Name: ראיון: HIV-1-DNA כריתה Proviral שימוש recombinase התפתח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-16T23:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: למדו על שימוש ברקומבינאזה מהונדסת לכריתת DNA פרוביראלי של HIV-1 מתאים נגועים. שיטה זו מציעה אסטרטגיה חדשנית לחיסול נגיף האיידס ומסייעת בפיתוח טיפולים גניים עתידיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנא לצפות בקטעי וידאו הקשורים זכאי <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=718" target="_blank">עקרונות ספציפיות לאתר טכנולוגיה (SSR) recombinase</a> ו <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=791" target="_blank">אבולוציה מולקולרית של recombinase Tre</a> לקבלת מידע נוסף על רקומבינציה אתר ספציפי והנדסה באתר, סגוליות של אנזימים recombinase.

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

ראיון: hiv-1-dna כריתה proviral שימוש recombinase התפתח

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV-1 משתלב בכרומוזום המארח של תאים נגועים נמשכת כמו provirus מוקף חוזר מסוף ארוך. אסטרטגיות טיפול מקומי בעיקר יעד אנזימים וירוס או וירוס תאים היתוך, מחזור לדכא את נגיפי חיים בלי להשמיד את הזיהום. מאז provirus משולב אינו ממוקד על ידי גישות אלו, זנים עמידים חדש של HIV-1 עשויים לצוץ. כאן אנו מדווחים כי מהונדסים recombinase Tre (ראה אבולוציה מולקולרית של recombinase Tre, בוכהולץ, פ &#39;, מכון מקס פלאנק Cell Biology וגנטיקה, דרזדן) ביעילות excises DNA משולב HIV-1 proviral מן הגנום של תאים נגועים. הפקנו loxLTR המכיל pseudotypes ויראלי תאים נגועים הלה לבחון האם Tre recombinase יכול הבלו מן provirus הגנום של HIV-1 תאים אנושיים נגועים. החלקיקים משחררים וירוס קו תא שוכפלה ולאחר transfected עם טרה מביע פלסמיד או וקטור עם בקרת הורים. פעילות הייצור recombinase וירוס נוטרו. כל מבחני הפגינו את המחיקה יעיל של provirus מן התאים הנגועים ללא תופעות ציטוטוקסיות גלוי. תוצאות אלו לשמש הוכחה של העיקרון כי ניתן להתפתח recombinase למקד ספציפית LTR HIV-1, וכי recombinase זה מסוגל גוזמות provirus HIV-1 מתוך הגנום של HIV-1-נגועים בתאים אנושיים. לפני recombinase מהונדסים יכול להיכנס לזירה טיפולית, עם זאת, מכשולים משמעותיים צריך להתגבר. בין הנושאים הקריטיים ביותר, כי אנו מתמודדים, הם אספקה ​​יעילה ובטוחה התאים הממוקדים והעדר תופעות לוואי.

נוכחי HIV-1 אסטרטגיות לפעול כדי לדכא את מחזור החיים של נגיפי אבל לא יעיל למיגור זיהום. כאן, אנו מראים כי recombinase מהונדסים יכולים הבלו ביעילות משולב DNA HIV-1 proviral מן הגנום של תאים נגועים.

ראיון: HIV-1-DNA כריתה Proviral שימוש recombinase התפתח

HIV-1 נשלב אל תוך כרומוזומ המארח של תאים נגועים ונשאר כפרו-וירוס המוקף בחזרות קצביות ארוכות (long terminal repeats). אסטרטגיות טיפול נוכחיות...

אני JohE Hvar ואני עומד בראש המחלקה לביולוגיה של התא וביולוגיה, במכון HE Pet בהמבורג, גרמניה. מכון HE PET הוא מכון למחקר בסיסי המתמקד אך ורק ב-pe אנושי, נגיפים פתוגניים ונושאים קשורים, הייתי אומר. לפיכך, המחלקה שלנו מעוניינת בעיקר לחקור את הבקרה של ביטוי גני HIV, ואת האינטראקציה, ובמיוחד האינטראקציה התוך-תאית של HIV עם רכיבים של תא המארח.על בסיס נתונים אלו, אנו מנסים לפתח גם טיפולים חדשים וניסיוניים למחלת ה-HIV. הבעיה עם HIV היא ש-HIV הוא רטרו-וירוס או לנטי-וירוס, וכמו כל רטרו-וירוס, בעת הדבקה של תא המארח, HIV משלב את הגנום הוויראלי אל תוך הגנום של תא המארח. נכון להיום, לא ניתן להיפטר יותר מהפרו-וירוס המשולב.משמעות הדבר היא, במונחים טיפוליים, שאנו מדברים על מחלה כרונית הדורשת טיפול לאורך כל החיים, ובעקבות זאת על כל הבעיות הקשורות לטיפולים ארוכי טווח, כגון תופעות לוואי של התרופות, הופעת עמידות וכדומה. מזה שנים רבות במחקר הבסיסי, אנו מכירים את מה שנקרא רקומבינאזים (recombinases), המופיעים באופן טבעי בתהליכי רקומבינציה, למשל בשמרים או בחיידקים. רקומבינזים אלו מזהים רצפי DNA ספציפיים, מבצעים ערבוב של גנים וארגון מחדש של הגנום, וכן הלאה.ובפרט, רקומבינאזה אחת הנקראת Cre recombinase משמשת במחקר בסיסי וב-in situ במחקר בסיסי. Cre מזהה ביסודו רצף ספציפי, ואם קיים רצף הממוקם בין שני אתרי זיהוי, Cre מסוגל להוציא למעשה את הרצף המתווך.כך שהרעיון כבר לפני 10 או 15 שנים הוא להשמיד את הווירוס מבחינה רפואית, ומצד שני, להשתמש ברקומבינאזה, כמו Cre למשל, כדי להוציא את ה-proviral DNA. תיאורטית הדבר אמור להיות אפשרי, כיוון שבמהלך ההדבקה, HIV מבצע שעתוק הפוך של הגנום של ה-RNA שלו ל-DNA, ובשל תהליך השעתוק ההפוך הזה נוצרות רצפים הנקראים long terminal repeats (LTRs), המסמנים ביסודם את קצה ה-5' (ההתחלה) ואת קצה ה-3' (הסוף) של ה-proviral DNA המשולב. לכן, תיאורטית, אם ניתן היה לפתח רקומבינאזה המזהה ספציפית רצף ב-LTR, הרי שה-Cre תתקוף ביסודו את קצה ה-5' ואת קצה ה-3' של ה-proviral DNA המשולב, תוציא את ה-DNA, ותשמיד ביסודו את הווירוס מהתא המודבק. כעת, הבעיה עם HIV היא שיש לנו איזולטים שונים, אולי אף באדם אחד, במטופל בודד, עם זאת, כפי שידוע לנו עד כה, הרצף נמצא בתחילתו ובסופו של הגנום הויראלי.במילים אחרות, ה-LTRs שמורים יותר מאשר, למשל, הגנים של ה-HIV. לכן, אני חושב שיש סיכוי טוב שנוכל להסתפק במספר קטן של רקומבינאזים שיזהו באופן בסיסי את השונות העצומה של כל בידודי ה-HIV. ואם לא, נצטרך פשוט לייצר אחד חדש באמצעות אבולוציה מולקולרית, תהליך שניתן יהיה להפוך לחלקית אוטומטי בעתיד.וזה אכן יקרה, התהליך יהיה מהיר בהרבה מאשר ביצועו במעבדה. כאן נכנס לתמונה הקולגה שלנו, ד"ר Frank ממכון Max Planck. ביסודו, הוא מומחה לרקומינז ובתחומים נלווים.בעיקר מה שהוא השתמש בו הוא מה שאנו מכנים שיטת אבולוציה מולקולרית. אך השיטה מבוססת על טכנולוגיית PCR, תגובת שרשרת פולימראז. הוא לוקח את הגן של הרקומבינאז הטבעי degree combs ומקיים תגובת PCR או תגובות PCR מרובות בתנאים המכניסים מוטציות באופן אקראי.והטריק כעת הוא לבחור את הגרסאות החדשות של הרקומבינאז שרכשו יכולת חדשה או פעילות חדשה, דהיינו זיהוי רצפים ספציפיים ל-HIV. והוא עושה זאת במחזורים חוזרים. הוא ביצע כ-120 מחזורים או למעלה מ-120 מחזורים כדי לבצע שיטה זו של אבולוציה מולקולרית.כאשר הוא הגה לבסוף את הרקומבינזה הספציפית הזו, הנקראת כיום three for LTR, שהיא רקומבינזה חדשה המזהה כעת באופן ספציפי רצפי HIV. המחקר הראשוני כאן, הניסויים עם הרקומבינזות, בוצעו כאן במכון HE PET בהמבורג. מה שעשינו הוא להחדיר את הרקומבינזה הזו באמצעות וקטורים, וקטורים גנטיים, לתרבית תאים אנושית שהודבקה במידה רבה בבידוד קליני של HIV-1.ובמהלך הזמן, במשך שש עד שמונה שבועות, הצלחנו להוכיח זאת. כעת, הרקומביננט מרגש מבחינה כמותית, הם שילבו את פרופיל HIV DA, ובאופן בסיסי כל התרבית מטופלת על ידי סילוק ה-HIV. ישנם בוודאי בעיות רבות עם טכנולוגיה זו.ראשית, עלינו לוודא שהביטוי של הרקומבינאז אינו גורם לתופעות לוואי רעילות. איננו מצפים לכך, כיוון שעבור רקומבינציות המתרחשות באופן טבעי, כמו gre, קיימות חיות טרנסגניות. הן מבטאות את רקומבינציית GRE זו, וישנן אמנם כמה בעיות, אך הן אינן משמעותיות מדי.אוכל לומר זאת בשלב זה. לכן ישנה תקווה שלא יהיו תופעות לוואי רעילות, אך לעולם אינך יודע עד שתבצע את הניסויים. כמו כן, קיימות בעיות שייתכן שלא נזהה באמצעותן כל בידוד קליני, כך שנוכל להיפטר מהבידוד הדומיננטי של HIV בחולה.אך אנו נבחר מתוך בידודים מינוריים עם הזמן. זאת מכיוון שאיננו יודעים, ועלינו לבצע ניסויים אלו. לאחר מכן, קיימת בעיה משמעותית בהעברת הגנים, עם טכנולוגיית הווקטורים.עלינו להשתמש במה שנקרא וקטורים לנטיביריאליים או וקטורים רטרוביריאליים כדי להחדיר את הגן או את הגן של הרקומבינאזה. האם ישנן תופעות לוואי? כן, האם וקטורים אלו גורמים להשפעות רעילות?אלו כל השאלות שיש לנו. כמו כן, אנו מקווים לשפר את הפעילות של המסרקים. הרקומינציה פועלת פשוט מהר יותר ממה שאנו רואים כעת, במשך מספר שבועות, את הפעילות.אלו הן שאלות פתוחות שעלינו לפתח במהלך השנים הבאות. וכעת זוהי ללא ספק הבעיה, כיוון שרקומינאזות אינן זמינות למתן דרך הפה. לכן לא יהיה גלול, גלול רקומינאזה פשוט, וביטול של הנגיף.לכן, כשמעריכים את הטיפולים העתידיים, עלינו לחשוב על גישות של תרפיה גנטית. כך שניתן להעלות השערה שניתן לבודד תאי גזע המטופויטיים, או תאים חיוביים ל-CD 34, מדם של חולים נגועים ב-HIV. ולאחר מכן, במעבדה, נחדיר את הגן ל-combs אל תוך תאי החולה הללו.לבסוף, אנו מחדירים מחדש, מזריקים מחדש, מעבירים בעירוי את תאי המטופל – וכעת תאי המטופל שעברו שינוי גנטי – חזרה לאותו מטופל בגב. לכן, מה שאמור להתרחש הוא שמערכת החיסון או המערכת ההמטופויטית של המטופל תתחדש עם הזמן, לפחות באופן חלקי, באמצעות תאים שבמקרה של הדבקה ב-HIV, יוכלו להיפטר מהנגיף מכיוון שהם מבטאים כעת רקומבינאזה. התוצאה תהיה ירידה בעומס הנגיפי אצל המטופל, מה שבהחלט ישפר את איכות חייו.ניתן גם לקוות שמערכת החיסון משתקמת בחולים אלו, לפחות באופן חלקי. כעת, תאי החיסון שיהיו תפקודים באופן מלא יוכלו, בתקווה, לתקוף את התאים שנותרו נגועים בנגיף אצל חולים אלו. האם נוכל למעשה למגר את ה-HIV לחלוטין ובאופן מוחלט מחולה, איננו יכולים לקבוע בשלב זה.

interview-hiv-1-proviral-dna-excision-using-an-evolved-recombinase

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מדווחים על דור של Tre recombinase דרך האבולוציה, בבימויו מולקולרית. Tre recombinase מזהה רצף מוגדר מראש היעד בתוך רצפי LTR provirus של HIV-1, וכתוצאה מכך כריתה לבין מיגור provirus מ תאים אנושיים נגועים. אמנם עדיין בחיתוליו, אבולוציה מולקולרית מכוונת תאפשר יצירה של אנזימים אישית שישמש כלי הניתוח המולקולרי ורפואה מולקולרית.

אבולוציה מולקולרית של recombinase Tre

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

תחרות צמיחה בין נגיפים כמעט איזוגניים מספקת מדידה רגישה לקביעת כושר השכפול היחסי. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים בניית שיבוטים רקומביננטיים של HIV-1, תחרות התפשטות וגידול וירוסים ושיטות ניתוח המותאמות להניב תוצאות רגישות ועקביות.

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

אנו מתארים פרוטוקול להגברת אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלית מה-DNA הגנומי של תאים נגועים, ריצוף הצמתים המוגברים של הווירוס-מארח ולאחר מכן מיפוי רצפים אלה לגנום ייחוס. אנו מתארים גם טכניקות לכימות התפלגות אתרי האינטגרציה ביחס להערות גנומיות שונות באמצעות BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

כתב יד זה מתאר את הליך הניסוי וניתוח תוכנה עבור assay דו כיווני האתר אינטגרציה שיכולה בו זמנית לנתח במעלה הזרם ו-במורד הזרם ווקטור צומת ה- DNA. ניתן להשתמש במוצרי PCR דו-כיווניים עבור כל פלטפורמה של רצף דונסטרים. הנתונים שהתקבלו שימושיים עבור השוואה גבוהה, השוואה כמותית של מטרות DNA משולב.

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

רצף proviral בודדים באורך מלא (היפוך) מספקת שיטה יעילה, תפוקה גבוהה עבור הגברה רצף של יחיד, ליד באורך מלא (שלמים ולא פגומה) HIV-1 הפרו-וירוס והיא מאפשרת קביעה של הפוטנציאל שלהם שכפול-כשירות. סלטות מתגבר על המגבלות של מבחני הקודם שנועדה רצף המאגר HIV-1 סמויה.

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

אנו מציגים הגנום הנדסה זרימת עבודה עבור הדור של הדגמים החדשים במבחנה להידבקות ב- HIV-1 זה מסכם את הדברים proviral אינטגרציה באתרים גנומית שנבחרו. פילוח של עיתונאים HIV-derived בהנחייתם של מניפולציה הגנום CRISPR Cas9-בתיווך, הספציפיות-לאתר. פרוטוקולים מפורט דור שיבוט תא בודד, הקרנה של אימות המטרה הנכונה הינם מסופקים.

CRISPR-Cas9 מבוססי הגנום הנדסה ליצירת מודלים Jurkat כתב להידבקות ב- HIV-1 עם אתרים שנבחרו אינטגרציה Proviral

כאן אנו מציגים בגישה רצף עמוק המספקת של קביעה לא משוחדת של nascent-3' טרמיני, כמו גם פרופילים mutational של מולקולות דנ א חד גדילי. היישום העיקרי הוא אפיון nascent retroviral משלימים DNAs (cDNAs), intermediates שנוצר במהלך התהליך של retroviral שעתוק במהופך.

3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור הערכה תפקודית של הפעלה מחדש יעיל HIV ואישור של הפרו-וירוס החבויים תיאר, המיושם על ידי בדיקת ההשפעה של התערבויות ב- HIV שעתוק, שחבור. התוצאות נציג השפעת השהיית היפוך סוכנים על שעתוק מונחה-LTR, החדרת הינם מסופקים.

תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור

הפרוטוקול מתאר שיטה להחדרת מגוון גנטי נשלט בגנום נגיף הפטיטיס C על ידי שילוב סינתזת RNA מוטנטית באורך מלא באמצעות PCR נוטה לשגיאות וגנטיקה הפוכה. השיטה מספקת מודל לבחירת פנוטיפ וניתן להשתמש בה עבור גנומים ארוכים של 10 קילובייט של נגיף RNA בעל חוש חיובי.

גנטיקה הפוכה כדי להנדס וריאנטים של נגיף RNA בעל חוש חיובי

למדו על שימוש ברקומבינאזה מהונדסת לכריתת DNA פרוביראלי של HIV-1 מתאים נגועים. שיטה זו מציעה אסטרטגיה חדשנית לחיסול נגיף האיידס ומסייעת בפיתוח טיפולים גניים עתידיים.

ראיון: HIV-1-DNA כריתה Proviral שימוש recombinase התפתח

גלה סרטונים נוספים