בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (MES) תאים שימוש בשיטה Drop Hanging
23 ביולי 2008
סרט הווידאו הזה מדגים כיצד ההתנהגות בידול במבחנה של תאים עובריים בעכבר לגופים embryoid בשיטת ירידה תלוי.
לתאי גזע יש פוטנציאל יוצא דופן להתפתח לסוגי תאים רבים ושונים בגוף. משמש כמעין מערכת תיקון לגוף. הם יכולים באופן תיאורטי להתחלק ללא הגבלה כדי לחדש תאים אחרים.
כאשר תא גזע מתחלק, לכל תא חדש יש פוטנציאל להישאר תא גזע או להפוך לסוג אחר של תא עם תפקוד מיוחד יותר. תחום מדעי מבטיח זה מוביל מדענים לחקור את האפשרות של טיפולים מבוססי תאים לטיפול במחלות במבחנה. התמיינות של תאי גזע עובריים מתרחשת כאשר נותנים לתאים להצטבר בתרבית מתלה.
בהיעדר עובריים של עכברים, מזינים פיברובלסטים וגורם מעכב לוקמיה, אגרגטים של תאים אלה נקראים גופי עובר. שיטת הטיפה התלויה היא הליך יעיל אחד להתמיינות תאי גזע לגופי עובר במבחנה. היי, אני שה חואן מהשמאלי של המחלקה לרפואת לב וכלי דם באוניברסיטת סטנפורד.
היום נראה לכם נוהל להתמיינות אינדיבידואלית של תאי גזע עובריים כדי להפיק את הגוף בשיטת הטלת היד. בדרך כלל אנו משתמשים בשיטה זו כדי להבדיל תאי גזע עובריים לקרדיומיוציטים. הליך זה, כולל השלבים הבאים, הכנת תרחיף תא בודד של תאי גזע עובריים, יצירת תרביות טיפות ידניות, העברת תרביות טיפות ידניות ללוחות הצמדה נמוכים במיוחד, וציפוי גופים אמברואידים על צלחות מצופות בולטות.
אוקיי, בואו נתחיל. השלב הראשון בהליך הוא הכנת תרחיף תא בודד של תאי גזע עובריים. מכיוון שאנו מגדלים את תאי הגזע העובריים הלא ממוינים שלנו על ידי גידולם על פיברובלסטים עובריים של עכברים, עלינו לנתק את התאים ולהפריד אותם מהפיברובלסטים.
כדי לעשות זאת, אנו מנסים לאוורר את התאים באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות. לאחר השלמת הניסיון והטיפול, הוסף מדיום תאי גזע עובריים של עכבר כדי לנטרל את הטריפסין. לאחר מכן, העבירו את מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מיל.
לאחר מכן פרק את מושבות התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כנגד תחתית הצינור עד לקבלת תרחיף עדין של תאים ללא גושים גלויים. עכשיו סובב את התאים באלף סל"ד למשך חמש דקות. לאחר הסיבוב התאים שואבים מהסופרנט ומשעים מחדש את התאים עם 10 מיל של תאי ES של עכבר. בינוני.
העבירו את תרחיף התא לבקבוק T 75 מקודד מראש עם 0.1% ג'לטין ודגרו ב-37 מעלות עם 5% CO2 למשך שעה. לאחר שעה, הפיברובלסטים נצמדו לצלחת, אך תאי הגזע נשארים בתווך. פיפטה במעלה המדיום כדי לאסוף את תאי הגזע.
סובב את התאים באלף סל"ד במשך חמש דקות ושאף מהמדיום. לאחר מכן הוסיפו עוד 10 מיל של מדיום התמיינות, והשעו מחדש את התאים על ידי פיפטינג חוזר ונשנה עד שנראה שיש השעיה עדינה של תאים. ספרו את התאים באמצעות ציטומטר המו.
כעת אנו מוכנים לתרבית את תרחיף התאים בשיטת הטיפה התלויה. כדי להתחיל בתרבית הטיפה התלויה, השתמש בחציון התמיינות כדי לדלל את תרחיף תאי הגזע לריכוז של 500 תאים ל-20 מיקרוליטר. לאחר מכן, הפוך כיסוי צלחת תרבית רקמות בגודל 150 מילימטר.
לאחר מכן פיפטה 20 מיקרוליטר של מתלה התא על המשטח הפנימי של מכסה הצלחת. בעזרת פיפטר רב ערוצי, הוסף 10 מיל PBS לצלחת. הפוך במהירות את מכסה הצלחת והנח אותו בעדינות על הצלחת ליצירת הטיפות התלויות.
לאחר שמכסה הצלחת נמצא במקומו, העבירו בזהירות את הצלחת לתרבית החממה. התאים היו ללא הפרעה במשך יומיים. לאחר השלמת הדגירה, נמשיך בהעברת תרבית הטיפה התלויה ללוחות הצמדה נמוכים במיוחד.
לאחר יומיים, הפוך בזהירות את מכסה הצלחת הבא שאב 180 מיקרוליטר מדיום התמיינות טרי, והכניס כמה טיפות לצלחת חיבור נמוכה במיוחד של 96 באר. לאחר מכן הרם את הטיפות בעזרת פיפטה והעביר אותן אחת אחת לצלחת 96 הבאר. הכניסו את הצלחות לחממה ללא הפרעה למשך שלושה ימים.
גופי העובר ימשיכו לגדול לצורת כדור. כשהדגירה תושלם, נהיה מוכנים לצלחת את גופי העוברים. על מנת לעזור לגופי העובר להמשיך להתמיין.
אנו מעבירים אותם לצלחת מצופה ג'לטין 48 היטב. לשם כך אנו מצפים תחילה כל באר של הצלחת ב -300 מיקרוליטר של 0.1% ג'לטין. לאחר הוספת הג'לטין, דגרו את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, שאפו את הג'לטין מצלחת 48 הבארות. לאחר מכן הוסף 300 מיקרוליטר של מדיום התמיינות לכל אחד. ובכן, עכשיו מעבירים בזה אחר זה את גופי העוברים מבאר 96 לבאר 48 הלוחות המצופים בג'לטין.
בדרך כלל אנו מחליפים את המדיום למחרת ולאחר מכן כל יומיים כדי לשמור על התאים. אנו משתמשים בשיטה זו כדי לחפש פרוטוקולים טובים יותר להתמיינות תאי גזע עובריים. בקרדיומיוציטים, זה עתה הראינו לכם כיצד לבצע התמיינות במבחנה של תאי גזע עובריים של עכברים באמצעות תרביות טיפות תלויות.
שיטה זו יעילה מכיוון שהחלק התחתון העגול של הטיפה התלויה מאפשר צבירה של תאי גזע עובריים, ובכך מספק סביבה טובה להיווצרות גופי אמברי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שניתן לשלוט במספר תאי הגזע העובריים המצטברים בטיפה תלויה על ידי שינוי מספר התאים בתרחיף התא הראשוני. זהו.
תודה שצפית. בהצלחה בניסוי שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים בידול in vitro של תאי גזע עובריים של עכבר לגופי עובריים (embryoid bodies) באמצעות שיטת טיפת התלייה (hanging drop method). לתאי גזע יש פוטנציאל להתפתח לסוגים שונים של תאים, והם משמשים כמערכת תיקון עבור הגוף.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- דיפרנציאציה של תאים
- טכניקות תרבית in vitro
רקע
- תאי גזע יכולים, תיאורטית, להתחלק ללא הגבלה.
- כל תא חדש יכול להישאר תא גזע או להפוך לתא מותמחה.
- תחום זה במדע מוביל לפיתוח פוטנציאלי של טיפולים מבוססי תאים.
- דיפרנציאציה של תאי גזע עובריים מתרחשת בתרבית סוספנסיה.
מטרת המחקר
- להדגים את הדיפרנציאציה של תאי גזע עובריים.
- להציג את שיטת הטיפה התלויה (hanging drop) עבור אגרגציה של תאים.
- לספק תובנות לגבי יישומים טיפוליים פוטנציאליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיפרנציאציה in vitro של תאי גזע עובריים של עכבר.
- שיטת הטיפה התלויה (Hanging drop) לאגרגציה של תאים.
- טכניקות לתרבית תאים בסספנסיה.
- תצפית על היווצרות גופי גזירה (embryoid bodies).
תוצאות עיקריות
- היווצרות מוצלחת של גופים עובריים (embryoid bodies) מתאי גזע.
- הדגמת יעילותה של שיטת הטיפה התלויה (hanging drop).
- תובנות לגבי תהליך הדיפרנציאציה של תאי גזע.
- השלכות פוטנציאליות לטיפולים מבוססי תאים.
מסקנות
- שיטת הטיפה התלויה יעילה עבור דיפרנציאציה של תאי גזע.
- ניתן להוות גופי Embryoid in vitro מתאי גזע עובריים של עכבר.
- טכניקה זו עשויה לקדם את המחקר ברפואה רגנרטיבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
יצירה מבוקרת של גופי Embryoid מאפשרת דיפרנציאציה הדירה וניתנת לשחזור in vitro של תאי גזע עובריים של עכבר, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובהפחתת סיכונים מכניסטיים במחקר של רפואה רגנרטיבית. שיטת טיפת התלייה (hanging drop method) מספקת גישה סטנדרטית וניתנת להרחבה ליצירת אגרגטים רב-תאיים הומוגניים, ובכך מפחיתה את השונות בסריקות פנוטיפיות ובפיתוח בדיקות בשלבים הבאים. טכניקה זו מגבירה את מידת הביטחון בניבוי על ידי מתן אפשרות לבקרה מדויקת על מספר התאים, מה שמקל על יצירת גופי Embryoid עקביים לצורך בדיקת היפותזות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מסלולי התמיינות של תאי גזע ותיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות יצירה מבוקרת של גופי אמבריואיד.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת מערכת הניתנת לשחזור להערכת מחויבות לשושלת תאים ומסמני התמיינות מוקדמים.
- ערך חיזוי: משפר את תעדוף הפורטפוליו על ידי מתן אפשרות להערכה סטנדרטית של יעילות ההתמיינות תחת הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנה של מערכות גופי עובר (embryoid body) מתוקפות לצורך סריקת תרכובות והערכה פנוטיפית בהמשך התהליך.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה ושלב שחזור של הבדיקה באמצעות אגרגציה מבוקרת של תאים בטיפות תלויות (hanging drops).
- יכולת הרחבה: מאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה והערכה עקבית של תרכובות על פני בארות ולוחיות מרובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי יצירת גופים עובריים (embryoid bodies) המדמים תהליכי התפתחות מוקדמים הרלוונטיים לטיפולים רגנרטיביים.
- ערך תפעולי: מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות ייצור סטנדרטי של גופים עובריים.
- הפחתת סיכונים: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכונים על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית של קינטיקת הדיפרנציאציה וההומוגניות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטת הטיפה התלויה משתלבת ברצף הגילוי, החל משלבים מוקדמים של בידול תאי גזע, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך מאפשרת יצירה סטנדרטית של גופי Embryoid לצורך סריקה טיפולית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי אפשור אגרגציה מבוקרת של תאי גזע עובריים של עכבר לגופי עובריים (embryoid bodies).
- סינון: מספקת מוכנות למבחנים ויכולת שחזור באמצעות יצירה אחידה של גופי עובריים, ובכך מקלה על השגת תוצאות אמינות בסריקת תרכובות.
- אנליזה: מספקת פלטים כמותיים כגון גודל, מספר ומורפולוגיה של גופי עובריים לצורך השוואת תנאי дифפרנציאציה.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי יצירת גופי עובריים רלוונטיים למחלה לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים ומחקרי התאמה של ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כבסיס בר-שימוש חוזר בפנייה לפרויקטים הדורשים ייצור סטנדרטי של גופי עובריים עבור מבחני дифפרנציאציה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתוצאות דיפרנציאציה, תיקוף מטרות והפחתת עמימות מכניסטית במחקר תאי גזע.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של יצירת גופי אמבריואידים במעבדות ובניסויים שונים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בקווי פיתוח של רפואה רגנרטיבית.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על איכות עקבית של גופי אמבריואידים ויעילות דיפרנציאציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית תאי גזע, הכנת תרחיף תאים בודדים וטיפול בגופי Embryoid.
- תלוי בגישה לצלחות בעלות הידבקות נמוכה (low-attachment plates), משטחים מצופים בג'לטין ומדיות התמיינות סטנדרטיות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של ריכוז התאים, נפח הטיפה וזמני הדגירה להשגת תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת גופי Embryoid למשטחי תרבית שונים לצורך התמיינות המשך.
- מוגבל על ידי הצורך בדיוק בפיפטאציה ידנית ובטיפול זהיר למניעת פגיעה בגופי ה-Embryoid במהלך שלבי ההעברה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
1:10
Introduction
2:06
Preparing Single Cell Suspension of Embryonic Stem Cells
3:46
Generating Hanging Drop Cultures
4:39
Transferring Hanging Drops to Ultralow Attachment Plates
5:17
Plating Embryoid Bodies onto Gelatin- Coated Plates
6:12
Conclusion
