סיגמא של Non-ספציפיים פעילות Assay פרוטאז - קזאין כמו מצע

פרוטאזות מפרקות קשרי פפטיד במעבדה. לעיתים קרובות יש צורך למדוד ו/או להשוות את הפעילות של פרוטאזות. ניתן להשתמש בבדיקת הפעילות העקבית של פרוטאזות מבית Sigma כפרוצדורה סטנדרטית לקביעת פעילותן של פרוטאזות, וזו הפעולה שאנו מבצעים במהלך נהלי בקרת האיכות שלנו.

בבדיקה זו, קזאין משמש כתסבס כאשר הפרוטאז הנבדק מעכל את הקזאין. חומצת האמינו טירוזין משתחררת יחד עם חומצות אמינו אחרות ומקטעי פפטידים. טירוזין חופשי מגיב לאחר מכן עם foliage ו-cyl cals phenol או עם reagent fallen כדי להפיק כרומופור בצבע כחול, שניתן לכימות ולמדידה כערך בליעה (absorbance) בספקטרופוטומטר.

ככל שמשתחררת יותר טירוזין מהקזאין, כך נוצרים יותר כרומופורים ופעילות הפרוטאזה חזקה יותר. ערכי הבליעה הנוצרים כתוצאה מפעילות הפרוטאזה מושווים לעקומת סטנדרט, הנוצרת על ידי תגובה של כמויות ידועות של טירוזין עם ריאגנט FC, כדי להקיים מתאם לשינויים בבליעה. באמצעות כמות הטירוזין במיקרומולים מהעקומת סטנדרט, ניתן לקבוע את פעילות דגימות הפרוטאזה במונחים של יחידות, המגדירות את כמות שווה-המיקרומולים של טירוזין המשתחררים מקזאין לדקה. שלום, שמי היא Carrie Cup Vineyard ואני מדענית במתקן של Sigma Aldridge DeKalb כאן בסנט לואיס, מיזורי.

היום אדגים לכם דרך ישימה באופן אוניברסלי לבדיקת פעילות פרוטאז ב-Sigma Aldridge. אנו משתמשים במבדק זה בעיקר בתחום בקרת האיכות שלנו כדי להבטיח שלפרוטאז יש פעילות מספקת לפני שנשלח אותו ישירות אליכם למעבדה. לפני תחילת המבדק, עלינו לוודא שהריאגנטים הבאים הוכנו כראוי.

בופר פוטסיום פוספט 50 millimolar, pH 7.5. התמיסה מונחת בטמפרטורה של 37 °C לפני השימוש עם תמיסת kasian בריכוז של 0.65% משקל לנפח, שהוכנה על ידי ערבוב של 6.5 mg/mL בליטר אחד. טמפרטורת התמיסה מועלית בהדרגה תוך ערבוב עדין ל-80 עד 85 °C למשך כ-10 דקות, עד להשגת דיספרסיה הומוגנית.

חשוב מאוד לא להרתיח את התמיסה. לאחר מכן מתאימים את ה-pH במידת הצורך באמצעות נתרן הידרוקסיד וחומצה כלורית. תמיסת חומצה טריכלוראצטית בריכוז 110 millimolar המוכנה על ידי דילול של תמיסת מקור בריכוז 6.1 normal ביחס של 1 ל-55 עם מים מזוקקים, 0.5 millimolar, Fallen and Seal calts או רכיב phenol fallen, שהיא התמיסה שתגיב עם טירוזין כדי ליצור שינוי צבע מדיד.

זה יהיה קשור ישירות לפעילות של פרוטאזות. תמיסת נתרבן פחמתי (sodium carbonate) בריכוז 500 millimolar שהוכנה באמצעות 53 mg/mL של נתרבן פחמתי אנहाइडרבי במים מזוקקים, תמיסת דילול לאנזים, המורכבת מבאפר נתרבן אצטט (sodium acetate) בריכוז 10 millimolar עם 5 millimolar סידן ב-pH 7.5 ובטמפרטורה של 37 °C. תמיסה זו היא זו שבה נשתמש כדי להמיס דגימות פרוטאז מוצקות או לדלל תמיסות אנזים.

תמיסת מלאי הסטנדרט של L tyrosine, אשר צריכה להיות בריכוז ראשוני של 1.1 millimolar (תמיסה של 0.2 milligram למיליליטר של L tyrosine), מוכנה במים מזוקקים ומחוממת בעדינות עד להמסת ה-tyrosine. בדומה ל-casein, אין להרתיח תמיסה זו. יש להמתין עד שהסטנדרט של L tyrosine יתקרר לטמפרטורת החדר.

תמיסה זו תדלל עוד יותר להכנת עקומת הסטנדרטים במידת הצורך; דגימה מוצקה של פרוטאז עם פעילות שנקבעה מראש, המומסת באמצעות מדלל אנזימים לריכוז של 0.1 עד 0.2 יחידות למילליליטר. תמיסה זו משמשת כביקורת חיובית עבור בדיקת בקרת האיכות, וכתיקוף לחישובים שנבצע כדי לקבוע את הפעילות האנזימטית. כעת, לאחר שהכנו את הריאגנטים וכולם נמצאים בטמפרטורה הנכונה, נתחיל בבדיקת הפרוטאז.

כדי להתחיל במדידה זו, מצאו מבחנות מתאימות בנפח של כ-15 milliliters. עבור כל אנזים שתיבחנו, תזדקקו לארבע מבחנות. מבחנה אחת תשמש כביקורת (blank), ושלוש נוספות ישמשו למדידת Activity של שלושה.

דילול של הפרוטאז; שלושה דילולים הם שימושיים כאשר בודקים את החישובים הסופיים שלנו זה מול זה; לכל סט של ארבעה מבחנות, העבר 5 mL של תמיסת ה-0.65% kasian והשאר אותן להגיע לשיווי משקל באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך כחמש דקות. לאחר מכן, הוסף ריכוזים משתנים של תמיסת האנזים לשלוש ממבחנות הדגימה, אך לא למבחנת הביקורת (blank). ערבב אותן באמצעות סיבוב והדגס בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות בדיוק.

פעילות הפרוטאז ושחרור הטירוזין הנובע מכך במהלך זמן הדגירה הם המדדים שיימדדו ויושוו בין דגימות הבדיקה שלנו. לאחר דגירה זו של 10 דקות, יש להוסיף חמישה מיליליטר של ריאגנט TCA לכל מבחנה. לאחר מכן, מוסיפים לכל מבחנה, כולל למבחנת הביקורת (blank), נפח מתאים של תמיסת אנזים, כך שהנפח הסופי של תמיסת האנזים בכל מבחנה יהיה מיליליטר אחד.

פעולה זו מבוצעת כדי להביא בחשבון את ערך הבליעה של האנזים עצמו. כעת דגרו את התמיסות בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות. במהלך דגירה זו של 30 דקות, ניתן להכין את דילוציות התקן של הטירוזין, זאת באמצעות שימוש בשישה מבחנות DR.

שבמסוג זה יכול להכיל בקלות שמונה מיליליטרים עבור ששת המבחנות. תמיסות סטנדרט של טירוזין בריכוז 1.1 millimolar מתווספות בנפחים הבאים במיליליטרים: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 ו-0.5. אין להוסיף סטנדרט של טירוזין לדגימת הביקורת (blank).

ייתכן שיהיה צורך בתמיסות סטנדרט בריכוז נמוך יותר עבור דגימות בדיקת IPU שצפויות להניב שינוי צבע קטן. לאחר הוספת תמיסת הסטנדרט של טירוזין, הוסיפו נפח מתאים של מים מזוקקים לכל אחד מהסטנדרטים כדי להביא את הנפח לשני מיליליטרים. לאחר הדגירה, סננו כל אחת מתמיסות הבדיקה ואת תמיסת הביקורת (blank).

באמצעות מסנן מזרק של 0.45 מיקרון, מוסיפים שני מיליליטרים של דגימות הבדיקה ומסנן ריק (blank) לארבעה מבחנות DR בעלות נפח של שמונה מיליליטרים לפחות. ניתן להשתמש באותו סוג של מבחנה שבה הוכנו התמיסות הסטנדרטיות. לכל המבחנות המכילות את התמיסות הסטנדרטיות ואת הסטנדרט הריק, מוסיפים חמישה מיליליטרים של sodium carbonate, ולתוצאות מיטביות, מוסיפים מיד לאחר מכן את הריאגנט המצוין. לאחר מכן, מוסיפים sodium carbonate לדגימות הבדיקה ולדגימה הריקה. ניתן להבחין כי תמיסות אלו הופכות לעכורות לאחר הוספת ה-sodium carbonate.

לאחר מכן מוסיפים את הריאגנט ששקע, אשר יגיב עם טירוזין חופשי. את מבחנות ה-DRAM מערבבים בתנועות סיבוביות ומדגירים בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. ניתן להבחין כי לתמיסות הסטנדרט יש מדרג צבעים התואם לכמות הטירוזין שהתווספה, כאשר הריכוזים הגבוהים ביותר של טירוזין נראים ככהים ביותר.

ניתן להבחין גם בשינוי צבע ניכר בדגימות הבדיקה שלנו. שני מיליליטר של תמיסות אלו מסוננים באמצעות מסנן מזרק של 0.45 micron וקווובטות מתאימות. כעת, לאחר שסיימנו את הבדיקה, נעבור לספקטרופוטומטר ונרשום את ערכי הבליעה שלנו.

בליעת האור (Absorbance) של הדגימות שלנו נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר באורך גל של 660 ננומטרים. נתיב האור נקבע לסנטימטר אחד; רשמו את ערכי הבליעה עבור התמיסות הסטנדרטיות, עבור הבלנק (blank) של הסטנדרט, עבור דגימות הבדיקה השונות ועבור בלנק של הבדיקה. לאחר איסוף כל הנתונים, נוכל להכין את עקומת הסטנדרט שלנו.

על מנת להפיק את העקומות, יש לחשב את הפרש הבליעה בין התמיסה הסטנדרטית לבין הבלנק של הסטנדרט. זהו ערך הבליעה המיוחס לכמות הטירוזין בתמיסות הסטנדרט. לאחר החישוב הפשוט, נבנה את עקומת הסטנדרט על ידי שרטוט השינוי בבליעה של הסטנדרטים שלנו על ציר ה-Y אל מול הכמות במיקרומול עבור כל אחד מחמשת הסטנדרטים שלנו על ציר ה-x.

לאחר שהזנו את נקודות הנתונים ויצרנו קו התאמה מיטבית, נגלה את השינוי בבליעה בדגימות הבדיקה שלנו על ידי חישוב ההפרש בין הבליעה של דגימת הבדיקה לבין הבליעה של דגימת הביקורת (blank). בהתבסס על עקומת הסטנדרט, נזהה את ערך הבליעה עבור אחת מדגימות הבדיקה שלנו בציר Y. כעת, נשרטט קו במקביל לציר X ונעצור בנקודה שבה הוא פוגש את עקומת הסטנדרט.

לאחר מכן, מתוך ערך ציר ה-X שנמדד בנקודה זו, נקבל את הכמות ואת מספר המיקרו-מול של טירוזין ששוחררו במהלך תגובה פרוטאוליטית ספציפית זו. כדי לחשב את פעילות האנזים ביחידות למבליליטר, בצעו את החישוב הבא: קחו את מספר שווי-ערכי המיקרו-מול של טירוזין ששוחררו, כפי שהתקבל מעקומת הסטנדרט, והכפילו אותו בנפח הכולל של הבדיקה במיליליטרים, שבמקרה שלנו הוא 11 מיליליטרים. לאחר מכן, חלקו ערך זה בשלושה גדלים נוספים.

משך הבדיקה, שביצענו במשך 10 דקות, נפח האנזים ששימש בבדיקה, אשר השתנה. נשתמש ב-1 milliliter. נפח ה-milliliters ששימש בזיהוי הכולורימטרי, שעשוי להשתנות בהתאם ל-Q vet שלך.

אנו משתמשים בשני מיליליטרים. חלוקת מספר המיקרומולים של טירוזין בזמן בדקות נותנת לנו את המדידה של פעילות הפרוטאז, אותה אנו מכנים יחידות. ניתן לבטל את יחידות מידת הנפח במונה ובמכנה, ובכך נותרים עם מדידה של פעילות האנזים במונחים של יחידות למיליליטר.

כדי לקבוע את הפעילות בדגימה של פרוטאז מוצק המדולל בדילול אנזימים, נחלק את הפעילות ביחידות למילליליטר בריכוז של החומר המוצק ששימש במקור במדידה זו במילגרם למילליליטר, ובכך נקבל את הפעילות ביחידות למילגרם. כעת הצגנו בפניכם כיצד לנתח פעילות פרוטאז באמצעות בדיקת פעילות הפרוטאז האוניברסלית של Sigma. כפי שראיתם בעת ביצוע הליך זה, קריטי לזכור לחמם הן את תמיסות ה-casein והן את תמיסות ה-tyrosine באיטיות ולא להרתיח אותן.

כמו כן, קריטי להכין בלאנקים (blanks) נפרדים הן עבור התמיסות הסטנדרטיות והן עבור כל דגימת בדיקה שברשותכם. זהו, תודה שצפיתם ובהצלחה במדידות פעילות הפרוטאז שלכם.