הפרוטוקולים של זיהום אוראלי של הזחלים Lepidopteran עם Baculovirus

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקות זיהום אוראלי של הזחלים lepidopteran עם baculovirus על מנת לקבוע יעילות חרקים.

נגיף ה-Vao משמש בדרך כלל כווקטור DNA המשמש בשילוב עם קווי תאי חרקים לביטוי חלבונים. עם זאת, העובדה שנגיף זה מדביק ביעילות חרקים עם השלכות קטלניות הופכת אותו גם לחומר הדברה יעיל. בברזיל, למשל, וירוס באלו מסוג בר מוחל על יותר ממיליון דונם של גידולי סויה מדי שנה לצורך הדברת זחל שעועית הקטיפה כדי לשפר את יעילותם בקוטלי חרקים, נגיפי Balo הונדסו גנטית עם גנים המקודדים רעלנים ספציפיים לחרקים הפעילים בתוך HemosIL של החרק.

בסרטון זה, אנו מדגימים שיטות להדבקה אוראלית של זחלי לפידופטרן בנגיף בקאו על מנת לנתח את יעילות קוטלי החרקים. היי, אני מהמעבדה לעצמות עיוורות במחלקה לרפואת עיניים ובאוניברסיטת איווה, ואני וונדי ספארקס גם ממעבדת העצמות. היום נראה לך שני הליכים להדבקה בנגיף VA של זחלים וזחלים.

ראשית, הרן יראה לך כיצד להדביק זחלים יילודים באמצעות בדיקה ביולוגית של הזנת טיפות. ואז אני אראה לך כיצד להדביק זחלי כוכב בינוני עד מאוחר באמצעות בדיקה ביולוגית של דם. אז בואו נתחיל.

ניתן להשתמש במבחנים ביולוגיים של הזנת טיפות לקביעת המינון הקטלני של אבקאביר והישרדות. זמן הזחלים הנגועים בנגיף הבלו. בדרך כלל משתמשים בזחלי כוכב מוקדם או יילודים לבדיקה זו.

לפני שמתחילים, וודאו שיש לכם כוסות דיאטה עם התזונה המתאימה בהישג יד. כמו כן, הכינו את הנגיף המתאים דילולים כוללים צבע מאכל ירוק לריכוז של 4% בנפח. על מנת לקבוע את ריכוז הנגיף הקטלני, הדילול צריך לתת טווח תמותה בין 1 ל-99%ייתכן שיידרשו בדיקות ביולוגיות ראשוניות כדי לקבוע טווח מתאים של ריכוזי הנגיף לאחר מערבולת הצינור כדי למנוע שקיעה של הפוליהדרה, ליצור שני מעגלים קונצנטריים של טיפות קטנות של תמיסת הנגיף בצלחת פטרי של 60 מילימטר.

עבור כל ריכוז של וירוס בשימוש, זכור להגדיר גם זיהום מדומה לשליטה שלילית. לאחר מכן, העבירו 25 עד 30 זחלים יילודים לאמצע המעגלים הקונצנטריים באמצעות מכחול סטרילי. הניחו את המכסה על הכלי ואוטמים עם פרפורם כדי למנוע מהזחלים לברוח.

באופן אידיאלי, השתמש במכחולים שונים להעברה לכל סוג וירוס כדי למנוע זיהום בין הטיפולים. הניחו לתבשיל לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות, ובמהלכן הזחלים שותים. ניתן לזהות את זחלי התמיסה שניזונו על ידי צבע ירוק של המעי הקדמי הנובע מצבע המאכל הירוק מעבירים רק את הזחלים שניזונו לאונקיה אחת של כוסות פלסטיק, המכילות דיאטה מעבירים זחל אחד לכוס.

לאחר העברת הזחלים יש לכסות את הכוסות במכסים ולדגור על 28 מעלות צלזיוס 24 שעות לאחר ההדבקה. יש להוציא את כל הכוסות המכילות זחלים מתים. מקרי מוות מוקדמים אלה נובעים ככל הנראה מטיפול בפציעה.

כאשר משתמשים בבדיקה ביולוגית זו לקביעת מינון קטלני, יש לבדוק את הזחלים כל יומיים-שלושה עד שהזחלים הנגועים המדומה וכל הזחלים ששרדו שטופלו בווירוס מטוהרים או החלו לשאול על מנת להתגלם, הזחלים הנגועים בנגיף יישארו על גבי המזון ואז ימותו לאחר מספר ימים. זחלים מתים לפעמים יהפכו זחלים שחורים שמתים מזיהום לשקיות של פוליהדרה, שיתמוססו לחלוטין. אם הפרעה מכנית בשלב זה, ציין את תמותת הזחלים בכל טיפול.

יש לשכפל בדיקות ביולוגיות בריכוז קטלני שלוש או ארבע פעמים בהזדמנויות נפרדות. השתמש ב-30 אנשים בכל מנה עבור כל וירוס או טיפול בקרה. השתמש בתוכנית ניתוח צוואה מתאימה כגון polo או SAS כדי לחשב ערכי lc 50, מרווחי סמך של 95% והסטטיסטיקה המתאימה.

ניתן להשתמש בבדיקת הזנת טיפות זו גם לקביעת ערכי זמן הישרדות ST 50. במקרה זה, תמותת הזחלים מדורגת כל ארבע עד שמונה שעות עם תצפיות תכופות יותר. אם שיעור התמותה הוא זמן הישרדות גבוה, מבחנים ביולוגיים מבוצעים באמצעות מינון lc 99 של זמני ההישרדות החציוניים של הנגיף וגבולות הביטחון של 95% מחושבים באמצעות אומדן קפלן מאייר באמצעות תוכנית s plus או SAS.

כעת, לאחר שהראנג הראה לך את הבדיקה הביולוגית של האכלת טיפות, אראה לך את הבדיקה הביולוגית של תקע הדיאטה בביו-מבחן תקע הדיאטה. זחלי Instar באמצע עד סוף ניזונים מפקק דיאטה שטופל במינון ידוע של וירוס כדי לקבוע את המינון הקטלני או LD 50 ביום שלפני ביצוע בדיקה זו. הוציאו את הדיאטה מהכוס כדי להרעיב את הזחלים למשך הלילה.

שלב זה יגביר את המהירות שבה הזחלים צורכים את הנגיף. קוביית דיאטה מחוסנת למחרת, הכינו את הדיאטה על ידי חיתוך לקוביות קטנות כשני מילימטרים מעוקבים. אם קוביות הדיאטה קטנות מדי, הן יתייבשו.

אם קוביות הדיאטה גדולות מדי, הזחלים לא יוכלו לצרוך את כל קוביית הדיאטה בן לילה. כעת הוסף אחד עד שניים מיקרוליטר של תרחיף פוליהדרה לכל קוביית דיאטה. ההשעיה מכילה 4%צבע צבעי מאכל בנפח.

תנו לתרחיף להיספג בתזונה למשך חמש עד 15 דקות. זכור להכין גם קוביית דיאטה מדומה שטופלה בווירוס כבקרה שלילית. לאחר מכן, העבירו קוביית דיאטה אחת לכל זחל כוכב רביעי בכל.

לאחר מכן מניחים כוסות בחממה למשך הלילה בחום של 28 מעלות צלזיוס למחרת, זורקים את כל הזחלים שלא אכלו לחלוטין את קוביית הדיאטה. לאחר מכן הוסף חתיכת דיאטה גדולה לכל עבור הזחלים הנותרים. שמרו על הזחלים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, והוסיפו תזונה נוספת לפי הצורך עד שהזחלים הנגועים והזחלים הנגועים בנגיף ששרדו אכלו או התחילו להתגלם.

בשלב זה, רשום את מספר החרקים המתים והשורדים. אנו רק נראה לך שתי שיטות להדבקת חרקים בנגיף גב, דימום, ביופסיית האכלה וביופסיית פלאק הדיאטה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שהזחלים שנהרגו על ידי נגיף הגופות הם בדרך כלל שבירים ויכולים בקלות לקרוע את הנגיף המשחרר.

לכן יש לעקר משטחי עבודה ולהשליך כפפות מזוהמות וחומרים חד פעמיים בצורה מתאימה כדי למנוע זיהום. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.