עכבר עוריות עצבית קרסט לתאי גזע (EPI-NCSC) תרבויות

שלום, אני מאיה סיבו בלום מהמכון לגנטיקה אנושית ומכון תאי הגזע של צפון-מזרח אנגליה באוניברסיטת ניוקאסל. וזה מהקולג' הרפואי של ויסקונסין. היום נראה לכם את הפרוצדורה שלנו להכנת Explant של אל מתוך זקיקי השערה של עכברים.

הפנים של בקר הן רקמת המוצא להכנת תרביות של תאי גזע של רשת העצבים האפידרמלית. הליך זה כולל דיסקציה של אזור השפם ומיקרו-דיסקציה של זקיקי השיער, ולאחר מכן בידוד של ה-BULs והצבתם בצלחת תרבית. אז בואו נתחיל.

הליך זה מתחיל בדיסקציה של הבולג' (bulge) מזקיקי שערות (whisker follicles) של עכברים בוגרים. בדרך כלל, אנו משתמשים בעכברים בני חודשיים עד שישה חודשים, עם זאת, עכברים צעירים יותר נוטים להניב יותר תאי גזע. החיות עוברות חיטוי על ידי טבילה מלאה בתערובת של יחס אחד לאחד של Betadine ומי חמצן למשך כשלוש דקות, לאחר מכן מרססים את העכבר כולו, ובמיוחד את אזור הפנים, ב-75% ethanol ומעבירים את העכבר למיקרוסקופ הדיסקציה.

בתוך מabilis הזרימה הלמינרית, השקיפו בזהירות את רפידות ה-WHI, תוך הימנעות מחיתוך של בסיסי השערה, והניחו אותן בתמיסת מלח מאוזנת (HBSS) בטמפרטורת החדר. כדי לבודד זקיקי שערה של WHI, החזיקו את העור לצד הזקיק בעזרת פינצטה ולאחר מכן גזרו מסביב לזקיק בעזרת מספריים ישרים. גזרו עמוק.

כדי למנוע פגיעה בבצילוני השערה, הרים את זקיק השפם מתוך רפידת השפמים והעבר אותו לפלטה חדשה. בעזרת HBSS טרי, משוך את הזקיקים באותה הפלטה. הצמד זקיק שערה באמצעות פינצטה מחודדת ומחטים אל צלחת פטרי מזכוכית מצופה במגן משי המכילה HBSS.

שטפו רקמה שומנית רופפת ורקמה דרמלית בעזרת זריקות של בופר עד שזקיק השערה (whisker follicle) יהיה נקי. במידת הצורך, חתכו את העצב המוביל לזקיק השערה והסִירו רקמה דביקה על ידי גירוד ושטיפות חוזרות של HBSS. חתכו את זקיק השערה לאורכו באמצעות מיקרו-להב.

הימנעו מחיתוך עמוק מדי, שכן הדבר יפגע בבלט. הסירו כל דם באמצעות שטיפות חוזרות של HBSS עד להסרתו המלאה. הופעת דם מהווה אינדיקציה טובה לכך שהחיתוך היה עמוק מספיק.

בשלב הבא, בצעו חיתוך רוחבי מעל גובה הסינוס של ה-coness ולאחר מכן חיתוך רוחבי שני בגובה הסינוס הטבעתי, קרוב מאוד לעור בתוך חתיכת הזקיק המבודדת. כעת תוכלו לראות את הבליטה בתוך הקפסולה. ראו, הנה היא.

תפוס קצה של הקפסולה באמצעות הפינצטה והסר את הבליטה. כעת תראה את הקפסולה הריקה ואת מאגר הבליטות המבודדות. העבר את הבליטות המבודדות לפלטת תרבית נפרדת המכילה HBSS בטמפרטורת החדר.

יש לוודא שאין רקמות אחרות המזהמות את הבליטות המאוגדות. בשלב זה, ניתן לגדל את צמחי הבליטות לפני התרבית בצמחי In bul. פלטות תרבית של 35 מילימטר מצופות בקולגן על ידי הנחת טיפות של 50 microliter קולגן ו-10 microliter סטרילי.

6%saline אחד ליד השני. ערבבו היטב באמצעות פיפט פוסטר כפולה וכופופה ודחפו לעבר קצה פלטת התרבית. הדגירו ללילה בסביבה נקייה אך אל תתנו לזה להתייבש. למטרה זו אנו משתמשים במייבש עם פלטת מים בתחתית.

ביום למחרת, יום התרבית. שטפו את הצלחות בתמיסת סלין, והדגירו את צלחות התרבית המצופות בקולגן והשטופות במקדם דגירה למשך כשלוש שעות בתוך מצע גידול באינקובטור; מצע הגידול מורכב מ-85% alpha modified MEM, 10% fetal bovine serum ו-5% תמצית עוברי אפרוחים מיום 11.

לאחר דגירה מקדימה, הסירו את מצע התרבית מהצלחות והוסיפו מספר BULs עם כמות מינימלית של מצע. הסירו עודפי מצע תרבית. דגרו למשך שעה אחת באינקובטור תאים באטמוספירה לחית עם 10%oxygen ו-5%CO2.

לאחר שעה, הוסיפו באיטיות 1.5 milliliter של תרבית. תאי CHE צריכים להיצמד לתת-המצע של ה-collagen; החליפו 50% ממצע התרבית מדי יום. אוקיי, עכשיו בואו נתחיל.

כעת נבחן את התרביות. בתוך שלושה עד ארבעה ימים, תאים בעלי יכולת נדידה גבוהה יגרו מהבאל-צ'קס (ball checks). שימו לב למורפולוגיה הכוכבית שלהם ולהיעדרם הבולט של מגעים בין-תאיים.

במהלך הימים הבאים, תאים נוספים יגרים ותאים שהגריו יתרבו במהירות; תאים נדירים וחשובים בעלי מורפולוגיה שטוחה, שהופכים גלויים לעיתים מספר ימים לאחר ה-epidermal neuro crest. תאי גזע נראים לעיתים בתרביות אלו. תאים אלו אינם תאי גזע של epidermal neuro crest, אלא הם תאי גזע אפידרמליים משוערים או תאי פרוגניטור בעלי ניידות נמוכה יותר; יש להשליך תרביות המורכבות מתאים אלו.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין תרביות של שתלי בולג' (bulge explant) המכילות תאי גזע עצביים אפידרמליים. מכיוון שתאי גזע עצביים הם בעלי יכולת נדידה גבוהה, הם יעזבו את שתל הבולג' תוך שלושה עד ארבעה ימים. לאחר השתלה, הסרנו את הבולג', ואוכלוסייה טהורה של תאי גזע עצביים נשארת בצלחת התרבית.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לחטא את העכבר בקפידה כדי למנוע זיהום. כמו כן, יש לחתוך לעומק בבסיס הכף כדי לא לפגוע בזקיקים. בכל הנוגע לתרביות, חשוב להבחין בין התמצית הנדידה, תאי הרכס העצבי (neural crest cells), והקרטינוציטים שאינם נדידים בעלי מבנה של "cobblestone".

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.