Name: בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (MES) תאים שימוש בשיטה Drop Hanging (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: למדו בידול תאי גזע עובריים בעכבר לגופי עובר בשיטת הטיפה התלויה. שיטה זו מאפשרת שליטה באגרגציית התאים ומקדמת מחקר בביולוגיית תאי גזע ורפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Gelatinize T75 הבקבוק באמצעות פתרון ג&#39;לטין 0.1% ו צלחת דגירה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 רקמה תרבות יום חממה בן לילה לפני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את התאים מן MES דגירה, לשאוב את המדיום, לשטוף את תרבית תאים ES עם PBS, להוסיף פתרון טריפסין 0.05% ל המעיל התחתון של המנה (2 צלחת ml/100mm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 1 דקות, עד התאים ומשילה מעליה את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות triturate (pipet למעלה ולמטה) התאים trypsinized ארבע עד שש פעמים כדי לפזר את תאים ES עם פקוק פיפטה פסטר,. העברת התאים ES התפזרו לתוך צינור 15 מ&quot;ל צנטריפוגה חרוטי המכיל prewarmed (37 ° C) בינוני MES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים על ידי צנטריפוגה. לשאוב supernatant, הוסף 10 מ&quot;ל של מדיום MES ו פיפטה מעלה ומטה כדי ליצור השעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ההשעיה לתוך תא בקבוק T75 מראש מצופה 0.1% לטין לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך שעה אחת * לאחר כשעה, fibroblasts יש המצורפת הצלחת אבל בתאי גזע להישאר בינוני. פיפטה את המדיום כדי לאסוף את בתאי גזע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים בסל&quot;ד 1000 דקות 5 ו לשאוב את המדיום MES. ואז להוסיף עוד 10 מ&quot;ל של מדיום בידול MES ו resuspend התאים על ידי pipetting חוזרות עד שנראה השעיה וקנס של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים עם מדיום להשתמש hemocytometer בידול לדלל את ההשעיה בתאי גזע כדי בריכוז של 400-500 תאים לכל 20ul (20ul/drop) באגן סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את המכסה, להפוך אותו בזהירות ומניחים אותו על גבי צלחת המכילה 10 מ&quot;ל של PBS. בעזרת פיפטה רב, לעשות שורות של טיפות 20ul על פני השטח עד שהפך הפנימי של המכסה של המנה בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום צלחת בחממה במשך 2 ימים. לאחר יומיים, בזהירות להתהפך לכסות את הצלחת, לשאוב 180 בידול ul בינוני טרי לשים מספר טיפות לתוך הבאר של צלחת 96-מצורף גם ultralow. ואז הטנדר טיפה עם טפטפת טיפות והעברה, אחד על אחד, הצלחת 96-היטב. מניחים את הלוחות לתוך החממה באין מפריע במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל אחד טוב של 48-היטב בתרבות רקמה צלחת עם 300ul של 0.1% ג&#39;לטין. לאחר הוספת ג&#39;לטין, דגירה את הצלחת לילה בשעה 37 ° C יום אחד קדימה לפני העברת EBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשאוב את הג&#39;לטין מהצלחת 48-הבאר. ואז להוסיף 300 ul של המדיום בידול היטב כל אחד. העברת EBS של 96 צלחות היטב את הג&#39;לטין 48 מצופה צלחות גם אחד על אחד. שנה את בינונית למחרת ולאחר מכן שנה את בינונית בכל יום אחר כדי לשמור על התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התכווצויות cardiaomyocyte ספונטנית צריך להיות ברור תוך 7 ימים. </li></ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

החסרונות של שיטה טיפה תלויה הן כדלקמן: נפח נוזל טיפה מוגבל פחות 50ul עקב שמירה על טיפות תלויות על מכסה ידי מתח פנים, ואי אפשר לשנות את המדיום לתליית טיפות. תצפית של יצירת EBS בטיפות ישירות עם מיקרוסקופיה הוא גם קשה מאוד במהלך הטיפוח. עוד יותר, השיטה ירידה תלוי מורכב משני שלבים, אם כן, סדרה של צעד של השיטה ירידה תלוי עשוי להיות בעייתי.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>סרום עוברי של בקר (FBS)</td><td>ריאגנט</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>ריאגנט</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>גורם עיכוב לוקמיה (LIF)</td><td>ריאגנט</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>פלטת 96 בארות בעלת הידבקות נמוכה במיוחד (ultralow attachment)</td><td>כלי</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (mes) תאים שימוש בשיטה drop hanging

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

לתאי גזע יש פוטנציאל מדהים להתפתח הרבה סוגי תאים שונים. כאשר תא גזע מתחלק, בכל תא חדש יש פוטנציאל או להישאר תא גזע או להיות סוג אחר של תא עם פונקציה מיוחדת יותר, זה מבטיח של המדע המוביל מדענים לחקור את האפשרות של טיפולים מבוססי תאים לטיפול במחלות. כאשר התרבות השעיה ללא גורמי antidifferentiation, בתאי גזע עובריים ספונטני להבדיל צורה תלת ממדית אגרגטים תאיים. אגרגטים אלה התא נקראים גופים embryoid (EB). תלוי תרבות ירידה היא היווצרות בשימוש נרחב EB שיטת האינדוקציה. תחתית מעוגלת הירידה תלוי מאפשר צבירה של תאים ES אשר יכול לספק תאים MES סביבה טובה עבור יצירת EBS. מספר תאים ES aggregatied לירידה תלוי יכול להיות נשלט על ידי שינוי מספר התאים בתרחיף התא הראשוני להיות תלויים כמו ירידה מן המכסה של צלחת פטרי. באמצעות שיטה זו אנו יכולים reproducibly טופס EBS הומוגנית מתוך מספר קבוע מראש של תאים עובריים.

סרט הווידאו הזה מדגים כיצד ההתנהגות בידול במבחנה של תאים עובריים בעכבר לגופים embryoid בשיטת ירידה תלוי.

בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (MES) תאים שימוש בשיטה Drop Hanging

לתאי גזע יש פוטנציאל יוצא דופן להתפתח לסוגים רבים ושונים של תאים. כאשר תא גזע מתחלק, לכל תא חדש יש את הפוטנציאל או ש...

לתאי גזע יש פוטנציאל יוצא דופן להתפתח לסוגים רבים ושונים של תאים בגוף, ובכך הם משמשים כמעין מערכת תיקון עבור הגוף. מבחינה תיאורטית, הם יכולים להתחלק ללא הגבלה כדי להשלים תאים אחרים.כאשר תא גזע מתחלק, לכל תא חדש יש את הפוטנציאל להישאר תא גזע או להפוך לסוג תא אחר בעל תפקוד מומחה יותר. תחום מבטיח זה במדע מוביל מדענים לבחון את האפשרות של טיפולים מבוססי תאים לטיפול במחלות in vitro. התמיינות של תאי גזע עובריים מתרחשת כאשר התאים מאפשרים להצטבר בתרבית סספנסיה.בהיעדר תאי מאכילה של פיברובלסטים עובריים של עכבר וגורם מעכב לוקמיה (leukemia inhibitory factor), צבירי תאים אלו נקראים גופי עובר (embryo bodies). שיטת הטיפה התלויה היא הליך יעיל להביאה של תאי גזע לדיפרנציאציה לגופי עובר in vitro. שלום, אני Sha Juan מהמחלקה לרפואה קרדיווסקולרית באוניברסיטת סטנפורד.היום נדגים בפניכם פרוצדורה להגבשה אינדיבידואלית של תאי גזע עובריים לגומי גופים עובריים באמצעות שיטת הטיפה הידנית. אנו משתמשים בדרך כלל בשיטה זו כדי להבדיל תאי גזע עובריים לתאי שריר לב (cardiomyocytes). פרוצדורה זו כוללת את השלבים הבאים: הכנת סספנסיה של תאי גזע עובריים בתאים בודדים, יצירת תרביות בטיפה ידנית, העברת תרביות טיפה ידנית לצלחות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד, וזריעת הגופים העובריים על צלחות מצופותהה ג'לטין.ובכן, נתחיל. השלב הראשון של הפרוצדורה הוא הכנת תרחיף תאים בודדים של תאי גזע עובריים. מכיוון שאנו מתרבלים את תאי הגזע העובריים הבלתי מובחנים על ידי גידולם על פיברובלסטים עובריים של עכבר, עלינו לנתק את התאים ולהפרידם מהפיברובלסטים.כדי לבצע זאת, אנו מבצעים טריפסיזציה לתאים באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות. לאחר השלמת הטיפול בטריפסין, הוסף מצע גידול לתאי גזע עובריים של עכבר כדי לנטרל את הטריפסין. לאחר מכן, העבר את תרחיף התאים למבחנה קונית של 15 mil.לאחר מכן, פריסו את מושבות התאים על ידי פיפטינג (pipetting) מעלה ומטה כנגד תחתית המבחנה, עד לקבלת סספנזיה דקה של תאים ללא גושים נראים לעין. כעת, סובב את התאים ב-1000 RPM למשך חמש דקות. לאחר הסבב, שאבו את הסופרנאט ותלו את התאים ב-10 mils של מצע גידול לתאי ES של עכבר.העבירו את תרחיף התאים לבקבוק T 75 מצופה מראש ב-0.1% gelatin והדגירו בטמפרטורה של 37 מעלות עם 5%CO2 למשך שעה אחת. לאחר שעה, הפיברובלסטים ייצמדו לפני השטח של הבקבוק, אך התאי הגזע יישארו במצע. שאבו את המצע בעזרת פפיטה כדי לאסוף את התאי הגזע.סבבו את התאים ב-1000 RPM למשך חמש דקות ושאבו את המדיום. לאחר מכן, הוסיפו 10 ml נוספים של מדיום דיפרנציאציה, וסבבו מחדש את התאים באמצעות פיפוט חוזר עד לקבלת תרחיף תאים דק. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.כעת אנו מוכנים לתרבית של תרחיף התאים בשיטת הטיפה התלויה. כדי להתחיל בתרבית הטיפה התלויה, השתמש במדיום דיפרנציאציה כדי לדלל את תרחיף תאי הגזע לריכוז של 500 תאים ל-20 µL. לאחר מכן, הפוך את המכסה של צלחת תרבית רקמה בנפח 150 מילימטר.לאחר מכן, העבירו בפיפט 20 µL של תגסוס התאים אל פני השטח הפנימיים של מכסה הפלטה. באמצעות פיפט רב-ערוצי, הוסיפו 10 mL של PBS אל הפלטה. הפכו במהירות את מכסה הפלטה והניחו אותו בעדינות על הפלטה כדי ליצור טיפות תלויות.לאחר שהמכסה של הפלטה במקומו, העבירו בזהירות את הפלטה לתרבית באינקובטור. השאירו את התאים ללא הפרעה למשך יומיים. עם סיום האינקובציה, נמשיך בהעברת תרבית הטיפה התלויה (hanging drop) לפלטות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment).לאחר יומיים, הפכו בזהירות את מכסה הפלטה, שאבו 180 microliters של מצע התמיינות טרי, וטפטפו מספר טיפות לתוך פלטת 96 בארות בעלת הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment). לאחר מכן, שאבו את הטיפות באמצעות פיפטה והעבירו אותן אחת אחת לפלטת ה-96 בארות. הכניסו את הפלטות לאינקובטור והשאירו אותן ללא הפרעה למשך שלושה ימים.גופי העוברים ימשיכו לגדול לצורת כדור. עם השלמת הדגירה, נהיה מוכנים לזריעת גופי העוברים, וזאת כדי לסייע לגופי העוברים להמשיך להתרבד.אנו מעבירים אותם לצלחת בעלת 48 בארות המצופה בג'לטין. לשם כך, תחילה נצפה כל באר בצלחת ב-300 µL של ג'לטין בריכוז 0.1%. לאחר הוספת הג'לטין, יש להדגיר את הצלחת למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C.ביום למחרת, שאבו את הג'לטין מלוח ה-48 בארות. לאחר מכן, הוסיפו 300 µL של מצע דיפרנציאציה לכל בארה. כעת, העבירו אחד אחד את גופי העובריים מהלוח בעל 96 הבארות אל הפלטות בעלות 48 הבארות המצופות בג'לטין.בדרך כלל אנו מחליפים את המצע למחרת ולאחר מכן בכל יום שני כדי לשמר את התאים. אנו משתמשים בשיטה זו כדי לחפש פרוטוקולים טובים יותר להגבלה של תאי גזע עובריים. עבור תאי השריר של הלב (cardiomyocytes), הראינו לכם כעת כיצד לבצע גבירה in vitro של תאי גזע עובריים של עכבר באמצעות תרביות של טיפות תלויות (hanging drop cultures).שיטה זו יעילה מכיוון שהתחתית העגולה של טיפת התלייה מאפשרת את התקבצות תאי גזע עובריים, ובכך מספקת סביבה טובה להיווצרות גופי עובריים (Embry bodies). בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי ניתן לשלוט במספר תאי הגזע העובריים המתקבצים בטיפת התלייה על ידי שינוי מספר התאים בתרחיף התאים הראשוני. זהו כל הפרוצדורה.תודה לצפייה. בהצלחה בניסוי שלכם.

in-vitro-differentiation-mouse-embryonic-stem-mes-cells-using-hanging

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זה פרוטוקול הפרטים גזירת להשתלה בתאי גזע hematopoietic מתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) הזרקת הבאים שלהם לעכברים הנמען מוקרן קטלנית. בקצרה, הם ESC להבדיל גופים embryoid, אשר נגועים אז עם HoxB4 retroviral ושיתוף תרבותי עם OP9 תאים סטרומה וציטוקינים hematopoietic.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה כדי לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid.

טיפולית נידחת תלוי טיפות: דרך פשוטה טופס ותרבות גופים Embryoid

אנו מתארים את השימוש assay ES תא העכבר מבוסס לזהות חלונות זמן קריטי עבור Wnt / β-catenin והפעלה BMP אות במהלך אינדוקציה קרדיוגני. השיטה מספקת פלטפורמה סטנדרטית אשר מכמת אמין יעילות קרדיוגני, וזה החלים על המחקר של שושלות תאים אחרים.

השתנה עכבר תא גזע עובריים Assay מבוסס על כימות יעילות אינדוקציה קרדיוגני

פיתחנו פרוטוקול חדש כדי לשפר את היעילות של של בידול חוץ גופית של עובריים של עכברים לתאי גזע לתוך הנוירונים המוטוריים. בתאי גזע עובריים הבדיל רכשה המנוע נוירונים תכונות כפי שמעיד הביטוי של עצביות ומוטוריות סמנים הנוירונים באמצעות טכניקות immunohistochemical.

בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע

הסרטון מדגים את ההתמיינות של תאי גזע עובריים של עכברים (mESCs) לגוף עוברי (EBs) בשיטת הטיפה התלויה. עם השעיית תאי גזע עובריים בטיפות תלויות ודגירה, התאים מצטברים ליצירת EBs, אשר מתמיינים עוד יותר לתאי אב עצביים (NPCs) באמצעות מדיום התמיינות בתוספת חומצה רטינואית (RA).

יצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים של עכבר בשיטת הטיפה התלויה

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת תאי אב עצביים (NPCs) במבחנה מתאי גזע עובריים של עכברים (mESCs). mESCs מתורבתים בתרחיף ליצירת גופים עובריים (EBs), אשר מונחים לאחר מכן להתמיין NPCs באמצעות טיפול בחומצה רטינואית בתרבית דבקה.

טכניקה ליצירת תאי אב עצביים מתאי גזע עובריים של עכברים

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את השיטה ליצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים בשיטה חד-שכבתית נטולת סרום. ניתן להשתמש באבות אלה כדי לגזור סוגי תאים עצביים בוגרים או לחקור את תהליך המפרט העצבי והם ניתנים לקנה מידה של פורמט מרובה בארות עבור סינון מורכב.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

אנו מתארים את ההליך של הבחנה במבחנה של תאי גזע עובריים עכבר לתאים עצביים באמצעות שיטת טיפה תלויה. יתר על כן, אנו מבצעים ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנטיות, RNA-seq, וציטומטריית זרימה.

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

למדו בידול תאי גזע עובריים בעכבר לגופי עובר בשיטת הטיפה התלויה. שיטה זו מאפשרת שליטה באגרגציית התאים ומקדמת מחקר בביולוגיית תאי גזע ורפואה רגנרטיבית.

בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (MES) תאים שימוש בשיטה Drop Hanging

גלה סרטונים נוספים