Name: הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-15T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: למדו את שיטת המיקרו-הזרקה ליצירת תולעים טרנסגניות של C. elegans. השיטה מאפשרת הדמיה של ביטוי גנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להכיר את רוח שיתוף פעולה של כל חברי המעבדה קולדוול. הפרעות תנועה מחקר במעבדה כבר נתמך על ידי דיסטוניה בכמן-Strauss &amp; פרקינסון קרן, קרן הברית פרקינסון, מחלת פרקינסון האגודה האמריקאית, מחלת פרקינסון איגוד אלבמה, ג&#39;יי מייקל פוקס, קרן למחקר פרקינסון מחקר לתואר ראשון.

הביטוי פלסמיד בנייה שני פלסמידים נדרשים: אחד עבור הביטוי רקמות ספציפיות של הגן ריבית שנייה כסמן שינוי לבחירה. ניסיוני פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר האמרגן אשר באה לידי ביטוי סוג רקמה / תא של עניין, למשל, עצב או שריר ספציפי האמרגן. אם אחד הוא להביע גנים מרובים בתוך הרקמה באותו קלטת האמרגן פלסמיד במערכת Gateway (Invitrogen) יכול לשמש. גישה זו מאפשרת החדרת גן כל הזרם עניין של האמרגן על ידי 4 שיבוט recombinational. ככלל, 2-5 קילו של רצפים הזרם מספיקה יש ביטוי נכון ומדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CDNA של הגן של עניין ניתן לשכפל בשתי דרכים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוט קונבנציונלי באמצעות אנזימי הגבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שיבוט Gateway, הוא מוגבר באמצעות PCR primers המכילים את עו&quot;ד Gateway רצף B recombinational. CDNA הגברה הוא recombined הראשון לתוך pDONR201 התורם וקטור כדי ליצור את וקטור הערך ולאחר מכן הפך E. coli זן DH5a. להלן מבחר של recombinants מוצלח ומיני הכנה הבידוד של ה-DNA, וקטור הכניסה recombined לתוך וקטור המכיל מקדם היעד כדי ליצור את הביטוי פלסמיד. פרטים על שיבוט recombinational זמינים ידנית או Gateway Invitrogen או קולדוול et al. 5. </li></ol></li></ol> דה מרקר לבחירה פלסמיד דוגמאות של פלסמידים סמן מהונדס כוללים רול-6 או שימוש מקדם קיר השרירים בגוף UNC-54 לנהוג ביטוי חלבון פלואורסצנטי. אלה פלסמידים סמן זמינים בדרך כלל מתוך הקהילה מחקר על פי דרישה. Microinjection של C. elegans הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע בידוד DNA של שני פלסמידים, כי הם להיות מוזרק. לכמת אותם ומערבבים יחד ביחס של 1:1 של 50 ng / μl כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת כריות אגר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרון 2% agarose במים; חום או במיקרוגל עד שהיא נמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מספר 22 x 50 מ&quot;מ על המשקפיים לכסות benchtop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר, במקום ירידה של agarose נמס על כוס אחת לכסות מיד במקום זכוכית העטיפה השנייה על ירידה בזווית של 90 על הראשונה. חזור על מספר המשקפיים לכסות אחרים. הקוטר של הדיסק שטוח של agarose צריך להיות בין 15-20 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose יש הקרושה (זה לוקח רק רגעים), להסיר את הזכוכית המכסה ולאפשר כרית אוויר יבש לגמרי (כמה שעות בלילה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות כריות בתא זכוכית לכסות בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את מעמיסים מחט פתרון ה-DNA: מעמיסים מחט נוצרות 100 צינורות נימי μl כי מחוממים באמצע מעל להבה פתוחה ומשך במהירות אורך כ פעמיים שלהם. שני חצאים הם התיז מלבד פעם את צינור נימי מתקרר. לאגור 10-20 מעמיסים מחט להזרקה. חנות זקוף מתלה צינור microcentrifuge. היזהר שלא לדקור את עצמך על הנקודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המחטים microinjection: המחט עשוי צינור נימי מיוחד המכיל סיב זכוכית פנימית; נימה זו משמשת הפתיל עבור פתרון ה-DNA. אלה משכו במחשב מחט חולץ. אנו משתמשים PP-830 Narishige חולץ עם הגדרה חום של 24.8. כמה מחטים נמשכים בכל פעם מאוחסנים בקופסת פלסטיק קטנה. מחטים מרובות ניתן בקלות &quot;רכוב&quot; על פיסת פלסטלינה עבור אחסון לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצה המחט &quot;פורעי&quot;: קצה המחט microinjection נמשך קנס כך שהיא למעשה סגורה על זה בסוף וצריך שבור פתוח באמצעות רסיסים קטנים של זכוכית המכסה. אלה מוכנים על ידי לפפה 18 x 18 מ&quot;מ זכוכית לכסות במגבת נייר ובעדינות הפעלת לחץ עד שהוא נשבר לחתיכות מספר. שברי גודל שימושי כ 3 x 4 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול פרא (N2) תולעים סוג לשלב הבגרות המוקדמת להזרקה באמצעות נהלים תקן 6. הכן על 100 מבוים כהלכה תולעים / לבנות מוזרק. </li></ol> נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את השסתום הראשי על טנק הליום המחובר זרוע microinjection המחט מחזיק. סגור את שסתום הרגולטור על מנת לאפשר הגז כדי להזין את הקו, להביא את הלחץ עד 35 psi. שימו לב כי גז ניתן לשחרר באמצעות דוושת רגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מטעין מחט לתוך צינורות pipetter תקן הפה (נמצא במיכלים של צינורות זכוכית נימי) וכן להכין כמות קטנה של התערובת פלסמיד (~ 1 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטעין המחט ממוקם בזהירות לתוך האחורי של מחט מזרק ונוסף בעדינות לאורך כל הדרך באורך שלהמחט עד התנגדות מורגשת. לגרש את פתרון ה-DNA על ידי נושבת בעדינות, ולאחר מכן להסיר את מטעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט בזרוע microinjection, נזהר כדי למקם אותה בתוך אטם גומי קטן הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שבר מחט שבירת הכוס לכסות על קצה אחד של משטח אגר. מכסים את הרסיס, כמו גם את פני השטח של כל כרית אגר, עם שמן halocarbon. הנח את כרית אגר על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את המחט במרכז השדה צפייה באמצעות המטרה 4X ואת התאורה שדה בהיר, אבל עדיין לא הורידו אותה לתוך השמן. כמו כן, עמדת הקצה הפנימי של רסיס של זכוכית לכסות במרכז, ולאחר מכן להתמקד בה (עדיין משתמש המטרה 4X). מנמיכים את מחט לתוך השמן, להביא אותו לתוך המטוס מוקד כמו רסיס של זכוכית המכסה. תרים את ההגדלה ידי מעבר המטרה 40X. מקדו מחדש על סף שבר ואת למקם את קצה המחט, במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפתוח את קצה מחט הזריקה, דחיפה בעדינות את המחט על קצה הזכוכית המכסה שבר, ואילו באותו זמן החלת פולסים קצרים של גז באמצעות דוושת רגל. המחט יהיה שבור מספיק פתוח כאשר טיפות קטנות של נוזל לברוח לסוף המחט. זרימת נוזל עודף בשל פתיחת גדולה מדי אינו רצוי, שכן הוא יהרוג את החיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כרית אגר משלב ידי הרמת את המחט, אבל לא לשנות את ה-X או ציר Y המיקום. החלק את הבמה החוצה מתחת למחט, הסר את פנקס אגר ומניחים אותו על גבי מיקרוסקופ לנתח. העברת תולעת על כרית, מתחת לפני השטח של השמן. אם תולעת מתפתלת, שבץ בעדינות עד שהוא קשר את הפנקס אגר. התולעת לח צריך לדבוק agarose יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות למקום לרפד אגר בחזרה אל הבמה, מרכוז תולעת בתחום התצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את מחט לתוך המטוס אותו להתמקד כמו התולעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המסננים כדי הופמן תאורה (סוג של מסנן ניגודיות). זה מאפשר פרט המורפולוגי של התולעת להיות גלוי. אם Nomarski / אופטיקה DIC זמינים על היקף הפוך זה יעבוד גם. שימוש המטרה 40X, להתמקד במרכז &quot;מגורען&quot; סינסיציאלי של בלוטת המין התולעת, מתחת דפוס &quot;חלת דבש&quot; של גרעיני נבט (לבחור לפי אשך ממוקם בצד של התולעת מול מחט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוונן את המיקום של המחט עד קצה גם בפוקוס (את המטוס כמו &quot;גרעיניות&quot; את בלוטת המין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בעדינות את המחט למרכז אשך ולהחיל הדופק קצרה של לחץ הגז לגרש טיפה או שתיים של דנ&quot;א לתוך הזרוע בלוטת המין. אתה צריך לראות גל של התפשטות הנוזל על פני אשך הדיסטלית. אל תניחו נוזלי יותר הוא טוב יותר, שכן נוזלי מדי יכול לזרום לתוך העיקול הפרוקסימלי של הזרוע בלוטת המין, אשר יכול לסגור ייצור הביצית. במידת האפשר, בהתאם למיקום של התולעת, להזריק הזרוע בלוטת המין השני באותו אופן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לעבוד במהירות תוך הזרקת תולעת, כפי שהוא יכול בקלות ליבש. ההחלטה להזרים הזרוע בלוטת המין השני הוא תלוי כמה מהר אתה יכול מחדש לתפקיד תולעת המחט. התהליך כולו רצוי לקחת פחות מ 1-2 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מכסה זכוכית משלב ולמקם אותו על היקף הניתוחים. החל 1μl של M9 חיץ (22mm KH 2 PO 4, 42mM Na 2 HPO 4, NaCl 85mm, 1mm MgSO 4) ישירות על גבי התולעת מוזרק (זו עלולה להביא לפעולה והטביע את קצה פיפטה מתחת לפני השטח של הנפט halocarbon). המאגר אמור רעננותם התולעת, הוא יהיה אז לצוף מעל פני השטח משטח agarose. מעבירים את התולעת לצלחת קבוע באמצעות לאסוף תולעת. כרית agarose ניתן לעשות שימוש חוזר כמה פעמים עד שזה יותר הפך רווי מדי עם חיץ התולעים כבר לא לדבוק. </li></ol> טראנסגנטי בחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעים מוזרק, דור P 0, מועברים הפרט, צלחות טרי seeded bacterially (60 מ&quot;מ) מותר להתרבות. בדרך כלל, בעלי חיים מוזרק מודגרת על 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים עד הצאצאים להופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצאצאים 1 F הם נצפו ראיות של הסמן מהונדס (כגון פלואורסצנטי) באמצעות stereomicroscope ניאון. כל נושא ניאון, F 1, בעלי חיים משובטים היא בנפרד לצלחת חדשה (מאז צאצאים של F כל 1 נחשבים קו מובהק). F 1 הרמפרודיטים מותר להתרבות. שוב, זה מתבצע בדרך כלל על 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים עד הצאצאים להופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דור 2 F הוא ציין לבעלי חיים מהונדס גם כן. F 2 חיות ירשו ולהביע את מערך מהונדס נחשבים קו &quot;יציב&quot;. הערה: לכל 1 F רחובגיל ייתכנו חיים מהונדס רבים, אך הם אינם יציבים. רוב F 1 חיות טרנסגניות לא יופצו לתוך F 2 קווי יציב. הערה: כדי לשלוט על השתנות במספר עותק הגן, ליצור מינימום של שלוש שורות יציב עצמאית לכל לבנות מוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל שורה יציבה עצמאי צריך להישמר כפי בשורה נפרדת של תולעים. כל שורה יכולה להיות מופצות על ידי העברת בעלי חיים מהונדס מספר לוחית חדשה בכל דור, זה חייב להתבצע באמצעות stereomicroscope פלורסנט אם את הסמן לבחירה הוא פלורסנט. </li></ol>

<ol><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li>
<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

כשעושים הליך זה, חשוב לזכור: - להזריק ישירות למרכז אשך - לא להזריק יותר מדי נוזלים - עובדים מהר כדי למנוע dessication. אם אתה נתקל בבעיות עם מחט, כגון זה נשבר גדול מדי, עדיף מהדורה מחודשת מחט טריים, במקום לנסות להזריק עם מחט פחות אידיאלי. הדור של תולעים מהונדס יש יישומים רבים, כגון: - זיהוי של גנים שעברו מוטציה, בשיטה המכונה הצלה שינוי - מיפוי של תחומים חלבון דרך ביטוי של ...

<table><tbody><tr><td>אגרוז</td><td>Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>שמן הלוקרבון, Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי 18x18 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי 22x50 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>קפילרית 100 ul</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>קפילרית זכוכית למחטים</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מחטים</td><td>כלי</td><td>Narishige International</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>מערכת microINJECTOR</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>מיקרוסקופ, במה, מניפולטור</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציית עם פלואורסצנציה</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציית</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

הדור של stable טראנסגנטי c. elegans שימוש microinjection

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

טראנסגנטי Caenorhabditis elegans ניתן ליצור בקלות דרך microinjection של פתרון ה-DNA פלסמיד לתוך בלוטת המין 1. ה-DNA פלסמיד מארגן מחדש כדי ליצור concatamers extrachromosomal כי הם ירשו ביציבות, למרות שלא כמו כרומוזומים בפועל 2 עם יעילות זהה. הגן של עניין הוא שיתוף מוזרק עם סמן פנוטיפי ברור, כגון רול-6 או ה-GFP, כדי לאפשר בחירה של בעלי חיים מהונדס תחת מיקרוסקופ לנתח. הגן אקסוגני יכול להיות מבוטא מן האמרגן שלו דובר ללימודי לוקליזציה הסלולר. לחלופין, transgene יכול להיות מונע על ידי האמרגן שונה ברקמות ספציפיות על מנת להעריך את התפקיד של המוצר גנים תא רקמה מסוימת. טכניקה זו יעילה כוננים ביטוי הגן בכל רקמות של C. elegans למעט העובר germline או בתחילת 3. יצירת חיות טרנסגניות הוא מנוצל באופן נרחב עבור מגוון של פרדיגמות הניסוי. וידאו זה מדגים את הליך microinjection לייצר תולעים מהונדס. יתר על כן, הבחירה ותחזוקה של יציבה מהונדס C. elegans קווי מתואר.

וידאו זה מדגים את הטכניקה של microinjection לתוך בלוטת המין של C. elegans כדי ליצור חיות טרנסגניות.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

ניתן ליצור בקלות תולעי *Caenorhabditis elegans* טרנסגניות באמצעות מיקרו-הזרקה של תמיסת פלסמיד DNA לתוך הגונדה 1. ה-DNA הפלסמי מסתדר מחדש כדי...

C. elegans הוא אורגניזם מודל שימושי ביותר, הן בשל הידיעות שלנו על שושלות התאים שלו והן בשל עושר המידע שהופק מרצף וניתוח הגנום המלא שלו. בסרטון זה, נדגים את תהליך ההזרקה המיקרוסקופית של פלסמידים לתוך C. elegans וברירה של צאצאים טרנסגניים באמצעות מיקרוסקופיה פלורסצנטית; מכיוון ש-C. elegans הוא בעל חיים שקוף ורב-תאי, הוא אידיאלי להדמיה של גנים טרנסגניים המבטאים חלבונים מסומנים פלורסצנטית in vivo. שלום, שמי לורה ברקוביץ ואני עובדת מחקר במעבדת קולדוול במחלקה למדעי הביולוגיה כאן באוניברסיטת אלבמה.ואני אדם נייט, גם אני מהמעבדה של קלוול באוניברסיטת אלבמה. היום אראה לכם כיצד להתכונן ולבצע מיקרו-הזרקה של פלסמידים כדי ליצור זני *C. elegans* טרנסגניים, ואראה לכם כיצד לבחור ולשמר שושלות של *C. elegans* טרנסגניות. אז בואו נתחיל.לפני שנתחיל בהזרקה המיקרוסקופית, ישנם מספר שלבי הכנה שאדגים לכם כעת. ראשית, הכינו את ה-plasmid DNA להזרקה; נדרשים שני פלסמידים, אחד המקודד לביטוי ספציפי לרקמה של הגן הנחקר, והשני המספק סמן בחירה לטרנספורמציה. ערבבו את הפלסמידים יחד ביחס של אחד לאחד בריכוז של 50 ng/µL.בשלב הבא, הכינו רפידות קיבוע (auger pads), אשר ישמשו להצמדת התולעים לצורך הזרקה. להכנת רפידות הקיבוע, הניחו תחילה מספר זכוכיות כיסוי בגודל 22 על 50 מילימטר על משטח העבודה. באמצעות פיפט פסטור, טפטפו טיפה של 2% agros מומס על זכוכית כיסוי אחת, והניחו מיד זכוכית כיסוי שנייה מעל הטיפה בזווית של 90 מעלות לראשונה.המתינו מספר שניות עד שהאירוג'ל יתמצב, ולאחר מכן הסירו את זכוכית הכיסוי העליונה. קוטרה של דיסקיט האירוג'ל השטוח צריך להיות בין 15 ל-20 מילימטרים. כפי שנעשה עם דגימות דומות, הניחו לפדית האירוג'ל להתייבש באוויר באופן מלא במשך מספר שעות או במהלך הלילה.לאחר שהם יבשים, אחסנו את הרפידות בקופסת זכוכית לכיסויים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו את טועני המחטים עבור תמיסת ה-DNA. לשם כך, קחו צינור נימי של 100 µL וחממו אותו במרכזו בלהבה פתוחה, ומשכו אותו במהירות עד למשך של פי שניים בקירוב מאורכו המקורי.לאחר שהצינור הנימי מתקרר, יש לשבור את שני החצאים. יש להכין מלאי של 10 עד 20 טעוני מחט להזרקה. ניתן לאחסן אותם במצב אנכי בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה.בראק, היזהר. קצות טוען המחטים חדים מאוד. כעת הכן את מחטי המיקרו-הזרקה.מחטים אלו עשויות מצינור קפילרי מיוחד המכיל פילמנט זכוכית פנימי. פילמנט זה משמש כפתיל עבור תמיסת ה-DNA. כדי להכין את המחטים, אנו משתמשים ב-Niki PP eight 30 Polar עם הגדרת חום של 24.8; מספר מחטים נמשכות בבת אחת לצורך אחסון.ניתן להרכיב מספר מחטים על פס של חימר למניפולציה. רסיסים קטנים של זכוכית כיסוי ישמשו לשבירת קצה המחט שנמתחה. רסיסים אלו מכינים על ידי עטיפת זכוכית כיסוי בגודל 18 על 18 מילימטר ב-Kim wipe והפעלת לחץ עדין עד שהיא נשברת למספר חלקים.השתמשו ברסיסים שגודלם כ-שלושה על ארבעה מילימטרים. בנוסף להכנת ה-DNA והמחטים, הכינו כ-50 עד 100 תולעים בשלב התפתחותי מתאים. שתי תולעים מסוג wild type עבור כל מבנה של וקטור ביטוי שיוזרק.אנו מוכנים כעת להגדיר את מיקרוסקופ ההזרקה המיקרוסקופית. כדי להתחיל בהגדרת המיקרוסקופ, פתחו את השסתום הראשי במכל ההליום המחובר לזרוע ומחזיק מחטי ההזרקה המיקרוסקופית. סגרו את הווסת כדי לאפשר לגז להיכנס לקו.בעת הגעה ללחץ של 35 PSI ניתן לשחרר את הגז באמצעות דוושה. לאחר מכן, הכנסו מטען מחט לתוך צינורית של פיפטור פה סטנדרטי וטפטפו כמות קטנה של תערובת הפלסמיד, כ-1 µL. כעת, הכניסו בעדינות את המטען לכל אורכה דרך מחט המיקרו-הזרקה עד להרגשת התנגדות.הוציאו את תמיסת ה-DNA על ידי נשיפה עדינה, ולאחר מכן הסירו את המטען. לאחר טעינת ה-DNA, הכניסו את המחט לזרוע המיקרו-הזרקה, תוך הקפדה למקם אותה בתוך אטם הגומי הפנימי הקטן, ולאחר מכן הצמידו אותה לזרוע המניפולטור. לאחר מכן, הניחו רסיס זכוכית כיסוי לשבירת מחטים על קצה אחד של מדבקת תמיכה (auger pad).כסה את הרסיס ואת כל שטח הפנים של משטח ה-auger בשמן פחמן חלול. לאחר מכן, הנח את משטח ה-auger על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. לאחר שמשטח ה-auger במקומו, מקם את המחט במרכז שדה הראייה באמצעות עדשת Forex ותאורת שדה בהיר (bright field), אך אל תוריד אותה עדיין אל תוך השמן.בשלב הבא, מקמו את הקצה הפנימי של רסיס זכוכית הכיסוי במרכז, ולאחר מכן התמקדו בו. הורידו את המחט אל תוך השמן, והביאו אותה לאותו מישור מיקוד של רסיס זכוכית הכיסוי. הגבירו את ההגדלה על ידי מעבר לעדשה 40 x, התמקדו שוב בקצה הרסיס ובמיקמו מחדש את חוד המחט במידת הצורך.כעת יש לשבור את קצה מחט ההזרקה. דחפו בעדינות את המחט כנגד קצה רסיס זכוכית כיסוי, ובמקביל הפעילו פולס קצר של גז באמצעות דוושת הרגל. כך קצה המחט יישבר באופן מספק.lors when droplets of liquid escape the end of the needle due to excessive liquid flow caused by an opening that is too large, this is undesirable שכן הדבר עלול להרוג את בעלי החיים. לאחר שהמחט מוכנה, נתחיל בהזרקה המיקרוסקופית. לאחר מכן, הסר את משטח הקיבוע (auger pad) מהבמה על ידי הרמת המחט למעלה.אך אין לשנות את מיקום ציר X או Y. החליקו את הבמה החוצה ממתחת למחט. הסירו את פד הקידוח והניחו אותה תחת מיקרוסקופ דיסקציה.העבירו תולעת אל הפד שמתחת לפני השטח של השמן. אם התולעת מתפתלת,לטפו אותה בעדינות עד שתבוא במגע עם פד הבורג, התולעת הלחה אמורה להידבק לבורג היבש. הניחו במהירות את פד הבורג חזרה על הבמה, כאשר התולעת ממרכזת בשדה הראייה.לאחר מכן, הרד את המחט לאותה מישור מיקוד של התולעת. העבר את המסננים במיקרוסקופ ההפוך לתאורת Hoffman. מסנן ניגודיות זה מאפשר להפוך את הפרטים המורפולוגיים של התולעת לנראים.באמצעות עדשה אובייקטיבית בעוצמה של 40x, התמקדו במרכז החושי הגרגירי של השחלה (gonad) של התולעת, מתחת לדפוס הדבש של גרעיני הנבט. בחרו בכל שחלה הממוקמת בצד של התולעת הפונה אל המחט. כוונו בעדינות את מיקום המחט עד שגם הקצה שלה יהיה במיקוד.החדירו בעדינות את המחט למרכז הגונד (gonad) והפעילו פולס קצר של לחץ גז כדי להוציא טיפה אחת או שתיים של DNA לתוך זרוע הגונד. עם תרגול רב ומיומנות, תוכלו להבחין בגל של נוזל המתפשט לאורך הגונד הדיסטלי. תוכלו לפגוע במרכז הגונד בכל פעם.יש לזכור כי חשוב לעבוד במהירות בעת הזרקה לתולעת, כיוון שהיא עלולה להתייבש בקלות. באופן אידיאלי, התהליך כולו אמור להימשך פחות מדקה עד שתי דקות.לאחר השלמת ההזרקה, הסירו את משטח המקדח מהבמה והניחו אותו תחת מיקרוסקופ דיסקציה. טפטפו מיקרוליטר אחד של M nine buffer ישירות על התולעת המוזרקת. פעולה זו עשויה לדרוש טבילה של קצה הפפיטה מתחת לפני השטח של ה-halo carb oil.הבופר אמור להחזיר את הלחות לתולעת, ואז היא תצוף מעל פני משטח ה-aeros pad; העבירו את התולעת לצלחת רגילה באמצעות פיק לתולעים (worm pick). כעת אמסור את התולעים המוזרקות לאדם, והוא ידגים לנו את הבחירה והתחזוקה של קווים טרנסגניים. התולעים המוזרקות מועברות לצלחות של 60 מילימטר נפרדות המזריעות מצע טרי, וניתן להן להתרבות.תולעים אלו מייצגות את דור ה-P zero. בדרך כלל, בעלי החיים המוזרקים מדגרים בטמפרטורה של 20 °C למשך יומיים עד שלושה ימים עד להופעת הצאצאים. לאחר הופעת הצאצאים, ניתן להתחיל בסינון של תולעים טרנסגניות.הצאצאים מדור F1 נבחנים כדי לאתר עדות לסמן הטרנסגני. במקרה זה, הסמן הניתן לבחירה הוא פלואורסצנטי, ולכן ניתן לבצע סריקה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. כל בעל חיים מדור F1 הנושא את הסמן הפלואורסצנטי משוכפל בנפרד על צלחת חדשה.ה-P zero המוזרק עשוי להוליד רק בין אחד לחמישה צאצאים פלואורסצנטיים מכלל ה-F1 שלו. יש לאפשר להרמפרודיטים של ה-F1 להתרבות ב-20 degrees במשך יומיים עד שלושה ימים עד להופעת הצאצאים. ברגע שדור ה-F two מוכן, בוחנים גם בו בעלי חיים טרנסגניים. בעלי חיים מדור ה-F two שירשו והביעו מרקר טרנסגני נחשבים לקו יציב.יש להחזיק כל קו יציב עצמאי כקו נפרד של תולעים; יש להרבות כל קו על ידי העברת מספר בעלי חיים טרנסגניים לצלחת חדשה בכל דור. פעולה זו חייבת להתבצע באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. אם הסמן לבחירה הוא פלואורסצנטי, כדי לשלוט בשונות במספר העותקים של הגן, יש להקים לפחות שלושה קווים יציבים עצמאיים עבור כל קונסטרקט שהוזרק.הראינו לכם כעת כיצד לבצע מיקרו-הזרקה של סומסומני וקטורי ביטוי, כיצד לזהות את ה-elgan וכיצד לבחור קווים יציבים. זהו זה. תודה שצפיתם בהם ובהצלחה בניסוייכם.

generation-of-stable-transgenic-c-elegans-using-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תולעים טראנסגנטי משמשים בדרך...

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

ב אורגניזמים מודל, transgenesis יכול לתפעל פונקציות גן בעוד RNAi יכול מציאה תעתיקי mRNA ספציפי 1-2. פרוטוקול זה נועד להמחיש את טכניקות צורך להציג DNA מועבר ביציבות וחולפת RNA גדילי כפול לתוך נמטודות...

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em

סרטון זה מתאר מיקרו-הזרקה, שיטה נפוצה ליצירת זני C. elegans טרנסגניים. בדוגמה נראה מיקרו-הזרקה המשמשת להחדרת קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) לעריכת גנים של בסיסי קריספר.

Gonad Microinjection: שיטה של העברת תרכובות ישירות לתוך הנבט של C. elegans

פרוטוקול זה מתאר הליך מהיר וצריכת חומר נמוך לשילוב של מערכים חוץ-כרומוזומליים טרנסגניים בגנום Caenorhabditis elegans באמצעות קרינה אולטרה סגולה (UV). יתר על כן, פרוטוקול זה מתאים במיוחד לקווים טרנסגניים המשדרים מערכים חוץ-כרומוזומליים בקצב גבוה.

פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום C. elegans

סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

Microinjection של ביציות העכבר משמש בדרך כלל עבור transgenesis קלאסי ( כלומר, שילוב אקראי של transgenes) ו CRISPR בתיווך גישור המיקוד. פרוטוקול זה סוקר את ההתפתחויות האחרונות microinjection, עם דגש מיוחד על בקרת איכות אסטרטגיות genotyping.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

ערכת הכלים הגנומית הפונקציונלית עבור הנמטודות הטפיליות סטרונגילואידים סטרקורליס וסטריונגילודים ראטי כוללת טרנסגנזה, מוטגנזה בתיווך CRISPR/Cas9 ו-RNAi. פרוטוקול זה ידגים כיצד להשתמש במיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית כדי להכניס טרנסג'נים ורכיבי קריספר לתוך S. stercoralis ו - S. ratti.

יצירת חומרים מהונדסים ונוקאאוטים במינים סטרונגילואידים על ידי מיקרו-אינטגרציה

תהליך הזרקה מיקרו-CRISPR/Cas9 לתיוג פלואורסצנטי אנדוגני בקו הנבט Caenorhabditis elegans לקבלת קווי הדחיפה הומוזיגוטיים לניתוח מיקום חלבונים בחיים.

תיוג פלואורסצנטי אנדוגני בתיווך CRISPR/Cas9 של גנים ספציפיים לקו הנבט ב-Caenorhabditis elegans

למדו את שיטת המיקרו-הזרקה ליצירת תולעים טרנסגניות של C. elegans. השיטה מאפשרת הדמיה של ביטוי גנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

גלה סרטונים נוספים