אבולוציה מולקולרית של recombinase Tre

שמי פרנק אלז. אני מוביל קבוצה במכון מקס פלאנק לביולוגיה וגנטיקה של תאי המקולה בדרוסדן. כעת אדבר על עבודתנו לפיתוח רקומבינאז ספציפי לאתר עבור ניתוחים מולקולריים.

בעיקרון ככלי שמאפשר להסיר רצפים, רצפים שהוגדרו מראש מהגנום, ובאופן ספציפי יותר לנסות להכרית תאי HIV נגועים מהנגיף. כלומר, להסיר את הפרו-וירוס של HIV מהגנום של תאים נגועים. תפיסה רעיונית נוספת היא שאנו מסתמכים על כלי גנטי שכבר מבוסס היטב, דהיינו ה-Cre Recombinase, כדי להיקשר, לזהות ולהשתמש באתר מטרה שהגדרנו מראש.

לכן יצאנו לבדוק האם ניתן ליצור רקומבינאזה ספציפית לאתר, הנקשרת לאתר המתרחש באופן טבעי ב-LTR של נגיף HIV. בניגוד לציפיות שלנו, אם נצליח לעשות זאת, נחזה כי ניתן יהיה להוציא את הפרו-וירוס מהגנום. באופן בסיסי, מחזור החיים של הנגיף עובר שלב שבו הנגיף משתלב בתאים, ולאחר מכן, באמצעות תעתוק הפוך, הוא יוצר תבנית DNA המוקפת על ידי שני חזרות קצביות (terminal repeats).

הם נקראים חזרות טרמינליות ארוכות, או LTRs. אלו מובאים לאחר מכן אל הגרעין ומשתלבים, באופן שבירת-מזל במידה רבה, בתוך הגנום של המארח. כעת נוצר מצב שבו קיים מה שנקרא פרו-וירוס (provirus), אשר משולב ומוקף משני צדדיו על ידי שתי חזרות טרמינליות ארוכות, כלומר שתי LTRs.

הרעיון כעת היה שאם נצליח לגרום לרקומינזה לזהות רצף הקיים ב-LT R, נוכל להסיר את הפרו-וירוס כמעגל מהגנום של המארח ובכך להשמיד את הוירוס מהתאים. זה היה הרעיון המושגי. למעשה, הרקומינזה היא חלבון קושר DNA והיא מוצאת אתר ספציפי מאוד.

לכן יש לו דומיין קישור ל-DNA, המזהה רצף מסוים בתוך ה-DNA. ורק כאשר הוא מוצא את הרצף המדויק הזה, האנזים פעיל. הוא אינו פעיל על אף אחד מהרצפים האחרים.

עקרונות האבולוציה המולקולרית ידועים באופן בסיסי לכל אחד, מכיוון שהם אינם אלא תהליך של בידוד ושיבוב. עיקרון של אבולוציה מולקולרית הוא שמכניסים מוטציות ולאחר מכן מקימים תהליך ברירה, ובדרך זו בוחרים תכונה מסוימת. זהו תהליך זהה לזה המבוצע בבידוד ושיבוב של צמחים.

אתם יודעים שאתם רוצים גודל מסוים או צבע מסוים, ואתם תמיד לוקחים שוב את צאצאי הדור הבא בעלי תכונות מסוימות ומתחילים להכריב אותם זה עם זה. זה בדיוק אותו הדבר שאנחנו עושים עם מולקולות. כך שזה בעצם אותו תהליך, אך בקנה מידה קטן.

אנו מתחילים עם אנזים בעל פעילות מסוימת, ובמקרה שלנו מדובר ב-CRE recombinase, ואז אנו מתחילים עם חלבון מסוג wild type. לאחר מכן, אנו מוטטים מעט את האתר אליו נקשר ה-recombinase, אך הוא עדיין בעל פעילות נמוכה מאוד. לאחר מכן, אנו מחדירים מוטציות אקראיות לאנזים, ל-recombinase, ובוחרים מוטנטים המסוגלים כעת להיקשר לאתר מוטט זה.

לאחר שיהיה לנו זאת, נוכל לשלב את המוטנטים השונים יחד כדי להגיע בסופו של דבר למוצר הסופי הרצוי, כך שהרקומבינאזה תזהה את הרצף שהגדרנו ב-LTR. כפי שאמרתי, אנו מתחילים עם ספריית מוטגנים אקראית. דבר זה נעשה בדרך כלל באמצעות PCR עם נטייה לשגיאות (error-prone PCR).

לכן אנו משתמשים בתנאי PCR, למשל באמצעות Taq polymerase, אשר נוטה לבצע טעויות רבות. באופן זה אנו יוצרים ספרייה אקראית הנושאת מוטציות בנקודות רבות. אנו יכולים להשתמש גם בזן מוטטור, זן חיידקי מוטטור, המשרה ומכניס מוטציות רבות בתעתוקים מסוימים.

אלה משמשים לאחר מכן כחומר מוצא. הטכנולוגיה הנוספת שבה אנו משתמשים היא DNA shuffling לאחר פרק זמן מסוים. מדוברה בטכנולוגיה המאפשרת לשלב מוטציות מועילות שונות, מכיוון שלא תמיד ידוע איזו מהמוטציות היא המועילה, אך יהיו בידיכם מוטנטים שונים בעלי מוטציות שונות.

אם כן, יש לך גן אחד שיש בו מוטציה כאן, שהיא מועילה. יש לך שיבט שני שיש בו מוטציה כאן, וכדי להביא את השניים הללו יחד, בצע כעת פרגמנטציה אקראית של החלקים השונים ולאחר מכן שלב אותם בתגובת PCR כדי להרכיב מחדש את התוצרים. כעת, בתדירות מסוימת, תתקבל שילוב של השניים, שבו חלק מהרקומבינציה מורכב מהמוטנט הזה וחלק מורכב מהמוטנט הזה.

ואז למרכיב הזה תהיה השפעה נוספת שתשפר, ותאפשר לכם לבחור הרבה יותר מהר את המועמדים בעלי התכונות הרצויות. לכן, הייתי קובע הגדרה שבה אני מציין שלחלבון הטיפוס הפראי אין כל פעילות באתר מסוים. כך למשל, אם ניקח את הרצף שבחרנו מתוך ה-LTR של ה-H-I-V-L-T-R, ואם ננסה להשתמש ב-cre recombinase על הרצף, לא תהיה לו כל פעילות.

CRE recombinase אינו מסוגל לבצע רקומבינציה באתר, ובמקרה כזה, לדעתי, יש לנו רקומבינז חדש לפי ההגדרה, כאשר יש לנו אנזים המסוגל להיקשר ולבצע רקומבינציה לרצף זה. לא הגדרנו מראש כמה מחזורים נבצע, אך ביצענו מספר מחזורים ככל שהיה נחוץ עד שקיבלנו אנזים בעל הפעילות הרצויה. כך התחלנו עם מוטציות מינוריות מאוד באתר, ולאחר מכן התחלנו לשלב את המוטציות השונות יחד.

זה היה אחד השלבים החשובים לכך שהתהליך הזה עבד. לכן עברנו דרך תוצרי ביניים והיינו צריכים לעבור מחזורים רבים כאלה כדי למצוא אנזים, שיהיה פעיל מספיק כדי להמשיך למחזור הבא. זה דומה מאוד לכל תהליך של רבייה.

אתם מגדירים פעילות מסוימת שאתם מעוניינים בה, מאפיין מסוים שאתם רוצים, ואז אתם מתחילים בביצוע רבייה. ועד שאתם מקבלים את התוצאה שביקשתם, אתם עדיין לא שם ועליכם להמשיך לעבור דורות נוספים. זהו בעצם השלב שבו הדברים נמצאים.

עליי לציין גם כי 120 מחזורי אבולוציה, או מאה ועשרים ושמונה בדיוק, שימשו פשוט כדי למצוא שלב ביניים שבו יכולנו לומר שעתה ניתן להפסיק מכיוון שיש לנו פעילות מסוימת. הרקומינציה שיש לנו כעת עדיין פחות פעילה מאשר ה-CRE recombinase בצורתו הפראית (wild type). לכן, כדי להשיג רקומינז פעיל יותר, נצטרך לבצע מחזורי אבולוציה נוספים.

לכן, זה לא מסתיים למעשה בנקודה שבה אנו נמצאים כעת בתהליך האבולוציה. אינני רואה מגבלות טכניות כלשהן. השאלה היא עד כמה ניתן לדחף זאת.

לפיכך, בצד ה-LTR, הרצף הנמצא ב-LTR HA חולק 50% דמיון רצפי לצד ה-locks P הטבעי, הצד הטבעי שאתה רקומבינאזה מזהה. השאלה היא האם ניתן להגיע רחוק יותר, ואת זה עדיין איננו יודעים, אך העובדה שיש לנו רק 50% דמיון רצפי לאתר הפרא (wild type) מרמזת שניתן לדחוף זאת עוד יותר. הרקומבינאזה פועלת היטב בתרביתי תאי רקמה אנושיים, למרות שכפי שציינתי, היא אינה פעילה באותה מידה כמו רקומבינאזה על האתר שלה.

לפיכך, סביר להניח שהיציבות נמוכה במקצת מזו של הרקומבינאז שנבדק, האנזים מסוג wild type, ויהיה צורך בברירה רבה יותר ובסבבי אבולוציה נוספים כדי לשפר מאפיינים אלה בעתיד. השלב הראשון הוא שיפור האתר, הרקומבינאז הספציפי הזה, ה-three recombinase, כדי להפוך אותו לפעיל יותר, ואולי מציאת אתרים בולטים אחרים שיהווו מטרות טובות ב-LTR ומציאת רקומבינאז מתאים מאוד עבורם. לאחר מכן נצטרך לבחון רקומבינאז זה במערכי בדיקה שונים, תחילה שוב בתרביות תאים, אך לאחר מכן, ובאופן חשוב מאוד, לבחון רקומבינאז זה במודלים של בעלי חיים.

לכן נצטרך לבדוק אם לרקומבינאזה זו יש תופעות לוואי בלתי רצויות באורגניזם. ולאחר מכן, כמובן, היבט מאתגר מאוד הוא פיתוח מערכת הובלה יעילה עבור רקומבינאזה זו, וזה אינו עניין טריוויאלי. זהו תחום מחקר שלם כשלעצמו שנדרש לפתח.

זו הייתה בעצם גישה של תרפיה גנית שהיינו צריכים לנקוט. ובכן, אני חושב שאנו עדים לשינוי ברפואה, שהופכת להיות מולקולרית יותר ויותר. ועבור כך, כמובן, אנו זקוקים לכלים שיאפשרו לנו לעבוד בקנה מידה כזה.

וכאן אני רואה את עתיד תהליך האבולוציה. לכן, עלינו לייצר אנזימים מותאמים אישית הפועלים בתהליך שהיינו רוצים מאוד להיות מסוגלים להשתמש בו; במקרה של הרקומבינאזה, ניתן להקביל זאת לכלי עבור מנתח שצריך להסיר, במהלך ניתוח, רכיב מסוים שעליו להסירו. במצב זה, אנו זקוקים כעת לכלים שבאמצעותם "מנתח מולקולרי" יוכל להסיר באופן ספציפי מקטע מסוים של DNA מהגנום.

ולשם כך, הוא זקוק לכלים שיאפשרו לו לבצע זאת. לפיכך, אבולוציה מולקולרית יכולה בעקרון למלא את התפקיד הזה. בטבע קיימים אנזימים רבים בעלי תכונות רצויות מאוד המאפשרות לבצע זאת.

ועלינו פשוט להתאימם לצרכים שלנו כדי שנוכל להפוך אותם למועילים. אני חושב שאבולוציה מולקולרית יכולה למלא כאן תפקיד חשוב מאוד. קשה לומר כעת היכן נמצאות המגבלות, מכיוון שהטכנולוגיה, התחום הזה, נמצאת עדיין בשלביה הראשוניים.

לכן הזמן יגלה היכן נמצאים המגבלות. אני בטוח שיהיו כמה, אך כרגע, אני חושב שישנן יותר הזדמנויות מאשר מגבלות ממשיות.