוף במצע lemko כך שכל צלחת תקבל בין 30 ל-300 מושבות. חשוב לוודא כי מושבות עמידות נוצרו מתא בודד, לכן יש לוודא שהתאים הושעו מחדש באופן יסודי לפני הפריסה. אם התאים לא יודללו, עלול להיות קושי רב להבחין במושבות עמידות באמת על רקע של "מדשאה" (Lawn) של תאים רגישים. כעת פרסו את התאים על מצע lemko agar עם האנטיביוטיקה המתאימה.מדגרי את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C עד להופעת מושבות. תהליך זה יארך שלושה עד חמישה ימים לאחר צמיחת המושבות. ספור את התרבויות שעברו טרנספורמציה.בחישוב יעילות הטרנספורמציה. מספר גורמים משפיעים על יעילות הטרנספורמציה, וביניהם שלב הצמיחה של התאים בעת הקצירה, מצע האלקטרופורציה, ועוצמת השדה וקבוע הזמן של הפולס המועבר.היעילות של טכניקת האלקטרופורציה תלויה גם בבחירת ה-DNA לטרנספורמציה, ולעיתים בבחירת הסמן לברירה (selectable marker). אנו מקבלים באופן שגרתי יעילות של 10⁵ עד 10⁶ מושבות למיקרוגרם DNA, תוך שימוש בעמידות להיגרומיצין או לסטרפטומייצין ב-ems magma. כעת, כדי לגדל את הטרנספורמנטים, יש לזרוע את המיקובקטריה שעברו אלקטרופורציה על מצע מוצק בתוספת סלקציה.דגירה עם אנטיביוטיקה בטמפרטורה של 37 °C למשך יומיים עד שלושה ימים. לאחר דגירה של יומיים עד שלושה ימים, ניתן לנתח את הטרנספורמנטים בהתאם לדרישות רוב היישומים; יש לבצע מריחה (streaking) וניתוח של שלושה טרנספורמנטים. חשוב לאמת את זהות הפלסמיד חוץ-כרומוזומלי לאחר הטרנספורמציה.מאחר שמחיקות וסידורים מחדש הן שכיחות, הרגשתי להראות לכם כיצד לבצע אלקטרוליזה ל-mycobacterium s magma. אם אתם מתכוונים לבצע הליך זה עם מיקרובקטריות פתוגניות, זכרו להשתמש באמצעי בטיחות מתאימים. וזה הכל.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Stefan, A., et al., היתרונות הרב-צדדיים של ביטוי משותף של חלבון ב-Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את ההליך להפיכת Escherichia coli עם פלסמיד הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה, כולל הכנת תאים, אלקטרופורציה, התאוששות ובחירת טרנספורמציה.

הכנה וטרנספורמציה של חיידקים באמצעות אלקטרופורציה במתח גבוה

Electroporation הוא שיטה הנפוצה מועסק להחדרת DNA לחיידקים בתהליך המכונה טרנספורמציה. פרוטוקולים מסורתיים להכנת תאי electrocompetent הם זמן רב ועבודה אינטנסיבית. מאמר זה מתאר חלופי, מהיר, ושיטה יעילה להכנת תאי electrocompetent מועסקים כיום על ידי כמה מעבדות.

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

אלקטרופורציה שימשה להחדרת חלבוני אפקטור אלימות חיידקים מטוהרים ישירות לתאים אוקריוטיים חיים. לוקליזציה של חלבונים נוטרה על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת מחקרים על סחר, תפקוד ואינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות חלבונים אקסוגניים פעילים, ומונעת את הצורך בביטוי הטרולוגי בתאים אוקריוטיים.

Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים

פרוטוקול זה מתאר את טכניקות המיקרו-פבריקציה הנדרשות לבניית התקן אלקטרופורציה מיקרופלואידי במעבדה על שבב. מערך הניסוי מבצע טרנספקציות מבוקרות ברמת תא בודד בזרימה רציפה וניתן להרחיב אותן לתפוקות גבוהות יותר עם בקרה מבוססת אוכלוסייה. ניתן ניתוח המציג את היכולת לעקוב באופן חשמלי אחר מידת החדירה של קרום התא בזמן אמת.

ייצור והפעלה של זרימה רציפה, מערכת מיקרו-אלקטרופורציה עם זיהוי חלחול

פרוטוקול זה מתאר כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל, טכניקה ניתנת לשחזור להעשרת בועיות חוץ-תאיות של Mycobacterium tuberculosis מסופרנטים של תרביות.

מיקובקטריום שחפת העשרת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמידי לתוך שרירי השלד היא שיטה בת קיימא לווסת ביטוי גנים מבלי להתפשר על התכווצות השרירים בעכברים.

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר

פרוטוקול זה מפרט את ההעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (mEVs) מקוריות מתרביות אקסניות של Mycobacterium smegmatis (Msm) וכיצד ניתן לתכנן ולהעשיר MsmEV רקומביננטי המכיל mCherry (כתב פלואורסצנטי אדום). לבסוף, הוא מאמת את הגישה החדשנית עם העשרה של MsmEV המכילים את חלבון EsxA של Mycobacterium tuberculosis.

העשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות ורקומביננטיות של מיקובקטריה

אנו מתארים הליך קל להשלמה כרומוזומלית בעותק יחיד של גן משאבת אפלוקס באמצעות מערכת ביטוי מבוססת מיני Tn7 לזן מהונדס חסר אפלוקס של Acinetobacter baumannii. כלי גנטי מדויק זה מאפשר ביטוי גנים מבוקר, שהוא המפתח לאפיון משאבות אפלוקס בפתוגנים עמידים לתרופות רבות.

אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-CTAB לחילוץ DNA איכותי ממיקובקטריה, תוך התמודדות עם האתגרים שמציבים דפנות התאים הקשות והעשירות בחומצה המיקולית. התהליך כולל עיכול אנזימטי, פירוק תאים באמצעות CTAB, וטיהור DNA באמצעות הפקה אורגנית והשקעת אתנול. שיטה זו מייצרת DNA המתאים למחקרים מולקולריים ואמינה למחקר מיקובקטריאלי.

הפקת חומצה דאוקסיריבונוקלית בגנום מלא ממיני מיקובקטריום באמצעות טכניקת Cetyltrimethylammonium Bromide

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של Mycobacterium tuberculosis המאושר על ידי BSL-2 מוחלש. מאמץ בריאה העכברית באמצעות חלון ריאה קבוע. גישה זו מאפשרת ניתוח אורך ברזולוציה תאית אחת של אינטראקציות מוקדמות בין מארח לפתוגן, כולל מיקום חיידקים, דינמיקת כלי דם וספיגת מקרופאגים באותה מיקרוסביבה ריאתית.

הדמיה תוך-חיונית של מיקובקטריום טוברקולוזיס אוקסוטרופי מוחלש בריאות עכברי במהלך זיהום תוך-כלי מוקדם

למדו את פרוטוקול האלקטרופורציה המותאם להעברת DNA לחיידקי mycobacteria דרך דופן התא השעווה שלהם. השיטה מדגימה שימוש ב-Mycobacterium smegmatis ליצירת תאים כשירים ויעילות טרנספורמציה גבוהה.

Electroporation של mycobacteria

גלה סרטונים נוספים