Name: הפרוטוקולים של זיהום Microapplicator בסיוע של הזחלים Lepidopteran עם Baculovirus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-23T13:32:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: למד שתי שיטות מיקרואפליקטור להדבקת זחלי Lepidoptera בבקולובירוס. השיטות כוללות הזרקה ישירה של וירוס budded וחיסון פומי של פוליהדרה. שיטות אלו מאפשרות הערכת יעילות חרקית ומחקר התפשטות הווירוס בזחלים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

בקר <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-457-5_18">שפרינגר הפרוטוקולים</a> כדי ללמוד עוד על baculovirus ההנדסה כסוכן insecidical ואת טכניקות microapplicator בשימוש assay זה.

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

הפרוטוקולים של זיהום microapplicator בסיוע של הזחלים lepidopteran עם baculovirus

Protocols for Microapplicator-assisted Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses נמצאים בשימוש נרחב הן וקטורים ביטוי חלבון כסוכני השליטה חרקים מזיקים. . וידאו זה מראה כיצד הזחלים lepidopteran יכול להיות נגוע עם טכניקות microapplicator במעיים עם polyhedra baculovirus וב hemolymph עם וירוס מנוצן. זה ליווי שפרינגר הפרוטוקולים בסעיף מספק סקירה של מחזור החיים של baculovirus ושימוש baculoviruses כסוכני חרקים. גיבוש ויישום של baculoviruses למטרות הדברה מתוארים במקומות אחרים.

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את שתי טכניקות microapplicator נהג להדביק של הזחלים lepidopteran עם baculovirus על מנת לקבוע יעילות חרקים.

הפרוטוקולים של זיהום Microapplicator בסיוע של הזחלים Lepidopteran עם Baculovirus

בקולו-וירוסים (Baculoviruses) נמצאים בשימוש נרחב הן כווקטורים לביטוי חלבונים והן כחומרי הדברה למזיקי חרקים. סרטון זה מדגים כיצד ניתן להשתמש בזחלי סדרת הפרפרים (lepidopteran larvae)...

בעוד שנגיף הבקולובירוס (baculovirus) הספציפי למפרקי רגליים משמש ככלי מחקר סטנדרטי למערכות ביטוי של חלבונים איקריוטיים, הוא מפותח גם כחומר הדברה בטוח סביבתית להשמדת חרקים, המסוגל להרוג חרקים צומחוניים כגון הפרפרים והנשפיים (lepidoptera) בטבע. זחלי Lepidoptera נדבקים בנגיפי הבקולובירוס בעת אכילת עלים נגועים. הזחלים או השדשדים בולעים את נגיף הבקולובירוס בצורה המכונה פוליהדרון (polyhedron), שהיא קומפלקס של חלקיקי נגיף הארוזים במבנה חלבוני גבישי גדול המגן על הנגיף מהתייבשות.מרגע שהזחל נדבק, הנגיף המוטמע מפיץ את הזיהום בתוך החרק. הנגיף משתלט על מנגנוני סינתזת החומצות הגרעיניות והחלבונים של המארח כדי לייצר נגיפים ופוליהדרה (polyhedra) נוספים. בסופו של דבר, הזחלים נדבקים בנגיף באופן כה מקיף עד שהם נמסים לרסס דביק של פוליהדרה שנטף על פני השטחים של הצמח שנאכל על ידי החרק, ואז המחזור מתחיל מחדש כדי לקבוע את היעילות הקוטלת-חרקים של Baca מסוים.ניתן לשלב טכניקות של מיקרו-מנסב (micro applicator) עבור זן Avir עם בדיקות ביולוגיות. ניתן להדביק זחלי Leid dorin על ידי הזרקה של נגיף מוטמע ישירות אל ה-HemosIL או לחלל הגוף, ולאחר מכן להעריך את שיעורי התמותה. בנוסף, ניתן להדביק זחלים באמצעות פולידרה (polyhedra) בעזרת הזרקה מסייעת של מיקרו-מנסב פומי, ובכך לבחון את תזמון ההדבקה של המעי ורקמות אחרות.שלום, אני וונדי ספארקס מהמעבדה של בריאן בונינג במחלקה לאנטומולוגיה באוניברסיטת מדינת איווה, ואני גם מ-boning snap. היום נציג בפניכם שתי פרוצדורות להדבקת זבוב פירות מעבדה, *Drosophila*, בנגיף backlog. שתי השיטות משתמשות במאפליקטור מיקרו.ראשית, אראה לכם כיצד להשתמש באפליקטור מיקרו כדי להחדיר וירוס לגוף אל תוך ה-heni דרך ה-prole. לאחר מכן, אראה לכם כיצד להשתמש באפליקטור מיקרו כדי להחדיר poly header אל תוך ה-mid guard דרך ה-mouse. אז בואו נתחיל.כאשר הם מפותחים למטרות הדברה, וירוסי balo מכילים בדרך כלל את הגן של הפוליהדרון כדי להקל על הדבקה אוראלית של פשעי זחליים. עם זאת, לעיתים ישנן סיבות לבחון וירוס baccula שאינו מכיל פוליהדרון לצורך בדיקת השפעות הדברה פוטנציאליות או כדי לעקוף את מערכת העיכול של החרק. במקרה זה, ניתן לבצע הזרקה של הוירוס באמצעות מיקרו-אפליקטור כדי להדביק את הזחלים לפני תחילת הבדיקה.יש לקבוע את הטיטר של מלאי העבודה של הנגיף המוחדר באמצעות בדיקת פלאקים (plaque assay) או בדיקות דילול נקודת קצה (endpoint dilution assays). עבור ניסויים פיזיולוגיים, הזרקות של 5×10⁴ PFU לכל VNS של ג'יגנתית בדרגת גוזל חמישית יהיו טיפוסיות. כדי להתחיל בבדיקה הביולוגית זו, טענו כל דילול של הנגיף המוחדר למזרק המילליטר פלסטיק עם קצה מחט חדה בכילוי 28.5 או 32.בדרך כלל ניתן להשתמש ב-1 עד 3 µL של תמיסת נגיף מדוללת, עם titer של 10⁷ עד 10⁸ למילליטר, עבור כל זחלי. לפיכך, טעינה של 300 עד 500 µL למזרק מספיקה לרוב המטרות. לאחר מכן, הוציאו בועות אוויר מהמזרק על ידי החזקתו במצב אנכי כדי להביא את האוויר לקצה המחט, ולאחר מכן שחררו אותו.לאחר מכן, קבעו את המזרק אל צינור התמיכה של המזרק. כעת הגדירו את הנפח ל-1.0 microliter. עבור כל טיפה, ביחידת הבקרה של המיקרו-אפליקטור המבוססת על מיקרו-מעבד, כיילו תחילה את יחידת הבקרה כדי להבטיח שמוגשת הנפח הנכון; ניתן להגדיר את המהירות שבה מוגשת הטיפה בסקאלה של אפס עד תשע.נהוג להשתמש בטווח שבין אפס לאחד. לחצו על מתג הרגל כדי לוודא שהתמיסה מוגשת כראוי. זכרו שבמידה ומוגשת כמות גדולה מדי של תמיסה או אם היישום איטי מדי, ניתן להתאים את הגדרות הנפח והמהירות עד שיושג הנפח הנכון של התמיסה בקצב המתאים.אני מוכן כעת להתחיל בהזרקה להדבקה ב-H VNS. בדרך כלל מזריקים לזחלים בשלב מוקדם של הגization החמישי, שכן הגודל הגדול יותר של השלבים המאוחרים מקל על תהליך ההזרקה. הכניסו את קצה המחט דרך ה-plana של אחת הרגליים הבדיריות אל תוך חלל הגוף.שימו לב, כאשר קצה המחט נכנס לתוך הפרובה, תנוחת גוף הזחל משתנה. כדי למנוע נזק למעי ולקיר הגוף, לחצו כעת על מתג הרגל ארבע פעמים כדי להחדיר ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת הנגיף אל תוך ההמוסיל. לאחר סיום ההזרקות, החזירו את כל הזחלים למדגרה בטמפרטורה של 28 degrees Celsius. בדקו לעיתים קרובות אם ישנם זחלים מתים וודאו שזמין תזונה נאותה עבור הזחלים ששרדו.על אף ששלבים מאוחרים של הזחלים אינם מתים מפגיעה בקוטיקולה כתוצאה מההזרקה, יש לבדוק את הזחלים 24 שעות לאחר ההזרקה למקרה של נזק למעי, שעלול להיגרם מזיהום חיידקי. תמותה מוקדמת זו יש להשמיט מניתוח הנתונים. במידה ומסמנים את הבדיקה הביולוגית בעזרת מיקרו-אפליקטור עם וירוס מושרה לצורך בדיקות של ריכוז קטלני, יש לשחזר את הבדיקה הביולוגית שלוש או ארבע פעמים במועדים נפרדים.השתמשו ב-30 פרטים לכל מינון עבור כל טיפול בנגיף או בביקורת. השתמשו בתוכנה מתאימה לניתוח פרוביט, כגון polo או SAS, כדי לחשב ערכי lc 50, רווחי סמך של 95% ואת הסטטיסטיקות המתאימות. ניתן להשתמש בבדיקה ביולוגית זו גם כדי לקבוע ערכי זמן הישרדות ST 50 לאחר הזרקה של מינון קבוע של נגיף.במקרה זה, תמותת הזחלים נקבעת מדי ארבע עד שמונה שעות, עם תצפיות תכופות יותר. אם שיעור התמותה גבוה, מחשבים את זמני ההישרדות החציוניים בגבולות סמך של 95% באמצעות מעריך Kaplan Meyer תוך שימוש בתוכנת s plus או SAS. כעת, לאחר שהראתה לכם Harran את הביו-בדיקה בסיוע מיקרו-אפליקטור באמצעות נגיף Butted.אדגים לכם את הבדיקה. כאשר תזמון מדויק של ההדבקה הוא קריטי, משתמשים בהחדרה פומית של פוליהדרה ישירות למעי החרק. לדוגמה, במעקב אחר אופן התפשטות הנגיף בתוך החרק, כדי להתחיל בבדיקה זו יש לתלות פוליהדרה בתמיסה בעלת ציפה ניטרלית של גליצרין ומים ביחס של 3:2 בריכוז של 10 עד 300.ניתן להשתמש בפוליהדרה עבור שלב הנימפה הרביעי, לדוגמה. לאחר מכן, טענו את התמיסה זו למזרק טוברקולין מפלסטיק או מזכוכית בנפח של 1 CC עם מחט קהה בכילוי 32. הניחו את המזרק על צינור התמיכה של המיקרו-אפליקטור תוך התבוננות דרך מיקרוסקופ.החזיקו את הזחל בשלב ה-fourth או fifth instar, הכניסו את המחט דרך הפה אל האזור הקדמי של המעי האמצעי, ולאחר מכן הזריקו את הפוליהדרה (polyhedra). טכניקה זו דורשת תרגול. ראשית, עשוי להיות קשה להחזיק את הזחלים עם כפפות מבלי למעוך אותם.שנית, נדרש תרגול כדי להעביר את המחט מעבר לאיברי הפה. אנו ממליצים לתרגל הזרקה של PBS לכ-30 זחלים. אם תנקבו בטעות את מערכת העיכול, הדבר יהיה ניכר מכיוון שהזחלים יעברו מלניזציה ויהפכו לשחורים במהירות.שוב, מכיוון שההדבקה הפומית בעזרת מיקרו-אפליקטור מספקת את זמן ההדבקה המדויק, שיטה זו היא השימושית ביותר עבור ניסויים שבהם זמן ההדבקה חשוב כדי לקבוע כיצד הווירוס מתפשט בתוך החרק. לדוגמה, ניתן להדביק באופן פומי זחליים בווירוסים המבטאים beta galactoses dase, ולאחר מכן לבצע להם נתיחה בנקודות זמן שונות כדי לקבוע אילו רקמות נדבקו. נראה לכם שני כלים להדבקה בעזרת מיקרו-אפליקטור. חרק עם vir, כאשר הראשון היה הדבקה ישירה דרך הרגל המקדימה של וירוס מושב, ודבר זה מאפשר לעקוף את פיזיולוגיית המעי ולהעריך את הקטלניות ואת זמן הקטלניות של הווירוס שבו אתם מעוניינים.הטכניקה השנייה הייתה הקטעה ישירה למעי האמצעי באמצעות פולידרה (polyhedra). שיטה זו מאפשרת להחדיר מינון מדויק מאוד ישירות למעי האמצעי, וכן לשלוט בתזמון מדויק של האירוע. לאחר מכן ניתן לחקור את התמותה ואת הפנוטיפים האחרים של הנגיף.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי הזחלים ההרוגים מנגיף ה-baula של ה-cadavers הם בדרך כלל שבירים ויכולים להתבקע בקלות ולשחרר את הנגיף. לכן, יש לעקר את משטחי העבודה ולהשליך כפפות מזהומות וחומרים חד-פעמיים באופן מתאים כדי למנוע זיהום. זהו כל התהליך.תודה על הצפייתכם. בהצלחה בניסוי.

protocols-for-microapplicator-assisted-infection-lepidopteran-larvae

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקות זיהום אוראלי של הזחלים lepidopteran עם baculovirus על מנת לקבוע יעילות חרקים.

הפרוטוקולים של זיהום אוראלי של הזחלים Lepidopteran עם Baculovirus

השיטה המתוארת כאן מנצלת הזרקה ישירה של חיידקי entomopathogenic לhemocoel...

גידול והזרקה של<em&gt; Manduca סקסטה</em&gt; זחלים להערכה ארסית קטריאלי

סרטון זה מדגים שיטה לביסוס מודל זיהום Mycobacterium bovis בזחלים של עש השעווה הגדול, Galleria mellonella. זן ביולומינסנטי של Mycobacterium bovis BCG מוזרק לתוך המולימפה של הזחל כדי ליצור זיהום, והביולומינסנציה נמדדת במרווחי זמן מוגדרים מראש כדי לחקור את התקדמות הזיהום.

טכניקה לביסוס מודל זיהום חיידקי בזחלי חרקים

סרטון זה מציג את מדידת העומס החיידקי in vivo באמצעות Bacillus Calmette-Guérin, BCG, זחלי חרקים נגועים בלוקס. התהליך כולל הומוגניזציה של הזחל, טיפול במצע לוציפראז ומדידת ביולומינסנציה כדי לקבוע יחידות אור יחסיות המתואמות עם עומס חיידקי.

מדידת נטל In Vivo של חיידקים המבטאים לוציפראז בזחל חרקים

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

פרוטוקול זה מתאר חום חלבון הנוצרות על-ידי הלם ביטוי מערכת (pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת), אשר יכול לשמש עבור המבטאים חלבונים זרים או הערכת אנטי-אפופטוטיים להיפגע הפעילות של חלבונים זרים פוטנציאליים ו שלהם קטום אמינו חומצות בתאי חרקים.

הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

ב פרוטוקול זה, baculovirus המיוצר על ידי תרביות תאים ארעית של baculovirus פלסמיד לתאים Sf9, הגביר בתרבות ללא סרום ההשעיה. תגובת שיקוע מטוהרת על-ידי הפארין כרומטוגרפיית זיקה, עוד יותר מרוכז על-ידי ultracentrifugation. פרוטוקול זה שימושי עבור ייצור וטיהור של baculovirus עבור יישום טיפול גנטי.

ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר בית carboxylesterase לעוף חלבונים במבחנה עם מערכת ביטוי תא חרקים baculovirus מתווכת, מאוחר יותר פונקציונלית לאפיין את תפקידיהם פרמתרין חילוף חומרים, ובכך, היוועצות pyrethroid התנגדותם מבוססת תא MTT assay, במבחנה מטבולית מחקרים.

אפיון פונקציונלי Carboxylesterases הבית בקוטלי חרקים עמידים בזבובים, דומסטיקה זבוב

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור ניצול של חרקים תא baculovirus חלבון ביטוי ומערכת לייצר כמויות גדולות של חלבונים צמח מופרש על התגבשות חלבון. וקטור ביטוי baculovirus השתנה עם GP67 או hemolin חרקים פפטיד אות לביטוי הפרשת חלבון צמחי בתאי חרקים.

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

מערכת וקטור הביטוי של baculovirus (BEVS) היא פלטפורמה איתנה להקרנת ביטוי וייצור של חלבון ארגינין מתילטרנספראזים (PRMTs) שישמשו למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים ומבניים. כמויות מיליגרם של חומר יכול להיות מיוצר עבור רוב PRMTs וחלבונים אחרים של עניין הדורש פלטפורמת ביטוי eukaryotic.

ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus

מחקרים מבניים וביוכימיים של מובילי ממברנות אנושיים דורשים כמויות מיליגרם של חלבון יציב, שלם והומוגני. כאן אנו מתארים שיטות ניתנות להרחבה לסינון, ביטוי וטיהור מובילי מומסים אנושיים באמצעות גנים ממוטבים לקודון.

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

למד שתי שיטות מיקרואפליקטור להדבקת זחלי Lepidoptera בבקולובירוס. השיטות כוללות הזרקה ישירה של וירוס budded וחיסון פומי של פוליהדרה. שיטות אלו מאפשרות הערכת יעילות חרקית ומחקר התפשטות הווירוס בזחלים.

הפרוטוקולים של זיהום Microapplicator בסיוע של הזחלים Lepidopteran עם Baculovirus

גלה סרטונים נוספים