Name: עכבר עוריות עצבית קרסט לתאי גזע (EPI-NCSC) תרבויות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-09T01:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: למד שיטה לבידוד תאי גזע עצביים מכרסת עורית (EPI-NCSC) מזקיקי שפם בעכברים באמצעות מיקרו-ניתוח והשתלת בליטה בתרבית. תאים נודדים תוך 3-4 ימים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי: USPHS מענק NS38500, המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, NIH, ארה&quot;ב; הברית ביו טכנולוגיה של מזרח ויסקונסין, Milwauke, וויסקונסין, ארה&quot;ב; Bryon Riesch שיתוק קרן מילווקי, וויסקונסין, ארה&quot;ב; סדר אחווה של הנשרים, פרק התיכון , ארה&quot;ב; הלאומי פגיעה בחוט השדרה האגודה, פרק במילווקי, ארה&quot;ב, צפון מזרח אנגליה לתאי גזע המכון, אוניברסיטת ניוקאסל, אנגליה.

Dissection הבליטה של ​​זקיקי השערה למבוגרים עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים 10 שבועות עד 6 חודשים עכברים ישנים. עכברים צעירים לעתים קרובות להניב יותר תאים. עכבר להרדים בעלי חיים לצלול לתוך התערובת כולה 01:01 של בבטאדין (פתרון יוד) ואת מי חמצן (זמין בתי מרקחת) למשך כ 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר Squirt כולו, במיוחד באזור הפנים, עם 75% אתנול, ולבצע העכבר כדי מיקרוסקופ לנתיחה במנדף זרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח רפידות זיף, נמנע מלהביט אל תוך חיתוך פקעות שיער, בריכה HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח זקיקי השערה ואת הבריכה HBSS בטמפרטורת החדר. לעשות זאת על ידי החזקת העור ליד זקיקי השיער עם מלקחיים, ולאחר מכן חיתוך סביב זקיק עם מספריים ישר. גזור עמוק כדי למנוע פציעה של נורות השיער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם זקיק השערה מתוך פנקס זיף והכניסו צלחת חדשה עם HBSS טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש adipous רפוי רקמות עורי עם מתיז של חיץ, עד זקיקי השערה נקיות. במידת הצורך, לחתוך החוצפה זקיק השערה ולהסיר רקמה חסיד באמצעות גירוד גלי חוזרות ונשנות של HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פין follilce שיער נקי על צלחת Sylgard מצופה זכוכית פטרי באמצעות מחטים טונגסטן חידד, באמצעות microforceps עבור ולהחזיק בחלק העור ליד הזקיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור זקיק השערה longitudically עם microblade. הימנע חיתוך עמוק מדי, כמו זה יהיה לפגוע בליטה. הסר הדם משפריץ חוזרות ונשנות של HBSS עד נעלם. מראה של דם היא אינדיקציה טובה כי לחתוך היה עמוק מספיק. אם לחתוך longitudial אינו ארוך מספיק, זה עשוי להיות מוארך עם microscissors כפופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך רוחבי מעל לרמה של הסינוס החלול ולאחר מכן חתך רוחבי השני ברמת בתוך בסינוסים את הטבעת, קרוב לעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת תראה את הבליטה בתוך הקפסולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס קץ של קולגן כדי הקפסולה עם מלקחיים ו לרדד את הבליטה באמצעות מחט טונגסטן כפופות. כעת תראה את הקפסולה ריק את הבליטה מבודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת מבודד בליטות צלחת תרבות נפרדת HBSS בטמפרטורת החדר. ודא שאין רקמות אחרות היא זיהום בליטות ונקווה. </li></ol> תרבות Explants בליטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל 35 מ&quot;מ תרבות צלחות עם קולגן על ידי הצבת 50 μl קולגן ו 10 μl NaCl 6% סטרילי אחד ליד השני. מערבבים היטב עם pipet Pasteyr פעמיים כפוף לדחוף לכיוון שולי הצלחת התרבות. דגירה לילה dessicator נקי, אבל לא נותנים יבש. לפני השימוש, יש לשטוף את הצלחות עם מי מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום דגירה תרבות צלחות קולגן מצופה ושטף של כ 3 שעות עם המדיום לתרבות. בינוני תרבות מורכבת של 85% אלפא שונה מ, 10% בסרום שור העובר 5% 11 יום חומוס לחלץ העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה מחדש, להסיר בינוני תרבות מהצלחות ולהוסיף בליטות עם מספר בינוני כמה שפחות. הסר בינוני תרבות עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 1, אבל לא יותר, בתא האינקובטור באווירה humidified עם חמצן 10% ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, בעדינות להוסיף 1.5 מ&quot;ל של מדיום תרבות. Explants הבליטה צריך לדבוק לתשתית קולגן. החלף 50% של המדיום תרבות יומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך 3 - 4 ימים, התאים לנדוד יהיה להגר מן explants בליטה. הערה מורפולוגיה stellate שלהם, תנועתיות, והיעדר בולט של תאים תאים קשר. במהלך הימים הקרובים, יותר תאים יהיה להגר, והיגר התאים יתרבו במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת בליטה 2-3 ימים לאחר תחילתה של הגירה EPI-NCSC עם מחט טונגסטן חידד. אם בליטות נשארים זמן רב יותר, הם נוטים לשטח ולעשות את זה אי אפשר להשיג טהור EPI-NCSC תרבויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב: תאים נדירים עם מורפולוגיה שטוח, אשר יתברר לפעמים כמה ימים מאוחר יותר EPI-NCSC, ואלו פחות ניעתי הם לא EPI-NCSC, אבל המשוערת בתאי גזע אפידרמיס / אבות. תרבויות המורכב של התאים האלה, או תרבויות מעורבות המכילות EPI-NCSC ו המשוערת בתאי גזע אפידרמיס / אבות צריכים להיות מבוטלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמז: אין לשמור את התאים במשך זמן רב מדי במדיום explant העיקרי, כפי שהם נוטים להבחין במהירות על צפיפות התאים גבוהה, לכאורה בשל איתות autocrine / אוטוקריני גורם הגדילה. </li></ol>

<ol><li>Sieber-Blum, M., Grim, M., YF, H. u, Szeder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+neural+crest+stem+cells+in+the+adult+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle.</a> Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Grim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+hair+follicle+-+cradle+for+pluripotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+%28Part+C%29%22%5BJournal%5D)">The adult hair follicle - cradle for pluripotent neural crest stem cells.</a> Birth Defects Research (Part C). Tuan, R., Grim, M. 72, 162-172 (2004).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Schnell, L., Grim, M., Schneider, R., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+epidermal+neural+crest+stem+cell+%28EPI-NCSC%29+grafts+in+the+lesioned+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Pub%22%5BJournal%5D)">Characterization of epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) grafts in the lesioned spinal cord.</a> Pub. 32, 67-81 (2006).</li>
<li>Hu, Y. F., Zhang, Z. -J., Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidermal+neural+crest+stem+cell+%28EPI-NCSC%29+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) molecular signature.</a> Stem Cells. 24, Epub ahead of print 2692-2702 (2006).</li>
</ol>

בזכות יכולת הנדידה שלהם, EPI-NCSC ניתן לבודד כאוכלוסייה טהור מאוד בתאי גזע, אשר ניתן להרחיב במבחנה. כמו שרידים עובריים במיקום מבוגר, EPI-NCSC הם מועמדים אטרקטיבית פוטנציאלית לעתיד החלפת טיפולים התא, הנדסה ביו ו / או רפואה רגנרטיבית. בדקנו EPI-NCSC במודל של עכברים של פגיעה בחוט השדרה, שם הם מראים תכונות רצויות. באמצעות פרופיל גנטי ביטוי על ידי LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / גיאו, מספר סדרה GSE4680) הראינו כי, כצפוי, תאים עובריים עצביים לפסגה EPI-NCSC חולקים גנים דומים ביטוי דפוס שונה מזו של השכן בתאי...

עכבר עוריות עצבית קרסט לתאי גזע (epi-ncsc) תרבויות

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC הם שרידי רכס עובריים עצביים במיקום מבוגר, את הבליטה של ​​זקיקי השיער. הם בתאי גזע multipotent כי יש את המאפיין הפיזיולוגי ליצור מגוון רחב של סוגי תאים מובחנים, כולל נוירונים, תאים תומכים עצב, לתאי שריר חלק, עצם / סחוס תאים מלנוציטים. EPI-NCSC נגישים בקלות בעור שעיר ניתן לבודד כאוכלוסייה טהור מאוד בתאי גזע. וידאו זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת עכבר EPI-NCSC תרבויות מן זקיקי השערה. כרית זיף של עכבר בוגר מוסר, ועל זקיקי השערה גזור. זקיקים הם ואז לחתוך longitudinally ובהמשך רוחבי מעל ומתחת לאזור בליטה. בליטה יוסר הקפסולה קולגן להציב צלחת תרבות. EPI-NCSC להתחיל להגר מן explants בליטה 3 עד 4 ימים מאוחר יותר.

כאן אנחנו מראים השיטה שלנו לבודד אפידרמיס עכבר לתאי גזע עצביים לפסגה (EPI-NCSC). טכניקה מערבת מיקרו לנתח זקיקי השערה, בידוד בליטה ו placeing אותו בתרבית רקמה. EPI-NCSC להתחיל להגר explants בליטה על גבי תשתית בתוך 3-4 ימים.

עכבר עוריות עצבית קרסט לתאי גזע (EPI-NCSC) תרבויות

EPI-NCSC הם שרידים של הרבד העצבי העוברי במיקום בוגר, הבליטה של זקיקי השיער. אלו הם תאי גבעול רב-פוטנציאליים בעלי ה...

שלום, אני מאיה סיבו בלום מהמכון לגנטיקה אנושית ומכון תאי הגזע של צפון-מזרח אנגליה באוניברסיטת ניוקאסל. וזה מהקולג' הרפואי של ויסקונסין. היום נראה לכם את הפרוצדורה שלנו להכנת Explant של אל מתוך זקיקי השערה של עכברים.הפנים של בקר הן רקמת המוצא להכנת תרביות של תאי גזע של רשת העצבים האפידרמלית. הליך זה כולל דיסקציה של אזור השפם ומיקרו-דיסקציה של זקיקי השיער, ולאחר מכן בידוד של ה-BULs והצבתם בצלחת תרבית. אז בואו נתחיל.הליך זה מתחיל בדיסקציה של הבולג' (bulge) מזקיקי שערות (whisker follicles) של עכברים בוגרים. בדרך כלל, אנו משתמשים בעכברים בני חודשיים עד שישה חודשים, עם זאת, עכברים צעירים יותר נוטים להניב יותר תאי גזע. החיות עוברות חיטוי על ידי טבילה מלאה בתערובת של יחס אחד לאחד של Betadine ומי חמצן למשך כשלוש דקות, לאחר מכן מרססים את העכבר כולו, ובמיוחד את אזור הפנים, ב-75% ethanol ומעבירים את העכבר למיקרוסקופ הדיסקציה.בתוך מabilis הזרימה הלמינרית, השקיפו בזהירות את רפידות ה-WHI, תוך הימנעות מחיתוך של בסיסי השערה, והניחו אותן בתמיסת מלח מאוזנת (HBSS) בטמפרטורת החדר. כדי לבודד זקיקי שערה של WHI, החזיקו את העור לצד הזקיק בעזרת פינצטה ולאחר מכן גזרו מסביב לזקיק בעזרת מספריים ישרים. גזרו עמוק.כדי למנוע פגיעה בבצילוני השערה, הרים את זקיק השפם מתוך רפידת השפמים והעבר אותו לפלטה חדשה. בעזרת HBSS טרי, משוך את הזקיקים באותה הפלטה. הצמד זקיק שערה באמצעות פינצטה מחודדת ומחטים אל צלחת פטרי מזכוכית מצופה במגן משי המכילה HBSS.שטפו רקמה שומנית רופפת ורקמה דרמלית בעזרת זריקות של בופר עד שזקיק השערה (whisker follicle) יהיה נקי. במידת הצורך, חתכו את העצב המוביל לזקיק השערה והסִירו רקמה דביקה על ידי גירוד ושטיפות חוזרות של HBSS. חתכו את זקיק השערה לאורכו באמצעות מיקרו-להב.הימנעו מחיתוך עמוק מדי, שכן הדבר יפגע בבלט. הסירו כל דם באמצעות שטיפות חוזרות של HBSS עד להסרתו המלאה. הופעת דם מהווה אינדיקציה טובה לכך שהחיתוך היה עמוק מספיק.בשלב הבא, בצעו חיתוך רוחבי מעל גובה הסינוס של ה-coness ולאחר מכן חיתוך רוחבי שני בגובה הסינוס הטבעתי, קרוב מאוד לעור בתוך חתיכת הזקיק המבודדת. כעת תוכלו לראות את הבליטה בתוך הקפסולה. ראו, הנה היא.תפוס קצה של הקפסולה באמצעות הפינצטה והסר את הבליטה. כעת תראה את הקפסולה הריקה ואת מאגר הבליטות המבודדות. העבר את הבליטות המבודדות לפלטת תרבית נפרדת המכילה HBSS בטמפרטורת החדר.יש לוודא שאין רקמות אחרות המזהמות את הבליטות המאוגדות. בשלב זה, ניתן לגדל את צמחי הבליטות לפני התרבית בצמחי In bul. פלטות תרבית של 35 מילימטר מצופות בקולגן על ידי הנחת טיפות של 50 microliter קולגן ו-10 microliter סטרילי.6%saline אחד ליד השני. ערבבו היטב באמצעות פיפט פוסטר כפולה וכופופה ודחפו לעבר קצה פלטת התרבית. הדגירו ללילה בסביבה נקייה אך אל תתנו לזה להתייבש. למטרה זו אנו משתמשים במייבש עם פלטת מים בתחתית.ביום למחרת, יום התרבית. שטפו את הצלחות בתמיסת סלין, והדגירו את צלחות התרבית המצופות בקולגן והשטופות במקדם דגירה למשך כשלוש שעות בתוך מצע גידול באינקובטור; מצע הגידול מורכב מ-85% alpha modified MEM, 10% fetal bovine serum ו-5% תמצית עוברי אפרוחים מיום 11.לאחר דגירה מקדימה, הסירו את מצע התרבית מהצלחות והוסיפו מספר BULs עם כמות מינימלית של מצע. הסירו עודפי מצע תרבית. דגרו למשך שעה אחת באינקובטור תאים באטמוספירה לחית עם 10%oxygen ו-5%CO2.לאחר שעה, הוסיפו באיטיות 1.5 milliliter של תרבית. תאי CHE צריכים להיצמד לתת-המצע של ה-collagen; החליפו 50% ממצע התרבית מדי יום. אוקיי, עכשיו בואו נתחיל.כעת נבחן את התרביות. בתוך שלושה עד ארבעה ימים, תאים בעלי יכולת נדידה גבוהה יגרו מהבאל-צ'קס (ball checks). שימו לב למורפולוגיה הכוכבית שלהם ולהיעדרם הבולט של מגעים בין-תאיים.במהלך הימים הבאים, תאים נוספים יגרים ותאים שהגריו יתרבו במהירות; תאים נדירים וחשובים בעלי מורפולוגיה שטוחה, שהופכים גלויים לעיתים מספר ימים לאחר ה-epidermal neuro crest. תאי גזע נראים לעיתים בתרביות אלו. תאים אלו אינם תאי גזע של epidermal neuro crest, אלא הם תאי גזע אפידרמליים משוערים או תאי פרוגניטור בעלי ניידות נמוכה יותר; יש להשליך תרביות המורכבות מתאים אלו.הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין תרביות של שתלי בולג' (bulge explant) המכילות תאי גזע עצביים אפידרמליים. מכיוון שתאי גזע עצביים הם בעלי יכולת נדידה גבוהה, הם יעזבו את שתל הבולג' תוך שלושה עד ארבעה ימים. לאחר השתלה, הסרנו את הבולג', ואוכלוסייה טהורה של תאי גזע עצביים נשארת בצלחת התרבית.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לחטא את העכבר בקפידה כדי למנוע זיהום. כמו כן, יש לחתוך לעומק בבסיס הכף כדי לא לפגוע בזקיקים. בכל הנוגע לתרביות, חשוב להבחין בין התמצית הנדידה, תאי הרכס העצבי (neural crest cells), והקרטינוציטים שאינם נדידים בעלי מבנה של "cobblestone".זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

mouse-epidermal-neural-crest-stem-cell-epi-ncsc-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מתאר את שיטת לבידוד של neuroprecursors מהקורטקס המתפתח של עכברים עובריים. ההליך להסרת עוברים מן הרחם, לנתח את רקמת קליפת המוח, ולעכל את קליפת המוח מבודד מוצג.

תרבות עצבית עכבר מקדימים לתאי גזע

כדי לטפח גזע עצביים לפסגה תאים (NCSC) במבחנה, בינוני מיוחד (NCSCM) נדרשת. חלק חיוני של NCSCM הוא עובר אפרוח לחלץ (CEE). כאן אנו מתארים טכניקות מדויקות כדי לייצר כמות מוגדל של איכות CEE טהור גבוהה, כולל פרטים כמו בידוד, מסמוס, צנטריפוגה, תהליכי סינון.

הפקה של חילוץ העובר צ&#39;יק לגידול Murine בתאי גזע עצביים קרסט

הדרך המהירה, החזקה של בידוד קיימא גזע בוגרים לתאי האפיתל של העור האנושי הוא תיאר. השיטה משתמשת עיכול אנזימטי של מטריקס הקולגן בעור, ואחריו מריטת זקיקי השיער ובידוד של המתלים תא בודד או שברי רקמה תרבית תאים.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

מאמר זה מציג פרוטוקול חזק לבידוד ולתרבות של תאי גזע רכס עצביים מן זקיקי שיער אדם.

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את...

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

יש תאי רכס עצבי (NC) שמקורם בתאים אנושיים גזע pluripotent (hPSC) פוטנציאל גדול לפיתוח מודלים ומחלות של בני אדם ועבור טיפולי החלפת תא. הנה, הסתגלות מזין ללא ממשמש כיום באופן...

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד keratinocytes עוריות מן העור העורבי של עכברים מבוגרים עבור מגוון של יישומים במורד הזרם כגון ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה, מיון תא מופעל פלואורסצנטית, ו העיקרי בשימוש בלתי מתורבת (למשל, clonogenic keratinocytes).

בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח והתרבות של תאי ציצה עצביים הגולגולת מדגמי העכבר, בעיקר למחקר של הגירה תא. אנו מתארים את טכניקות ההדמיה החי בשימוש וניתוח של מהירות וצורה תא שינויים.

חיתוך, תרבות וניתוח של הגולגולת הראשי ציצה עצביים תאים מעכבר לחקר של ציצה של תא העצבים העצבי והגירה

אנו מציגים פרוטוקול התמיינות תלת מימדי (תלת מימדי) במבחנה המייצר נוירוספירות בגודל הניתן לשחזור כדי לייצר תאי פסגה עצבית גולגולתית מתאי גזע עובריים של עכברים. אנו מראים כי מתודולוגיה זו מפחיתה את השונות בהשוואה לפרוטוקולים קודמים וכיצד ניתן להשתמש בה לבדיקה מרובה לחקר התפתחות תאי פסגה עצבית גולגולתית.

תאי פסגה עצבית גולגולתית פרוטוקול התמיינות תלת מימדי במבחנה לבדיקה מרובבת

למד שיטה לבידוד תאי גזע עצביים מכרסת עורית (EPI-NCSC) מזקיקי שפם בעכברים באמצעות מיקרו-ניתוח והשתלת בליטה בתרבית. תאים נודדים תוך 3-4 ימים.

עכבר עוריות עצבית קרסט לתאי גזע (EPI-NCSC) תרבויות

גלה סרטונים נוספים