ב סימון במבחנה של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור דימות תהודה מגנטית

הדמיית תהודה מגנטית או MRI התגלתה כשיטת הדמיה דומיננטית לתאי גזע מושתלים מקומיים וכדי להבין טוב יותר את מנגנון ההתחדשות. מחקרי MRI אלה משתמשים בדרך כלל בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל כחומר ניגוד הדמיה. עם זאת, חלקיקי ברזל יכולים להישאר ברקמה לאחר מוות של תאי גזע ויכולים להיקלט על ידי מקרופאגים וכתוצאה מכך תנאים לא אופטימליים למעקב אחר התאים המושתלים בני הקיימא.

סרטון זה ידגים כי מנגן כלוריד הוא חלופה יעילה. תיוג חומרי ניגוד עם מנגן כלוריד מציע מספר יתרונות על פני תיוג תחמוצת ברזל. לדוגמה, מנגן נותן אות חיובי, ואילו אות שלילי מופק על ידי חלקיקי יונים.

בנוסף, ידוע כי יון מנגן נכנס לתאים דרך תעלות סידן מגודרות מתח. אז הופעתו ב-MRI מצביעה על כך שתאים פעילים ביולוגית יכולים לקיים אותו. היי, אני אמא יוני מהמעבדה של פיליפ יאנג במחלקה לרפואת לב וכלי דם באוניברסיטת סטנפורד.

היום אראה לכם כיצד לתייג תאי גזע עובריים אנושיים עם מנגן להדמיית תהודה מגנטית. הליך זה כולל את השלבים הבאים, תיוג תאי גזע עובריים אנושיים עם חומרי ניגוד המבצעים הדמיית תהודה מגנטית תאית במבחנה וניתוח תוצאות ה-MRI. אז בואו נתחיל.

השלב הראשון בהליך התיוג הוא הכנת תאי גזע עובריים אנושיים, שגודלו בתנאים ללא עובר. לשם כך, נסו את התאים למשך חמש דקות, ואז נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת אמצעי תרבית. לאחר מכן, סובב את התאים על ידי צנטריפוגה ב-800 RRP M למשך חמש דקות ב-20 מעלות צלזיוס.

לאחר השעיית לוח התאים ב-PBS, ספור את מספר התאים לפי טריפ וצביעה כחולה על סמך ספירת התאים שהתקבלה, חלק את התאים למספר הנדרש של quats לצינורות חרוטיים. במקרה הזה, אני מחלק את התאים לארבעה T של 3 מיליון תאים. חך את התא שוב על ידי צנטריפוגה רגע לפני תחילת תיוג המנגן ממיס מנגן כלוריד טרי ב-0.9% נתרן כלורי ליצירת תמיסת מנגן כלוריד של 0.1 מילי-מולרי.

על מנת לצפות בפעילות תעלות הסידן, התכוננו לדגימות. הדגימה הראשונה היא הבקרה שלנו, המכילה תאים שהודגרו ב-0.9% נתרן כלורי בלבד. הדגימה השנייה מכילה תאים שהודגרו בדגימות מנגן כלוריד של 0.1 מילי-מולארי, שלוש וארבע מכילות תאים שהודגרו ב-0.1 מילי-מולרי מנגן כלוריד עם חמישה מיקרו-מולרים של אגוניסט תעלת הסידן AK 8, 6, 44 או 250 מיקרומולר של אנטגוניסט תעלת הסידן.

הסכנה הבאה מדגרת את ארבע הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 30 דקות לאחר 30 דקות, סובבו את התאים ב-800 סל"ד למשך חמש דקות ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שאפו את חומר הסופאן ושטפו את התאים המסומנים פעמיים עם PBS. לאחר שטיפת ראוס, השעו כל משטח עם 200 מיקרוליטר PBS והעבירו לצינורות PCR.

משטחים אלה הם בדרך כלל לבנים. אוקיי, סיימנו להכין את התאים המסומנים במנגן למטרות השוואה. נכין גם תאים בשיטות תיוג הברזל המסורתיות יותר כדי להתחיל את תיוג הברזל.

פרוטמין סולפט בדרגה קלינית של ניק עם מים מזוקקים כדי לקבל תמיסת מלאי של מיליגרם אחד למיליליטר. לאחר מכן בצינור המכיל אמצעי תרבית תאי גזע עובריים אנושיים, הוסף תחמוצת סרט במאה מיקרוגרם למיליליטר בשילוב עם הפרוטמין סולפט ב-12 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן מערבבים את התמיסה למשך חמש דקות.

לאחר ערבוב התמיסה, הוסף אותה לתאים שלך באמצעות נפח שווה של התמיסה המעורבת ואמצעי תרבית התאים כדי להשיג ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר תחמוצת ושישה מיקרוגרם למיליליטר של הפרוטמין סולפט. דגרו תאים למשך 12 שעות לאחר 12 שעות, שטפו את התאים פעמיים עם PBS כאשר הכביסה האחרונה המכילה 10 יחידה למיליליטר הפרין כדי להמיס את קומפלקס חלבון התחמוצת החוץ-תאית. לאחר שטיפת תאי טריפסין לקבלת תרחיף תא בודד, ספרו את התאים ו-qua למספר הדגימות הנדרש.

במקרה הזה, אני מכין דגימה אחת עם מיליון תאים והשנייה עם 3 מיליון תאים. לאחר מכן תאי P, יש לחפור את הפלטות הללו כתום, בצבע חום. לבסוף, אנו מחדשים כל משטח עם 200 מיטה של PBS ומעבירים לצינורות PCL.

אוקיי, סיימנו לתייג את התאים. בואו נמשיך עם הדמיית ה-MR הסלולרית. כדי להתחיל בהדמיה, אנו מכינים תחילה פנטום על מנת לייצב את הצינורות המכילים את פלטות התאים וגם כדי למנוע חפצים מהאוויר שמסביב במהלך הסריקה.

לשם כך, מערבבים 1% של נחושת גופרתית ו-0.8% של אגר במים מזוקקים ומביאים לרתיחה במיקרוגל למשך חמש עד שבע דקות. לאחר מכן מצננים את התערובת הזו לפחות שעה כדי להשיג ג'ל. לאחר מכן, הצינורות המכילים את כדורי תא התווית מונחים בפנטום לסריקה.

MRI סלולרי במבחנה מבוצע עם סורק 3.0 T באמצעות סליל ברך קליני. אנו משתמשים ב-Signa מתוצרת GE Medical Systems כדי לסרוק את התאים המסומנים במנגן עבור כל אחת מארבע הדגימות באמצעות רצף הד ספין. פרמטרים לרצף עובדו ממיפוי T שנחקר בעבר של התאים המסומנים.

אנו משתמשים בזמן הד לפחות, זמן חזרה של 800 אלפיות השנייה, שדה ראייה של מטריצה 12 על 12 סנטימטר, 2 56 על 2, 56. הבא. לאחר מכן, סרוק את התאים המסומנים בברזל באמצעות רצף הד שיפוע.

אנו משתמשים בפרמטרים הבאים להדמיה זו. זמן הד של 10 אלפיות השנייה, זמן חזרה של מאה אלפיות השנייה. זווית היפוך של 30 מעלות, שדה ראייה של מטריצה 12 על 12 סנטימטר 2 56 על 2 56 והבא.

אוקיי, כולנו סיימנו עם ההדמיה. עכשיו בואו נסתכל על התוצאות. להלן תוצאות סריקת ה-MRI עבור ארבע דגימות שונות של תאים מסומנים במנגן.

דגימה מספר אחת היא הבקרה שלנו, המכילה תאים שהודגרו ב-0.9% נתרן כלורי בלבד. דגימה מספר שתיים מכילה תאים שהודגרו ב-0.1 מילי-מולרי מנגן כלוריד. דגימה מספר שלוש מכילה תאים שהודגרו ב-0.1 מילי-מולרי מנגן כלוריד עם חמישה מיקרו של אגוניסט תעלת הסידן vacay 8 6 4 4.

דגימה מספר ארבע מכילה תאים שהודגרו ב-0.1 מיליון MO מנגן כלוריד עם 250 מיקרו מורה של צעיף אנטגוניסט תעלת הסידן. בהשוואה לתאים המסומנים במנגן בלבד, עוצמת האות עולה בנוכחות אגוניסט תעלת הסידן ופוחתת בנוכחות אנטגוניסט תעלת הסידן. שטח עליית האות עבור תאים מסומנים במנגן נמדד באמצעות תמונה J.תוצאות אלה מצביעות על כך שהמנגן אכן נכנס דרך תעלת הסידן המגודרת במתח.

עכשיו בואו נשווה את התוצאות האלה לתוצאות של התאים המסומנים בברזל. שימו לב להבדל בין האות החיובי הבהיר מתאים המסומנים במנגן לעומת האות השלילי הכהה מתאים המסומנים בברזל. זה עתה הראינו לך כיצד לבצע תיוג מנגן של תאי גזע עובריים אנושיים להדמיית תהודה מגנטית תאית במבחנה.

הליך זה הוא שיטה יעילה למעקב אחר תאי גזע מכיוון שניתן להחדיר מנגן אחד בקלות לתאים באמצעות דגירה פשוטה של 30 דקות. שניים, תאים מסומנים במנגן מספקים תמונות ברורות עם אות חיובי ושלושה מנגן נכנסים לתאים דרך תעלת הסידן המגודרת במתח כפי שמוצג על ידי שימוש באגוניסטים ואנטגוניסטים של תעלת סידן, וכך נכנס רק לתאים הקיימאים. לכן, אנו מאמינים כי לתיוג מנגן של תאי גזע עובריים אנושיים יש פוטנציאל גדול ל-MRI תאי מדויק in vivo כדי לעקוב אחר ההשפעה של תאי גזע עובריים אנושיים מושתלים באזורים פגועים איסכמיים.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.