הפרוטוקולים של זיהום Microapplicator בסיוע של הזחלים Lepidopteran עם Baculovirus

בעוד שנגיף הבקלה הספציפי לפרוקי רגליים משמש ככלי מחקר סטנדרטי למערכות ביטוי חלבונים אוקריוטיות, הוא מפותח גם כחומר קוטל חרקים בטוח לסביבה, שיכול להרוג חרקים אוכלי עשב כמו Lepidoptera בטבע. זחלי Lepidopteran נגועים בנגיפי בקלה בעת אכילת עלווה נגועה. הזחלים או הזחל בולעים את נגיף הבקאלה בצורה המכונה פולידרון, שהוא קומפלקס של חלקיקי נגיף הארוזים במבנה חלבון גבישי גדול המגן על הנגיף מפני התייבשות.

ברגע שהזחל נדבק, נגיף התחת מפיץ את הזיהום בתוך החרק. הנגיף חוטף את מנגנון סינתזת חומצות הגרעין והחלבונים של המארח כדי לייצר עוד וירוסים ופוליהדרה. בסופו של דבר הזחלים נדבקים כל כך בווירוס שהם מתמוססים לתוך נוזל מבולגן של פוליהדרה שמטפטף על משטחי הצמח שנאכל על ידי החרק, ואז המחזור מתחיל מחדש כדי לקבוע את יעילות קוטלי החרקים של באקה מסוימת.

ניתן לשלב טכניקות מיקרו אפליקטור של זן Avir ובדיקות ביולוגיות. זחלי לייד דורין יכולים להידבק על ידי הזרקת נגיף התחת ישירות לתוך HemosIL או חלל הגוף וניתן להעריך את שיעורי התמותה. בנוסף, ניתן להדביק זחלים בפוליהדרה באמצעות הזרקה בסיוע מיקרו אפליקטור דרך הפה וניתן לבחון את תזמון ההדבקה של המעי ורקמות אחרות.

היי, אני וונדי ספארקס במעבדה של בריאן e boning במחלקה לאנטומולוגיה באוניברסיטת איווה סטייט ואני גם מ-boning snap. היום נראה לכם שני נהלים להדבקת DI בצינור המעבדה בנגיף הצבר. שתי השיטות משתמשות במיקרו אפליקטור.

ראשית, אני אראה לך להשתמש במיקרו אפליקטור כדי להעביר את וירוס הגוף לתוך ההאני דרך פרול. לאחר מכן, בעת ההצגה, אתה משתמש במיקרו אפליקטור כדי להעביר כותרת פולי לתוך המגן האמצעי דרך העכבר. אז בואו נתחיל.

כאשר הם מפותחים למטרות קוטלי חרקים, נגיפי באלו מכילים בדרך כלל את הגן הפוליהדרון כדי להקל על זיהום אוראלי של זחלי מזיקים. עם זאת, לעיתים, ישנן סיבות לבדוק נגיף בקלה שלילי פוליהדרון להשפעות פוטנציאליות של קוטלי חרקים או לעקוף את המעיים של חרק. במקרה זה, ניתן לבצע הזרקת נגיף תחת באמצעות מיקרו אפליקטור כדי להדביק זחלים לפני תחילת הבדיקה.

יש לקבוע את טיטר המלאי הפעיל של נגיף התחת באמצעות בדיקת פלאק או מבחני דילול נקודת קצה. עבור ניסויים פיזיולוגיים, זריקות של חמש פעמים 10 ל-PFU הרביעי לכל כוכב חמישי H VNS יהיו אופייניות. כדי להתחיל את הבדיקה הביולוגית הזו, טען כל דילול וירוס בקת למזרק פלסטיק אחד סמ"ק להרקול עם קצה מחט חד בגודל 28.5 או 32.

בדרך כלל אחד עד שלושה מיקרוליטר של תמיסת וירוס התחת. עם טיטר של 10 לשביעי, ניתן להשתמש במינוס 10 עד השמיני למיליליטר לכל זחל כך שהעמסת 300 עד 500 מיקרוליטר למזרק מספיקה לרוב המטרות. לאחר מכן, הוציאו בועות אוויר מהמזרק על ידי החזקת המזרק זקוף כדי להביא אוויר לקצה המחט ולחלק.

לאחר מכן תקן את המזרק על צינור התמיכה של המזרק. כעת הגדר את עוצמת הקול ל -1.0 מיקרוליטר. עבור כל טיפה ביחידת הבקרה של המיקרו-מעבד של המיקרו-אפליקטור יש לכייל תחילה את יחידת הבקרה כדי להבטיח שהנפח הנכון מופץ, ניתן להגדיר את מהירות הוצאת הטיפה בסולם של אפס עד תשע.

בדרך כלל נעשה שימוש בטווח של אפס עד אחד. לחץ על מתג כף הרגל כדי להבטיח שהתמיסה מחולקת כראוי. זכור שאם מחלקים יותר מדי תמיסה או אם היישום איטי מדי, ניתן לכוונן את הגדרות עוצמת הקול והמהירות עד להחלת עוצמת הקול הנכונה של התמיסה בקצב הנכון.

עכשיו אני מוכן להתחיל את הזריקה לזיהום H VNS. בתחילת החמישית, זחלי כוכב מוזרקים בדרך כלל הגודל הגדול יותר של הכוכבים המאוחרים יותר מקל על תהליך ההזרקה. הכנס את קצה המחט דרך הפלנה של אחת מרגלי המקצוענים לתוך חלל הגוף.

שימו לב, כאשר קצה המחט נכנס לתוך הפרול, שנה את תנוחת גוף הזחל כדי למנוע נזק למעי ולדופן הגוף, לחץ כעת על מתג כף הרגל ארבע פעמים כדי להעביר ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת הנגיף לתוך חותם ההמו. לאחר השלמת הזריקות יש להחזיר את כל הזחלים לאינקובטור של 28 מעלות צלזיוס. בדוק לעתים קרובות אם יש זחלים מתים וכדי לוודא שיש תזונה נאותה לזחלים ששרדו.

למרות שכוכבים מאוחרים אינם מתים מפגיעה בציפורן כתוצאה מהזרקה, עדיין יש לבדוק את הזחלים 24 שעות לאחר ההזרקה במקרה של נזק למעי, שעלול לנבוע מזיהום חיידקי. יש להחריג תמותה מוקדמת זו מניתוח הנתונים. אם משתמשים בבדיקה ביולוגית בסיוע מיקרו אפליקטור עם וירוס תחת לבדיקות ביולוגיות בריכוז קטלני, יש לשכפל את הבדיקה הביולוגית שלוש או ארבע פעמים בהזדמנויות נפרדות.

השתמש ב-30 אנשים בכל מנה עבור כל וירוס או טיפול בקרה. השתמש בתוכנית ניתוח צוואה מתאימה כגון polo או SAS כדי לחשב ערכי lc 50, מרווחי סמך של 95% והסטטיסטיקה המתאימה. ניתן להשתמש בבדיקה ביולוגית זו גם כדי לקבוע ערכי זמן הישרדות ST 50 לאחר חיסון של מינון קבוע של נגיף.

במקרה זה, תמותת הזחלים מדורגת כל ארבע עד שמונה שעות עם תצפיות תכופות יותר. אם שיעור התמותה גבוה, זמני ההישרדות החציוניים בגבולות הביטחון של 95% מחושבים באמצעות אומדן קפלן מאייר באמצעות תוכנת s plus או SAS. כעת, לאחר שהרן הראה לך את הבדיקה הביולוגית בסיוע מיקרו אפליקטור באמצעות וירוס התחת.

אני אראה לך את המבחן. שימוש בפוליהדרה חיסון אוראלי של פוליהדרה ישירות לתוך מעי החרקים משמש כאשר העיתוי המדויק של ההדבקה הוא קריטי. לדוגמה, כאשר עוקבים אחר אופן התפשטות הנגיף בתוך החרק כדי להתחיל בבדיקה זו, השעו את הפוליהדרה בתמיסה ניטרלית של שלוש עד שתיים של גליצרין ומים מ-10 עד 300.

פוליהדרה יכולה לשמש לכוכב הרביעי, למשל. לאחר מכן טען את התמיסה הזו למזרק טוברקולין CC מפלסטיק או זכוכית עם מחט קצה קהה בגודל 32. הנח את המזרק על צינור התמיכה של המיקרו אפליקטור והסתכל מטה במיקרוסקופ.

החזיקו את הרביעי או החמישי בזחל הכוכב, הכניסו את המחט דרך הפה לאזור הקדמי של המעי האמצעי, ואז העבירו את הפוליהדרה. טכניקה זו דורשת תרגול מסוים. ראשית, זה יכול להיות מסובך להחזיק את הזחלים בכפפות מבלי למעוך אותם.

שנית, נדרש קצת תרגול כדי לנווט את המחט מעבר לחלקי הפה. אנו ממליצים לתרגל חיסון של כ-30 זחלים ב-PBS. אם במקרה תנקב את המעיים, זה יהיה ברור מכיוון שהזחלים משחירים די מהר.

שוב, מכיוון שחיסון אוראלי בעזרת מיקרו אפליקטור מספק את זמן ההדבקה המדויק, שיטה זו שימושית ביותר לניסויים שבהם זמן ההדבקה חשוב כדי לקבוע כיצד הנגיף מתפשט בתוך החרק. לדוגמה, ניתן לחסן דרך הפה נגיפים המבטאים בטא גלקטוזות לזחלים, אשר מנותחים לאחר מכן בנקודות זמן שונות כדי לקבוע אילו רקמות נדבקות כאשר פשוט נראה לך שני כלי דם בסיוע מיקרו אפליקטור לזיהום. אהבת חרקים עם ויר, הראשון שבהם היה חיסון ישיר באמצעות פרו לג של וירוס התחת, וזה מאפשר לך לעקוף את הפיזיולוגיה של המעיים ולהעריך את הקטלניות והזמן הקטלני של הנגיף שאתה מעוניין בו.

הטכניקה השנייה הייתה חיסון ישיר למעי האמצעי באמצעות פוליהדרה. זה מאפשר לך להעביר מינון מדויק מאוד ישירות לתוך המעי האמצעי, כמו גם לשלוט בתזמון מדויק מאוד של האירוע. לאחר מכן תוכלו לחקור גם את התמותה ופנוטיפים אחרים של הנגיף.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שהזחלים שהרג נגיף הגופות הם בדרך כלל שבירים ויכולים בקלות לקרוע את הנגיף המשחרר. לכן יש לעקר משטחי עבודה ולהשליך כפפות מזוהמות וחומרים חד פעמיים בצורה מתאימה כדי למנוע זיהום. אז זהו.

תודה על הצפייה. בהצלחה בניסוי שלך.