קבלת ביצים Xenopus laevis נקבות

הביצים של Xenopus laevis שלם, lysed, ו / או מופרדים שימושיים עבור מגוון רחב של ניסויים. פרוטוקול זה מראה כיצד לגרום הנחת ביצה, לאסוף את הביצים dejelly, ולמיין את הביצים כדי להסיר ביצים פגומות.

תמציות ביצים של Xip Labis שימושיות כמקורות לחומר ציטופלזמי ואברונים לבנייה מחדש במבחנה של אירועים תאיים כגון הרכבה גרעינית וייבוא חלבון גרעיני. כמובן שלפני שתוכל להשתמש בתמציות ביצים, תחילה עליך להשיג את הביצים מצפרדעים נקבות. היי, שמי מארי קרוס ואני סטודנטית לתואר שני במעבדה של ד"ר מורין פאוור במחלקה לביולוגיה של התא באוניברסיטת אמורי באטלנטה, ג'ורג'יה.

היום אנו הולכים להראות לכם כיצד להשיג ביצי ג'לי D מנקבות אופוס לאוויס בוגרות. הליך זה כולל את השלבים הבאים, הכנת צפרדעים לביצה, הטלה עם מררה בהריון, השראת ביצה של גונדוטרופין בסרום, הטלה עם גונדוטרופין כוריוני אנושי ומיון ביצים או ציטים רעים. אז בואו נתחיל.

כדי לייצר ביצים, נקבות צפרדעים בוגרות מוכנות תחילה עם גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון. כדי להתחיל בהליך ההתחלה, הכינו מיכל המכיל מאה נתרן כלורי מילי-מולרי לשיכון צפרדעים. לאחר ההזרקה, יש לשמור על צפרדעים ראשיות בצפיפות של כצפרדע אחת לליטר.

ייצור ביצים אופטימלי נשמר על ידי שיכון צפרדעים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס. בעזרת מחט בגודל 27 המחוברת למזרק של מיל אחד, הזרקו צפרדע תת עורית לתוך שק הלימפה הגבי עם 0.5 מיל של 200 יחידות למיל. סוסה בהריון סרום גונדוטרופין.

החזר צפרדעים ראשיות למיכל המכיל מאה מילי-מולרי נתרן כלורי. לאחר יומיים-שלושה, עודדו הטלת ביצים על ידי הזרקת צפרדעים עם 0.5 מיל של מאה יחידות למיל. גונדוטרופין כוריוני אנושי שוב מוזרק תת עורית לשק הלימפה הגבי.

לאחר ההזרקה, הניחו כל צפרדע בחמישה ליטר של מאה מילי-מולרי נתרן כלורי. עדיף לשים כל צפרדע במיכל משלה מכיוון שאיכות הביצים משתנה מצפרדע לצפרדע. כ-16 עד 22 שעות לאחר הזרקת הגונדוטרופין הכוריוני האנושי, הוציאו את הצפרדע למיכל מים נקיים ושפכו את הביצים לכוס.

רצוי להתבונן בצפרדעים במשך יום עד יומיים לאיתור סימני זיהום במקום ההזרקה. בשלב זה, מעיל ג'לי שקוף מקיף כל ביצה, מה שמונע מהן לגעת זו בזו לביצי דה ג'לי, לשטוף ביצים פעם אחת ו-2% ציסטאין pH H שמונה, ואז להמשיך לדגור במאה שטרות של תמיסת ציסטאין 2% ליטר לצפרדע למשך כחמש דקות. בטמפרטורת החדר, מערבבים בעדינות את הביצים מעת לעת לאחר חמש דקות.

יוצקים את תמיסת הציסטאין מביצי הדז'ה ושוטפים אותן שלוש פעמים בתמיסת רינגר שונה פי 0.25. כדי להסיר פסולת, שפכו ביצים לצלחת פטרי מזכוכית של מאה מילימטר העובדת תחת מיקרוסקופ מנתח. מוציאים את הביצים הרעות מצלחת הפטרי בעזרת פיפטת מרעה.

לביצי xip בוגרות יש חצי פיגמנט כהה למעלה וחצי בהיר בתחתית. כתם לבן בגודל מדויק המעיד על הבשלת הביצית צריך להיות גלוי במרכז חצי כדור פיגמנטי כהה של הביצית הבוגרת. ביצה טובה היא כזו שיש לה פיגמנטציה אפילו במודל.

כל דבר ללא כתם לבן זה הוא ביצית ויש להסירו. יש להסיר גם ביצים לבנות, מוגדלות או שאינן בעלות פיגמנט אחיד. ביצה גרועה במיוחד תופיע ככדור נפוח לבן עם גבול בין חצאי הכדור מוסתר לחלוטין לשטוף ביצים ממוינות פעמיים עד שלוש על ידי שפיכת בופר ביצים עליהן, ולאחר מכן לשפוך בזהירות את המאגר, למזער את מספר הביצים שנשפכות החוצה.

כעת ניתן לליז ביצים ולהכין תמציות. זה עתה הראינו לך כיצד להשיג ביצי ג'לי מנקבות קסנופוס לאוויס בוגרות. הקפד לבדוק את שני הסרטונים האחרים שלנו המראים לך כיצד להכין תמציות ביצים גולמיות וכן כיצד להרכיב מחדש הרכבה גרעינית במבחנה באמצעות תמציות ביצים מופרדות.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.