השיטה MODS לאבחון שחפת שחפת עמידים multidrug

על כל שלושה אנשים בעולם, אחד נגוע בשחפת. אבחון שחפת פעילה מונע זיהומים חדשים מכיוון שחולים עם שחפת פעילה ימשיכו להדביק בין 10 ל-15 אנשים אחרים בשנה עד למועד שבו הם יטופלו או ימותו. Mods הוא ראשי תיבות שאנו משתמשים בהם כדי להימנע מהצורך לומר תצפית מיקרוסקופית, בדיקת רגישות לתרופות, והסיבה לכך שהיא נקראת כך תתברר ככל שהמתודולוגיה תוסבר.

בסרטון הקצר נתאר את מתודולוגיית המוד לאבחון מהיר וזול של שחפת ושחפת עמידה לתרופות מרובות. הסרטון יציג את המתודולוגיה צעד אחר צעד. נדון בהשלכות הבטיחות הביולוגית של עבודה עם תרבית נוזלית, ונסביר גם כמה מבעיות אבטחת האיכות החשובות הנדרשות לשימוש במתודולוגיה זו.

בדיקת המודים פותחה באוניברסיטת Kayana בלימה, פרו במעבדתו של בוב גילמן. בעקבות תצפיות שנעשו בתחילה על ידי חליל רופף. LOOSE ניסתה לזהות דרכים מהירות לגילוי מיקובקטריום טוברקולוזיס בתרביות באמצעות אינדיקטורים קולומטריים.

אך היא ציינה כי התצפית על תרביות אלה תחת המיקרוסקופ חשפה נוכחות של גידול מיקרובקטריות מספר ימים לפני שהאינדיקטורים הקולורמטריים שינו את צבעם, ועל סמך תצפית זו פותחה הבדיקה של משרד הביטחון. הבדיקה של MOD פותחה בסביבה מוגבלת במשאבים ומכוונת להגדרות מוגבלות במשאבים, ולכן קצת פחות מ-3 לבדיקה לזיהוי מבוסס תרבית נוזלית של שחפת וזיהוי עמידות לתרופות מרובות. זה מאוד מושך ולראשונה מביא סוג כזה של יכולת אבחון למקומות שבהם המשאבים מוגבלים.

אז בדיקת המודים מבוססת על שלושה עקרונות מרכזיים. הראשון הוא שמיקובקטריום טוברקולוזיס גדל במדיה נוזלית הרבה יותר מהר מאשר במדיה מוצקה. זו עובדה שידועה כבר שנים רבות.

שנית היא שאם אנו מתבוננים במדיה הנוזלית הזו תחת המיקרוסקופ, אנו יכולים לזהות את הצמיחה של שחפת myb הרבה יותר מהר מאשר לחכות להופעה מקרוסקופית של מושבות על מצע מוצק. ואכן, גידול זה אופייני לחלוטין כך שאנו יכולים להבחין בין שחפת M במדיה נוזלית לבין זיהום חיידקים או פטרייתי, או למעשה מגידול של מיקובקטריות לא טיפוסיות שאינן שחפתיות שעשויות להיות נוכחות. לבסוף, וזה אולי הדבר המרגש ביותר בבדיקת המודים, הוא שאנחנו יכולים לשלב את התרופות הן ריפמפיצין ולכן עמידות לתרופות ישירות מהליחה.

על ידי שימוש בתרופות אלה בתחילת הבדיקה, אנו יכולים לזהות גם שחפת וגם אם המבודד עמיד לשתי התרופות הללו או לא. וזה מייתר את הצורך בתת-תרבות ויצירת מבחן רגישות עקיף לתרופות. אז עכשיו אנחנו רק הולכים לתאר את הציוד הנדרש כדי לבצע את בדיקת המודים.

יש צורך במקרר על מנת לאחסן מדיה מוכנה. נדרש איזון כדי לשקול את ה- is ו- Rifampin. יש צורך במערבולת לערבוב ליחה.

עם תמיסת הטיהור, נדרשת צנטריפוגה לריכוז דגימת הליחה המטוהרת, וזו אמורה להיות מסוגלת להשיג 3000 גרם.אין צורך לקרר את הצנטריפוגה, אך חיוני לחלוטין שהיא תהיה בטוחה לביוגרפיה ובטוחה לביו. לעבודה מיקובקטריאלית הדורשת שניתן לאטום את דליי הצנטריפוגה במכסים הניתנים לנעילה. נדרשת חממה שיכולה להגיע ל-37 מעלות ולשמור על 37 מעלות צלזיוס.

זה לא צריך להיות מועשר ב-CO2. נדרש מיקרוסקופ הפוך כדי לקרוא את לוחות המוד, וזה צריך להיות בעל מטרות של ארבע x ו-10 x ויש צורך בחיטוי כדי לעקר מדיה וגם לסילוק תרבית מיקרובקטריאלית, מיקרו פסולת נדרשים ל-aliquot במדיה, ארון בטיחות ביולוגי. דרגה שנייה נדרשת להליכים הכוללים מניפולציה של דגימות ליחה וחיסון צלחות.

הריאגנטים הנדרשים לביצוע המודים הם כדלקמן, Middlebrook seven H nine media cascione וגליצרול פנטה, שהוא תוסף האנטיביוטיקה ו-OADC. מלאי תוספי התזונה של האנטיביוטיקה הוא ריפמפין דימתיל סולפוקסיד, DMSO להכנת ריפמפיצין, נתרן הידרוקסיד, נתרן ציטראט וניל ציסטאין לטיהור כיח די, נתרן פוספט ומונו אשלגן פוספט להכנת מאגר הפוספט, 10% נתרן היפוכלוריט לסילוק פסולת נגועה וחומר חיטוי לניקוי משטחי עבודה. הפלסטיק והחומרים המתכלים הבאים נדרשים גם צינורות זכוכית סטריליים, מסנני 0.2 מיקרומטר לממיסים מימיים ומסנני 0.2 מיקרומטר לממיסים אורגניים, צינורות מיקרו צנטריפוגה, צינורות צנטריפוגה 15 מיל, צינורות צנטריפוגה סטריליים 50 מיליליטר, 10 מיליליטר פפים סרולוגיים על פני פפס, קצות מיקרופיפט סטריליים 24 צלחות מסוג תרבית רקמות באר ושקיות מסוג Ziploc הניתנות לאטימה, אשר 24 צלחות הבאר מונחות לאחר חיסון דגימת הליחה למדיה.

ישנן ארבע קבוצות של פתרונות מלאי שניתן להכין מראש. תמיסת חיץ הפוספט עשויה משילוב של תמיסות מונו בסיסיות של נתרן פוספט, דיבה ואשלגן פוספט המותאמות ל-pH של 6.8 פלוס מינוס 0.2. תמיסה זו עוברת חיטוי בטמפרטורה של 121 עד 124 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לעיקור, ותרבית אליקוט על אגר מזין כדי לאשר סטריליות.

אפשר לאחסן במקרר בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס עד חודש. כל דגימת ליחה דורשת 10 מיליליטר של תמיסת חיץ פוספט. פתרון המלאי לטיהור כיח הוא שילוב נתרן הידרוקסיד נתרן ציטראט.

תמיסות אלו משולבות בנפחים שווים ומחטאות בטמפרטורה של 121 עד 124 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות וניתן לאחסן אותן גם במקרר בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס עד חודש. שני מיליליטר של תמיסה זו נדרשים לכל דגימת כיח. מדיום התרבות הבסיסי מורכב ממידלברוק שבע H תשע עם קסקיון וגליצרול.

אבקת 7 H nine מומסת במים מזוקקים סטריליים המכילים גליצרול וקסקיון ומעורבבת בערבוב מתמיד עד להמסה מלאה. מדיה זו עוברת חיטוי בטמפרטורה של 121 עד 124 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר הקירור מחולקת ל-4.5 מיליליטר בצינורות זכוכית סטריליים בגודל 16 על 100 מילימטר. המדיה מודגרת ב-37 מעלות למשך 48 שעות כדי לוודא סטריליות, מה שמעיד על חוסר עכירות לאחר זמן זה וניתן לאחסן אותה ב-2 עד 8 מעלות צלזיוס כשהמכסה סגור היטב עד חודש.

כל דגימת ליחה דורשת צינור אחד המכיל 4.5 מיליליטר של תרבית זו. תמיסות מלאי אנטיביוטיקה בינוניות מוכנות כדלקמן, מומסות לחלוטין במים מזוקקים סטריליים ומסוננות עם מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר לממיסים מימיים. לאחר מכן ניתן לאחסן 20 מיקרוליטר בצינורות מיקרו צנטריפוגה סטריליים בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים, כל 20 מיקרוליטר מספיקים לעד מאה דגימות.

תמיסות מלאי ריפמפין של שמונה מיליגרם למיל מוכנות על ידי המסת ריפמפיצין ב-DMSO ובמים מזוקקים סטריליים. תערובת זו מסוננת עם מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר לממיסים אורגניים וניתן לאחסן את התמיסה ב-20 מיקרוליטר בצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים כל 20 מיקרוליטר מספיקים לעד 100 דגימות. אז עכשיו אנחנו מגיעים לחלק של המתודולוגיה עצמה ולשלושת הצעדים שאתה צריך לנקוט ביום ההליך.

זה הופך את פתרונות המניות לפתרונות העבודה. ראשית יש לנו את פתרון הטיהור, אחר כך יש לנו את פתרון התקשורת. ולבסוף, פתרונות העבודה של התרופות isen ו-Rifampin.

שיטת הטיהור, המשמשת למתודולוגיית המודס, היא מתודולוגיית טיהור נתרן הידרוקסיד נאלק הסטנדרטית. הנלק הוא חומר רירי, המסייע לעכל את הליחה ולאפשר לנתרן הידרוקסיד לבצע את הטיהור. לשם כך, אנו זקוקים לתמיסת מלאי הנתרן הידרוקסיד שלנו נתרן ציטראט ו-0.1 גרם NA מתווספים ל-20 מ"ל של תמיסה זו.

יש להשליך כל תמיסה שלא משתמשים בה ביום ההכנה. ההכנה הסופית של מדיום התרבות צריכה להיעשות רק ביום השימוש. מאוחסנים שבע מדיות H תשע משולבות עם OADC ופנטה 4.5 מיליליטר של המדיה משולבת עם 0.5 מיליליטר OADC ו-0.1 מיליליטר פנטה בכל צינור.

זה מספיק לדגימה אחת. פתרונות עבודה של כל תרופה מוכנים ביום השימוש ויש להשליך כל תמיסות שאינן בשימוש מכיוון שלא ניתן להבטיח פעילות האליקוטים המאוחסנים מדוללים ב -24. צלחות תרבית רקמות באר באופן סדרתי עם מדיה שבע H תשע oh A DC כך שריכוז הבאר הסופי המושג לאחר הוספת דגימת הליחה עם המדיה הוא 0.4 מיקרוגרם למיל חומצה פורית ומיקרוגרם אחד למיל עבור ריפמפין.

כעת להליך הטיהור, שני מיל של דגימת כיח מוכנסים לתוך צינור פלקון על בסיס חרוטי ולאחר מכן מוסיפים שני מיל של תמיסת הטיהור של חלב הנתרן הידרוקסיד שלנו. המכסה מוחלף ומוברג בחוזקה, ולאחר מכן המתלה מערבולת ומשאיר לעמוד למשך 15 דקות, במהלכן מתרחש הליך הטיהור. לאחר זמן זה מוסיפים 14 מיליליטר של תמיסת חיץ פוספט.

המכסה מוחלף ומוברג בחוזקה, והצינור מוכנס לצנטריפוגה לאחר 50 דקות ב-3000 גרם, הסופרנטנט S מפורק והכדור שנותר הוא הדגימה שאנו רוצים לצלחת באמצעות צינורות 5.1 מיליליטר של שבעה H 9 פנטר OEDC. הגלולה שלנו מושעה לנפח של כשני מיליליטר. מחצית מהדגימה המושהית הזו מאוחסנת כגיבוי בצינור מיקרו צנטריפוגה.

לאחר מכן זה זמין למקרה שהתרבות שלנו תזדהם ונצטרך להוציא את הדגימה שוב. המיליליטר השני מתווסף לשבעת ה-H 9 הנותרים שנמצא בצינור הזכוכית שלנו, וזו הדגימה שלנו שמוכנה לציפוי. 900 מיקרוליטר של השעיה זו של מדיה ודגימה מונחים בכל אחת מארבע בארות בעמודה של צלחת 24 בארות.

הבארות הנותרות של צלחת 24 הבארות מלאות בדגימות עוקבות כך שחמש דגימות ממלאות צלחת של 24 בארות, אחת לכל אחד מחמישה עמודים, והעמודה השישית נותרת ללא דגימה. העמודה השישית משמשת כבקרה שלילית בעמודה זו. הוא הציב את כל מרכיבי המדיה ללא דגימת כיח וברור שכל גידול בטור זה מצביע על כך שיש לנו בעיה עם זיהום צולב וצריך להשליך את כל הצלחת.

כל צלחת שאנו מריצים דורשת עמודה של שליטה שלילית. אז עכשיו יש לנו את הצלחת שלנו המכילה את כל הדגימה והמדיה שלנו. עלינו להוסיף את תרחיפי האנטיביוטיקה שלנו בצלחת נפרדת.

הכנו את הדילולים שלנו כפי שתוארו קודם לכן של ריפמפין ואיזיד, ועם רב-חיית מחמד בעלת ארבעה ערוצים, אנו אוספים 100 מיקרוליטר מכל אחת מהבארות הללו ומחלקים 100 מיקרוליטר של שבעה H תשע OADC לכל אחת משתי בארות בקרה ו-100 מיקרוליטר של ריפמפין ו-100 מיקרוליטר של איזיד לכל אחת משתי הבארות המכילות תרופה. לאחר השלמת הצלחת, מחליפים את המכסה ומניחים אותו בפנים. שקית זיפלוק מנקודה זו והלאה לא נפתחת שוב, ולכן לכל תרבית שגדלה במדיה נוזלית לעולם אין אפשרות לעזוב את השקית.

כל קריאות הצלחת מעתה והלאה נעשות בתוך השקית, והשקית מונחת בשקית חיטוי ומושלכת בסוף התרבית. ובדרך זו, אנו נמנעים ממניפולציה של תרחיפים מרוכזים מאוד של מיקובקטריה. נגיד רק כמה מילים עכשיו על בקרת איכות.

ישנן בקרות איכות מובנות במתודולוגיית המודים, החיוניות לשימוש נכון בבדיקה. קודם כל, יש בקרות שליליות ואלה מופעלות על כל צלחת. אלה הוזכרו בעבר, אך לסיכום, יש לנו עמודה המכילה את כל מרכיבי המדיה ללא נוכחות של דגימת כיח לצד חמש דגימות כיח אחרות בצלחת, יש לבחון את הבארות בעמודה בדיוק כמו כל בארות אחרות ונוכחות של גידול כלשהו בבארות אלה מעידה על זיהום צולב ולכן לא ניתן לסמוך על אף אחת מהתוצאות בצלחת.

לכן יש להשליך את הצלחת ולצבוע מחדש את כל הדגימות. בנוסף, ישנן בקרות פנימיות שהן בקרות חיוביות. אלה מופעלים על צלחת נפרדת, וצלחת זו מוכנה לאחר שכל לוחות הדגימה האחרים הוכנו בסוף היום כדי למזער את הסיכון לזיהום צולב בתוך המעבדה.

בצלחת נפרדת זו, אנו מפעילים זן אחד רגיש לחלוטין של מיקובקטריום טוברקולוזיס וזן עמיד לאיזיד וריפמפיצין. אם יש חששות לגבי הפעלת זן עמיד לתרופות מרובות על צלחת, ניתן להפעיל זן עמיד לריפמפין מונו ללא זן עמיד מונו במקום שני הזנים הרגישים וה-MDR הללו. מטרת הזנים הללו היא להראות לא רק שהתקשורת תומכת בצמיחה, ולכן כל הבקרות החיוביות שלנו צריכות לגדל את העושר ללא תרופות, אלא גם שריכוזי התרופות שלנו נכונים ולכן הבקרות החיוביות הרגישות לא צריכות לגדול בנוכחות הוא וריפמפין והבקרות החיוביות העמידות צריכות לגדול באופן ברור דרך ריכוזי ריפמפין ו-is שנמצאים בצלחת.

אוקיי, אז עכשיו לקריאת צלחת. אם ניקח בחשבון את יום היציאה מהדוגמים שלנו, קריאת הצלחת ביום האפס מתחילה ביום החמישי. לפני כן, צמיחה מיקובקטריאלית נראית לעתים רחוקות מאוד.

צלחות נבדקות תחת מיקרוסקופ אור הפוך. כלומר, הלוחות נבחנים מלמטה למעלה, וזה מאפשר לנו לראות בבירור את המיתרים המנסים לדמיין את התרביות מלמעלה נפגעים על ידי עיבוי על מכסה הצלחות, וגם מכיוון שאורך המוקד אינו מתאים למיקרוסקופ סטנדרטי. בדיקה מיקרוסקופית מתבצעת בדרך כלל עם 10 x תרביות חיוביות אובייקטיביות הנחשבות כאחת שבה יש לפחות שתי יחידות יוצרות מושבה בשתי הבארות ללא תרופות.

נוכחות הזיהום מזוהה בקלות מכיוון שהמדיה נעשית עכורה וביום החמישי יש בדרך כלל צמיחת יתר של רוב הבאר. לעומת זאת, גידול מיקובקטריאלי אינו מוביל לעכירות של הצמיחה הראשונית היטב של מיקובקטריות בצורות דמויות פסיקים קטנות, המתקדמות בהתמדה ליצירת אקורדים או סבכים אופייניים. תוך שבועיים, גידול חיובי חזק ייווצר קונגלומרציות של מיקובקטריות עם חוטים הנראים רק בגפיים.

הרוב המכריע של התרבויות שהולכות להיות חיוביות הן חיוביות עד היום ה-14, ולכן אנו ממליצים על קריאות יומיות מהיום החמישי עד היום ה-14 ולאחר מכן קריאות כל יומיים או שלושה בהתאם לעומס העבודה במעבדה ביום שבו תרבית חיובית בבירור בשתי הבארות ללא תרופות, יש לקרוא את הבארות המכילות את התרופה המכילה תרופות. כל גידול בנוכחות אחת מהתרופות מעיד על עמידות לתרופה זו. חשוב מאוד לציין שאם האזור של בארות התרופה המכיל נעשה יותר משבוע לאחר שנצפתה תרבית חיובית בבארות ללא תרופות, ייתכן שהדבר לא מייצג עמידות מכיוון שמדי פעם נראית צמיחה פורצת דרך.

הקריאות יכולות להיפסק ביום ה-21 אם התרבית שלילית, מכיוון שתרביות חיוביות לאחר זמן זה לעולם לא נתקלות בחולים שאינם מקבלים טיפול בהשלמת 21 ימי הדגירה, ניתן להשליך תרביות. התרביות נשארות בתוך שקיות הזיפלוק שלהן ומונחות בשקיות חיטוי ובחיטוי בטמפרטורה של 121 עד 124 מעלות צלזיוס למשך 45 עד 60 דקות, ולאחר מכן ניתן להשליך אותן בבטחה. אני רק הולך לומר כמה מילים עכשיו על בטיחות ביולוגית ובדיקת המודים מכיוון שהשקנו מודים לא רק בפרו אלא גם בסביבות באפריקה ובאסיה.

נשאלת שאלה חוזרת לגבי הבטיחות והבטיחות הביולוגית של שימוש בתרביות מיקרובקטריאליות במדיה נוזלית. זהו חשש מובן מכיוון שברור שנוזלים יכולים להישפך וחומר מוצק אינו נושא את הסיכון הזה, וגם יש סיכון לאירוסוליזציה כאשר אנו מתמודדים עם תרחיפים של מיקובקטריה. למעשה בגלל הסיבות הללו אנו מאמינים שמתודולוגיית המוד היא מתודולוגיה בטוחה יותר מכל מתודולוגיה הדורשת בדיקת רגישות לתרופות עקיפה.

הסיבה לכך היא שלבדיקת רגישות עקיפה מכינים השעיה של ריכוז ידוע של מיקרובקטריה. לכן זה כרוך במניפולציה של תמיסות מרוכזות מאוד של מיקרובקטריות עם כל הסיכונים הנלווים לשפיכה ואירוסוליזציה. לעומת זאת, מתודולוגיית המודס, כפי שראיתם כעת, פשוט כוללת חיסון של דגימת כיח לצלחת שלנו, ולאחר מכן הצלחת נאטמת בתוך שקית ניילון.

תיק זה לעולם לא נפתח שוב, ולכן איננו צריכים להתמודד עם המתלים המרוכזים הללו. זה לא אומר שאנו מאמינים שמתודולוגיית המוד בטוחה לחלוטין, טיפול במיקובקטריה תמיד טומן בחובו סיכון. עם זאת, נראה כי נתונים מקוריאה שפורסמו ב-2006 הצדיקו את עמדתנו כי מודים אינם מסוכנים יותר מכל תרבות אחרת.

זה היה מחקר שנערך בקרב עובדי מעבדה, שהראה שהסיכונים התעסוקתיים לעובדי מעבדה שפלטו תרביות ולא היו אחראים לבדיקת רגישות לתרופות לא היו גדולים יותר מאלה של אלה שמבצעים מיקרוסקופ ליחה. לעומת זאת, לאלה שמטפלים בהשעיות של מיקובקטריות ומבצעים בדיקות רגישות לתרופות יש שיעורים גבוהים בהרבה של סיכון תעסוקתי לשחפת. ברור שיש חשיבות עליונה לכך שכל צוות מעבדת הלידה יהיה מוגן ככל האפשר, ולכן אנו ממליצים בחום שאף אחד מההליכים הללו לא יבוצע ללא הגנה נשימתית אישית מתאימה שאנו מתכוונים למסכות N95 סטנדרטיות.

בנוסף, נדרש ארון בטיחות ביולוגי או מכסה מנוע מסוג שני בו כל האזורים המותשים מסוננים דרך מסנני HEPA. לבסוף, מנגנון פשוט שחשוב מאוד במניעת מערבולות של זרימת אוויר בתוך מעבדה הוא מנעול על דלת המעבדה כדי לעצור כניסה ויציאה של אנשי צוות בזמן עיבוד הדגימות. זה מפחית את הסיכון להדבקה בתוך המעבדה, אז אני מקווה שזה נתן לך סקירה טובה של מה כוללת מתודולוגיית המודים ועד כמה היא עשויה להיות שימושית במסגרות שבהן המשאבים מוגבלים, אך יש צורך דחוף באבחון שחפת ושחפת MDR באיכות גבוהה.

למידע נוסף, אתה יכול לבקר באתר האינטרנט שלנו, mods peru. org, שם תמצא את נהלי ההפעלה הסטנדרטיים המפורטים שלנו, המדריך למשתמש למודים. בנוסף ל-SOPs לעיבוד דגימות ריאתיות נוספות, יש לנו גם ספריית תמונות של מיקובקטריום ושחפת, מיקובקטריות אחרות וזיהום חיידקי ופטרייתי, ותוכלו גם למצוא את אסטרטגיית אבטחת האיכות שלנו ואת ההליך שאנו ממליצים להסמכת מעבדות להתחיל להשתמש במודים.

לבסוף, יש דף שאלות נפוצות, ואנו מקדמים בברכה כל משוב ממשתמשים המשתמשים כעת במודים מכיוון שזו מתודולוגיה איטרטיבית. כפי שהסברנו קודם, זו בדיקה לא קניינית ואנחנו תמיד מעוניינים בשיפורים שמעבדות אחרות הצליחו לעשות.