הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

אלגנטיות הים היא אורגניזם מודל שימושי להפליא הן בשל הידע שלנו על שושלות התאים שלו והן בשל עושר המידע המופק מריצוף וניתוח כל הגנום שלו. בסרטון זה, אנו מדגימים את תהליך הזרקת המיקרו של פלסמידים לאלגנטיות הים ואת בחירת הצאצאים הטרנסגניים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כחיה שקופה ורב-תאית, אלגנטיות ים אידיאלית להדמיית טרנסגנים המבטאים חלבונים המסומנים פלואורסצנטית in vivo. היי, שמי לורה ברקוביץ ואני עמיתת מחקר במעבדת קולדוול במחלקה למדעי הביולוגיה כאן באוניברסיטת אלבמה.

ואני אדם נייט, גם הוא ממעבדת קלוול באוניברסיטת אלבמה. היום אני אראה לך כיצד להתכונן ולבצע מיקרו-הזרקת פלסמין כדי ליצור אלגנטיות ים טרנסגנית, ואני אראה לך כיצד לבחור ולתחזק קווי אלגנטיות של חותם טרנסגני. אז בואו נתחיל.

לפני שנתחיל במיקרו-הזרקה, יש לנו כמה שלבי הכנה, אותם אראה לכם כעת. ראשית, הכינו את ה-DNA של הפלסמיד להזרקה, נדרשים שני פלסמידים, אחד המקודד את הביטוי הספציפי לרקמה של הגן המעניין שלנו, והשני המספק סמן טרנספורמציה לבחירה. מערבבים את הפלסמידים יחד ביחס של אחד לאחד של 50 ננוגרם למיקרוליטר.

בכל פעם לאחר מכן, הכינו רפידות מקדחה, שישמשו לשיתוק התולעים להזרקה. כדי להכין את רפידות המקדחה, הציבו תחילה כמה כוסות כיסוי בגודל 22 על 50 מילימטר על הספסל. בעזרת פיפטת מרעה מניחים טיפה של 2% אגרוס מומס על כיסוי אחת, ומיד מניחים כיסוי שנייה מעל הטיפה בזווית של 90 מעלות לראשונה.

הניחו לאוויר להתמצק למשך מספר שניות ולאחר מכן הסירו את זכוכית הכיסוי העליונה. קוטר הדיסק השטוח של ה-aero צריך להיות בין 15 ל-20 מילימטרים. כמו חיית מחמד, הניחו לכרית להתייבש לחלוטין באוויר למשך מספר שעות או למשך הלילה.

לאחר שהם יבשים, אחסן את הרפידות בקופסת זכוכית מכסה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו את מעמיסי המחט לתמיסת ה-DNA. לשם כך, קח צינור נימי של מאה מיקרוליטר וחמם אותו באמצע להבה פתוחה ומשוך אותו במהירות לאורכו כפול בערך.

לאחר שהצינור הנימי מתקרר, הצמד את שני החצאים זה מזה. אחסנו 10 עד 20 מעמיסי מחטים להזרקה. אתה יכול לאחסן אותם זקופים בצינור מיקרו צנטריפוגה.

בראק, היזהר. נקודות מעמיס המחט חדות מאוד. עכשיו הכינו את מחטי ההזרקה המיקרו.

מחטים אלו עשויות מצינור נימי מיוחד המכיל חוט זכוכית פנימי. חוט זה משמש כפתילון לתמיסת ה- DNA. כדי להכין את המחטים אנו משתמשים בניקי PP שמונה 30 קוטב עם הגדרת חום של 24.8, מספר מחטים נשלפות בכל פעם לאחסון.

ניתן להרכיב מספר מחטים על רצועת חימר דוגמנות. רסיסים קטנים של זכוכית כיסוי ישמשו לפתיחת קצה המחט הנמשך. רסיסים אלה מוכנים על ידי עטיפת זכוכית כיסוי בגודל 18 על 18 מילימטר במגבון קים והפעלת לחץ עדין עד שהיא נשברת למספר חתיכות.

השתמש ברסיסים בגודל של כשלושה עד ארבעה מילימטרים. בנוסף להכנת הדנ"א והמחטים, הכינו כ-50 עד 100 בשלבים מתאימים. שתי תולעים מסוג בר לכל מבנה וקטור ביטוי שיש להזריק.

כעת אנו מוכנים להקים את מיקרוסקופ ההזרקה. כדי להתחיל בהגדרת המיקרוסקופ, פתח את השסתום הראשי במיכל ההליום המחובר לזרוע מחט המיקרו-הזרקה ולמחזיק. סגור את הרגולטור כדי לאפשר לגז להיכנס לקו.

הבאת הלחץ ל-35 PSI ניתן לשחרר את הגז באמצעות דוושת רגל. לאחר מכן, הכנס מעמיס מחט לתוך צינור פה רגיל והפיל כמות קטנה מתערובת הפלסמיד כמיקרוליטר אחד. כעת הכנס בעדינות את המעמיס עד למחט המיקרו-הזרקה עד שתורגש התנגדות.

הוצא את תמיסת ה-DNA על ידי נשיפה עדינה ולאחר מכן הסר את המעמיס. לאחר טעינת ה-DNA, הכנס את המחט לזרוע המיקרו-הזרקה, הקפד למקם אותה בתוך אטם הגומי הפנימי הקטן ולאחר מכן להדק אותה לזרוע המניפולטור. לאחר מכן הניחו רסיס מחט של זכוכית כיסוי על קצה אחד של כרית מקדחה.

מכסים את הרסיס כמו גם את כל פני השטח של כרית המקדחה בשמן פחמן קדוש. לאחר מכן הנח את כרית המקדחה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. לאחר כרית המקדחה במקומה, מקם את המחט במרכז שדה הצפייה באמצעות מטרת המט"ח ותאורת השדה הבהיר, אך עדיין אל תוריד אותה לשמן.

לאחר מכן, מקם את הקצה הפנימי של רסיס זכוכית הכיסוי במרכז, ולאחר מכן התמקד בו. הורד את המחט לתוך השמן, והביא אותה לאותו מישור מוקד כמו רסיס זכוכית הכיסוי. הרם את ההגדלה על ידי מעבר למטרה של 40x, ולאחר מכן התמקד מחדש בקצה הרסיס ומקם מחדש את קצה המחט במידת הצורך.

עכשיו לשבור פתח את קצה מחט ההזרקה. דחף בעדינות את המחט אל קצה רסיס זכוכית הכיסוי, ובמקביל הפעיל דופק גז קצר דרך דוושת הרגל. המחט תישבר מספיק.

כאשר טיפות קטנות של נוזל בורחות מקצה המחט עודף זרימת נוזלים בגלל גדול מדי, פתח אינו רצוי מכיוון שהוא יהרוג את בעלי החיים. לאחר שהמחט מוכנה, אנו מתחילים במיקרו-הזרקה. לאחר מכן, הסר את כרית המקדחה מהבמה על ידי הרמת המחט כלפי מעלה.

אך אל תשנה את מיקום ציר X או Y. החלק את הבמה החוצה מתחת למחט. הסר את כרית המקדחה והנח אותה על מיקרוסקופ מנתח.

העבירו מילה על הכרית מתחת לפני השטח של השמן. אם התולעת מתפתלת מלטפת אותה בעדינות עד שהיא נוגעת בכרית המקדחה, התולעת הלחה צריכה להיצמד לאגרו היבש. הנח במהירות את כרית המקדחה בחזרה על הבמה, ומרכז את התולעת בשדה הראייה.

לאחר מכן הורד את המחט לאותו מישור מיקוד כמו התולעת. העבר את המסננים בהיקף ההפוך לתאורת הופמן. מסנן ניגודיות זה מאפשר לפרטים מורפולוגיים של התולעת להיות גלויים.

באמצעות המטרה של פי 40, התמקדו במרכז החושי המגורען של בלוטת התולעת מתחת לתבנית חלת הדבש של גרעיני הנבט. בחר איזו בלוטת המין ממוקמת בצד התולעת הפונה למחט. קנס. כוונן את מיקום המחט עד שגם הקצה יהיה בפוקוס.

הכנס בעדינות את המחט למרכז בלוטת המין והפעל דופק קצר של לחץ גז כדי להוציא טיפה או שתיים של DNA לזרוע בלוטת המין. עליכם לצפות בגל של נוזל המתפשט על פני הזרוע הדיסטלית עם הרבה תרגול ומיומנות. אתה יכול לפגוע במרכז הדחף בכל פעם.

זכור שחשוב לעבוד במהירות בזמן הזרקת תולעת. מכיוון שהוא יכול להתייבש בקלות. התהליך כולו אמור להימשך באופן אידיאלי פחות מדקה עד שתיים.

לאחר השלמת ההזרקה, הסר את כרית המקדחה מהבמה והנח אותה על סקופ חיתוך. מרחו מיקרוליטר אחד של מאגר M nine ישירות על התולעת המוזרקת. זה עשוי להיות כרוך בטבילת קצה הפיפטה מתחת לפני השטח של שמן הפחמימות ההילה.

המאגר אמור להרטיב את התולעת ואז היא תצוף מעל פני השטח של כרית האירו, תעביר את התולעת לצלחת רגילה באמצעות מכוש תולעת. עכשיו אני אמסור את התולעים המוזרקות לאדם והוא יראה לנו את הבחירה והתחזוקה של קווים טרנסגניים. התולעים המוזרקות מועברות לצלחות בודדות של 60 מילימטר ומניחות להתרבות.

תולעים אלה מייצגות את דור P zero. בדרך כלל בעלי חיים מוזרקים מודגרים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך יומיים-שלושה עד להופעת הצאצאים. ברגע שהצאצאים מופיעים, אנו מוכנים להתחיל בבדיקת תולעים מהונדסות.

צאצאי F1 נצפים כעדות לסמן הטרנסגני. במקרה זה, הסמן הניתן לבחירה הוא פלואורסצנטי, כך שאנו יכולים לסנן באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. כל חיה נושאת פלואורסצנטית F1 משוכפלת בנפרד על צלחת חדשה.

ה-P zero המוזרק עשוי לייצר רק אחד עד חמישה צאצאים פלואורסצנטיים מבין כל ה-F1 שלו. אפשרו להרמפרודיטים F1 להתרבות ב-20 מעלות למשך יומיים-שלושה עד להופעת הצאצאים. ברגע שדור F 2 מוכן, הם נצפים גם עבור בעלי חיים מהונדסים. F שני בעלי חיים שירשו והביעו סמן טרנסגני נחשבים לקו יציב.

יש לשמור על כל קו יציב עצמאי כקו נפרד של תולעים המפיצות כל קו על ידי העברת מספר בעלי חיים טרנסגניים לצלחת חדשה בכל דור. יש לבצע זאת באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלורסנט. אם הסמן הניתן לבחירה הוא פלואורסצנטי כדי לשלוט בשונות במספר עותק הגן, צור מינימום של שלושה קווים יציבים עצמאיים לכל מבנה מוזרק.

זה עתה הראינו לך כיצד להזריק מיקרו ביטוי, מבנים וקטוריים, ולראות elgan ולבחור עבור קווים יציבים. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.