ראיון: HIV-1-DNA כריתה Proviral שימוש recombinase התפתח

אני JohE Hvar ואני עומד בראש המחלקה לביולוגיה של התא וביולוגיה, במכון HE Pet בהמבורג, גרמניה. מכון HE PET הוא מכון למחקר בסיסי המתמקד אך ורק ב-pe אנושי, נגיפים פתוגניים ונושאים קשורים, הייתי אומר. לפיכך, המחלקה שלנו מעוניינת בעיקר לחקור את הבקרה של ביטוי גני HIV, ואת האינטראקציה, ובמיוחד האינטראקציה התוך-תאית של HIV עם רכיבים של תא המארח.

על בסיס נתונים אלו, אנו מנסים לפתח גם טיפולים חדשים וניסיוניים למחלת ה-HIV. הבעיה עם HIV היא ש-HIV הוא רטרו-וירוס או לנטי-וירוס, וכמו כל רטרו-וירוס, בעת הדבקה של תא המארח, HIV משלב את הגנום הוויראלי אל תוך הגנום של תא המארח. נכון להיום, לא ניתן להיפטר יותר מהפרו-וירוס המשולב.

משמעות הדבר היא, במונחים טיפוליים, שאנו מדברים על מחלה כרונית הדורשת טיפול לאורך כל החיים, ובעקבות זאת על כל הבעיות הקשורות לטיפולים ארוכי טווח, כגון תופעות לוואי של התרופות, הופעת עמידות וכדומה. מזה שנים רבות במחקר הבסיסי, אנו מכירים את מה שנקרא רקומבינאזים (recombinases), המופיעים באופן טבעי בתהליכי רקומבינציה, למשל בשמרים או בחיידקים. רקומבינזים אלו מזהים רצפי DNA ספציפיים, מבצעים ערבוב של גנים וארגון מחדש של הגנום, וכן הלאה.

ובפרט, רקומבינאזה אחת הנקראת Cre recombinase משמשת במחקר בסיסי וב-in situ במחקר בסיסי. Cre מזהה ביסודו רצף ספציפי, ואם קיים רצף הממוקם בין שני אתרי זיהוי, Cre מסוגל להוציא למעשה את הרצף המתווך.

כך שהרעיון כבר לפני 10 או 15 שנים הוא להשמיד את הווירוס מבחינה רפואית, ומצד שני, להשתמש ברקומבינאזה, כמו Cre למשל, כדי להוציא את ה-proviral DNA. תיאורטית הדבר אמור להיות אפשרי, כיוון שבמהלך ההדבקה, HIV מבצע שעתוק הפוך של הגנום של ה-RNA שלו ל-DNA, ובשל תהליך השעתוק ההפוך הזה נוצרות רצפים הנקראים long terminal repeats (LTRs), המסמנים ביסודם את קצה ה-5' (ההתחלה) ואת קצה ה-3' (הסוף) של ה-proviral DNA המשולב. לכן, תיאורטית, אם ניתן היה לפתח רקומבינאזה המזהה ספציפית רצף ב-LTR, הרי שה-Cre תתקוף ביסודו את קצה ה-5' ואת קצה ה-3' של ה-proviral DNA המשולב, תוציא את ה-DNA, ותשמיד ביסודו את הווירוס מהתא המודבק. כעת, הבעיה עם HIV היא שיש לנו איזולטים שונים, אולי אף באדם אחד, במטופל בודד, עם זאת, כפי שידוע לנו עד כה, הרצף נמצא בתחילתו ובסופו של הגנום הויראלי.

במילים אחרות, ה-LTRs שמורים יותר מאשר, למשל, הגנים של ה-HIV. לכן, אני חושב שיש סיכוי טוב שנוכל להסתפק במספר קטן של רקומבינאזים שיזהו באופן בסיסי את השונות העצומה של כל בידודי ה-HIV. ואם לא, נצטרך פשוט לייצר אחד חדש באמצעות אבולוציה מולקולרית, תהליך שניתן יהיה להפוך לחלקית אוטומטי בעתיד.

וזה אכן יקרה, התהליך יהיה מהיר בהרבה מאשר ביצועו במעבדה. כאן נכנס לתמונה הקולגה שלנו, ד"ר Frank ממכון Max Planck. ביסודו, הוא מומחה לרקומינז ובתחומים נלווים.

בעיקר מה שהוא השתמש בו הוא מה שאנו מכנים שיטת אבולוציה מולקולרית. אך השיטה מבוססת על טכנולוגיית PCR, תגובת שרשרת פולימראז. הוא לוקח את הגן של הרקומבינאז הטבעי degree combs ומקיים תגובת PCR או תגובות PCR מרובות בתנאים המכניסים מוטציות באופן אקראי.

והטריק כעת הוא לבחור את הגרסאות החדשות של הרקומבינאז שרכשו יכולת חדשה או פעילות חדשה, דהיינו זיהוי רצפים ספציפיים ל-HIV. והוא עושה זאת במחזורים חוזרים. הוא ביצע כ-120 מחזורים או למעלה מ-120 מחזורים כדי לבצע שיטה זו של אבולוציה מולקולרית.

כאשר הוא הגה לבסוף את הרקומבינזה הספציפית הזו, הנקראת כיום three for LTR, שהיא רקומבינזה חדשה המזהה כעת באופן ספציפי רצפי HIV. המחקר הראשוני כאן, הניסויים עם הרקומבינזות, בוצעו כאן במכון HE PET בהמבורג. מה שעשינו הוא להחדיר את הרקומבינזה הזו באמצעות וקטורים, וקטורים גנטיים, לתרבית תאים אנושית שהודבקה במידה רבה בבידוד קליני של HIV-1.

ובמהלך הזמן, במשך שש עד שמונה שבועות, הצלחנו להוכיח זאת. כעת, הרקומביננט מרגש מבחינה כמותית, הם שילבו את פרופיל HIV DA, ובאופן בסיסי כל התרבית מטופלת על ידי סילוק ה-HIV. ישנם בוודאי בעיות רבות עם טכנולוגיה זו.

ראשית, עלינו לוודא שהביטוי של הרקומבינאז אינו גורם לתופעות לוואי רעילות. איננו מצפים לכך, כיוון שעבור רקומבינציות המתרחשות באופן טבעי, כמו gre, קיימות חיות טרנסגניות. הן מבטאות את רקומבינציית GRE זו, וישנן אמנם כמה בעיות, אך הן אינן משמעותיות מדי.

אוכל לומר זאת בשלב זה. לכן ישנה תקווה שלא יהיו תופעות לוואי רעילות, אך לעולם אינך יודע עד שתבצע את הניסויים. כמו כן, קיימות בעיות שייתכן שלא נזהה באמצעותן כל בידוד קליני, כך שנוכל להיפטר מהבידוד הדומיננטי של HIV בחולה.

אך אנו נבחר מתוך בידודים מינוריים עם הזמן. זאת מכיוון שאיננו יודעים, ועלינו לבצע ניסויים אלו. לאחר מכן, קיימת בעיה משמעותית בהעברת הגנים, עם טכנולוגיית הווקטורים.

עלינו להשתמש במה שנקרא וקטורים לנטיביריאליים או וקטורים רטרוביריאליים כדי להחדיר את הגן או את הגן של הרקומבינאזה. האם ישנן תופעות לוואי? כן, האם וקטורים אלו גורמים להשפעות רעילות?

אלו כל השאלות שיש לנו. כמו כן, אנו מקווים לשפר את הפעילות של המסרקים. הרקומינציה פועלת פשוט מהר יותר ממה שאנו רואים כעת, במשך מספר שבועות, את הפעילות.

אלו הן שאלות פתוחות שעלינו לפתח במהלך השנים הבאות. וכעת זוהי ללא ספק הבעיה, כיוון שרקומינאזות אינן זמינות למתן דרך הפה. לכן לא יהיה גלול, גלול רקומינאזה פשוט, וביטול של הנגיף.

לכן, כשמעריכים את הטיפולים העתידיים, עלינו לחשוב על גישות של תרפיה גנטית. כך שניתן להעלות השערה שניתן לבודד תאי גזע המטופויטיים, או תאים חיוביים ל-CD 34, מדם של חולים נגועים ב-HIV. ולאחר מכן, במעבדה, נחדיר את הגן ל-combs אל תוך תאי החולה הללו.

לבסוף, אנו מחדירים מחדש, מזריקים מחדש, מעבירים בעירוי את תאי המטופל – וכעת תאי המטופל שעברו שינוי גנטי – חזרה לאותו מטופל בגב. לכן, מה שאמור להתרחש הוא שמערכת החיסון או המערכת ההמטופויטית של המטופל תתחדש עם הזמן, לפחות באופן חלקי, באמצעות תאים שבמקרה של הדבקה ב-HIV, יוכלו להיפטר מהנגיף מכיוון שהם מבטאים כעת רקומבינאזה. התוצאה תהיה ירידה בעומס הנגיפי אצל המטופל, מה שבהחלט ישפר את איכות חייו.

ניתן גם לקוות שמערכת החיסון משתקמת בחולים אלו, לפחות באופן חלקי. כעת, תאי החיסון שיהיו תפקודים באופן מלא יוכלו, בתקווה, לתקוף את התאים שנותרו נגועים בנגיף אצל חולים אלו. האם נוכל למעשה למגר את ה-HIV לחלוטין ובאופן מוחלט מחולה, איננו יכולים לקבוע בשלב זה.