Name: סיגמא של Non-ספציפיים פעילות Assay פרוטאז - קזאין כמו מצע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: למדו מדידת פעילות פרוטאזים בשיטת אסיי סטנדרטית המבוססת על עיכול קזאין ושחרור טירוזין. שיטה זו מאפשרת בקרת איכות מדויקת של הכנות אנזימים במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

לפני תחילת assay, אנחנו צריכים לוודא כי ריאגנטים הבאים מוכנים כראוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט 50 מ&quot;מ הצפת אשלגן, pH 7.5. הכן באמצעות 11.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​phospate dibasic אשלגן, הידראט של מים מטוהרים והתאמת pH עם 1M HCl. פתרון זה ממוקם ב 37 מעלות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.65% משקל / נפח פתרון קזאין, שהוכן על ידי ערבוב של 6.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של קזאין ב חיץ 50 mM אשלגן זרחתי. בהדרגה הגדילו את הטמפרטורה פתרון עם ערבוב עדין 80-85 מעלות צלזיוס למשך כ -10 דקות עד פיזור אחיד מושגת. חשוב מאוד לא להרתיח את הפתרון. PH הוא מותאם אז אם יש צורך עם NaOH ו HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 110 חומצה Trichloroacetic פתרון מ&quot;מ, שהוכן על ידי דילול המניות 1:55 6.1N עם מים מטוהרים. חומצה Trichloroacetic היא חומצה חזקה יש לנהוג בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 mM Folin &amp;, או מגיב Ciolcaltea של פנול של Folin, המהווה את הפתרון יגיב עם טירוזין לחולל שינוי צבע למדידה יהיה קשור ישירות לפעילות של פרוטאזות. מגיב פנול של Folin היא חומצה וצריך לטפל בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתרן 500 mM פתרון קרבונט, שהוכן באמצעות 53 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של סודיום קרבונט anyhydrous של מים מטוהרים. פתרון diluent האנזים, אשר מורכב של 10 הצפת נתרן אצטט מ&quot;מ עם Acetate סידן 5mm, pH 7.5, בשעה 37 ° C. פתרון זה מה שאנו משתמשים בו כדי להמיס דגימות פרוטאז מוצק או לדלל פתרונות האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המניה 1.1 mM L-tyrosine תקן פתרון. הוכן באמצעות 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​L-tyrosine ב מטוהרים מים מחוממים בעדינות עד טירוזין נמס. כמו קזאין, אינם להרתיח את הפתרון הזה. אפשר תקן L-tyrosine כדי להתקרר לטמפרטורת החדר. פתרון זה יהיה מדולל יותר כדי להפוך עקומת הרגילה שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטאז פתרון. מיד לפני השימוש, לפזר פרוטאז בפתרון diluent אנזים מוכן בשלב 6. </li></ol> במידת הצורך, להשתמש במדגם פרוטאז מוצק של פעילות קבועה מראש, אשר מומס באמצעות diluent האנזים 0.1-0.2 יחידות / מ&quot;ל. פתרון זה משמש כביקורת חיובית assay בקרת איכות כמו אימות עבור החישובים נבצע לקביעת פעילות האנזים. הגדרת Assay פרוטאז ועקומות רגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את זה assay, למצוא בקבוקוני מתאים אשר יחזיקו כ - 15 MLS. במשך כל אנזים זה תיבחן, 4 צלוחיות נדרשים. בקבוקון אחד ישמש ריק, ושלושה אחרים ישמשו לפעילות assay של שלושה דילולים של פרוטאז. שלושה דילולים שימושיים בעת בדיקת חישובים הסופית אחד נגד השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר כל אחד של ארבעה בקבוקונים, להוסיף 5mls של הפתרון שלנו 0.65% קזאין. תנו להם לאזן באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך כ -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שונות כרכים של פתרון אנזים ייבדקו שלוש צלוחיות של מדגם הבדיקה, אך לא ריקה. מערבבים על ידי מתערבלים דגירה של 37 מעלות בדיוק עשר דקות. פעילות הפרוטאז והשחרור תוצאתי של טירוזין במהלך תקופה זו הדגירה היא מה יהיה נמדד בהשוואה בין דגימות הבדיקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה זה 10 דקות, מוסיפים את 5 ה-MLS של מגיב TCA על צינור אחד כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, להוסיף נפח מתאים של תמיסת האנזים צינור אחד, אפילו ריק, כך נפח הסופי של פתרון האנזים במבחנה כל 1 מ&quot;ל. הדבר נעשה על חשבון הערך ספיגת של האנזים עצמו כדי להבטיח את הנפח הסופי במבחנה כל שווה. דגירה הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה זה 30 דקות, ייתכן שתרצה להגדיר דילולים תקן טירוזין שלך. השתמש ב-DRAM 6 צלוחיות (צלוחיות DRAM ניתן להחליף עם צינורות פוליפרופילן) אשר יכול בקלות להחזיק 8 MLS. כדי שש צלוחיות, להוסיף את הפתרונות 1.1 mM טירוזין מניות רגיל עם הכרכים הבאים MLS: 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50. אין להוסיף שום תקן טירוזין על ריק. סטנדרטים התחתון עשוי להיות נחוץ עבור דגימות מבחן טמא שיניבו שינוי צבע קטנה. לאחר פתרון סטנדרטי טירוזין נוספה, להוסיף נפח מתאים של מים מטוהרים לכל הסטנדרטים להביא את נפח 2-MLS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 30 דקות, לסנן כל הפתרונות מבחן ריק באמצעות 0.45 אממ polyethersulfone מזרק הסינון. סינון נדרשת להסיר כל insolubles מן הדגימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הסינון 2 MLS של דגימות בדיקה תסנין ריק 4 צלוחיות DRAM שיכול להכיל לפחות 8 MLS. אותו סוג של הבקבוקון שבו הסטנדרטים היו מוכנים ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל בקבוקונים המכילים את הסטנדרטים ריק רגיל, להוסיף 5mls של סודיום קרבונט. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, מוסיפים 1 מ&quot;ל של ריאגנט של Folin מייד לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סודיום קרבונט להסדיר כל טיפה pH נוצר על ידי תוספת של מגיב של Folin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סודיום קרבונט על דגימות הבדיקה TESריק לא. פתרונות אלה הופכים מעונן לאחר תוספת של סודיום קרבונט. הוספת ריאגנט של Folin, אשר יגיב בעיקר עם טירוזין חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את בקבוקוני ה-DRAM ידי מתערבלים לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li></ol> לאחר דגירה זה, אתה צריך לשים לב שהסטנדרטים יש הדרגתיות של צבע correlating עם כמות של טירוזין הוסיף, הריכוזים הגבוהים ביותר של טירוזין המופיעים האפלים ביותר. ניתן גם לשים לב לשינוי צבע ניכר דגימות הבדיקה שלנו. 2mls של פתרונות אלה מסוננים באמצעות 0.45 אממ polyethersulfone מזרק לתוך cuvettes מסנן מתאים. כעת, assay מתבצע, אתה יכול להמשיך ספקטרופוטומטר כדי להקליט ספיגת הערכים שלנו. </li></ol> מדידת ספיגת ואת חישוב פעילות האנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספיגת של דגימות נמדד על ידי ספקטרופוטומטר באמצעות אורך גל של 660nm. נתיב האור מוגדר 1cm. הקלט את ספיגת ערכים של תקנים, תקן ריק, דגימות מבחן אחר, מבחן ריק. לאחר שכל הנתונים נאספו, עקומת סטנדרט ניתן ליצור. על מנת ליצור את עקומת, ההבדל בין ספיגת ריק תקן תקן חייב להיות מחושב. זהו ערך ספיגת לייחס סכום של טירוזין של פתרונות סטנדרטיים. לאחר החישוב הפשוט הזה, ליצור את עקומת סטנדרט באמצעות תוכנית גרפים לעלילה שינוי ספיגת הסטנדרטים שלנו על ציר Y, ​​לעומת הסכום micromoles עבור כל הסטנדרטים שלנו 5 על ציר ה-X. <table style="width: 416px; height: 118px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> נפח תקן טירוזין </th><th style="text-align:center"> uMoles טירוזין </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.05 </td><td style="text-align:center"> 0.055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.10 </td><td style="text-align:center"> 0.111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.20 </td><td style="text-align:center"> 0.221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.40 </td><td style="text-align:center"> 0.442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.50 </td><td style="text-align:center"> 0.553 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי נקודות הנתונים הוזנו, ליצור קו בכושר הטוב ביותר ואת המשוואה מדרון המקביל. מצא את השינוי ספיגת בדגימות בדיקה על ידי חישוב ההפרש בין ספיגת במבחן מדגם ואת ספיגת ריק הבדיקה. הכנסת ערך ספיגת אחד של דגימות בדיקה למשוואה מדרון ופתרון תגרום micromoles של שחרור טירוזין במהלך התגובה הזאת proteolytic בפרט. כדי לקבל את הפעילות של האנזים יחידות מ&quot;ל /, לבצע את החישוב הבא: (ושווי טירוזין umole שוחרר) x (11) יחידות / מ&quot;ל אנזים = __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = סה&quot;כ נפח (ב מיליליטר) של assay 10 = שעה של assay (בדקות) לפי ההגדרה היחידה 1 = נפח האנזים (ב מיליליטר) של האנזים המשמש Volume 2 = (ב מיליליטר) המשמשים קביעת Colorimetric קח את מספר ושווי micromoles טירוזין שוחרר המתקבל המשוואה המדרון הכפל אותו ב מהנפח הכולל של assay ב-MLS, שבמקרה שלנו הוא 11mls. מחלקים ערך זה על ידי שלושה כמויות אחרות: הזמן של assay, אשר רצנו 10 דקות, נפח של אנזים המשמש assay, שהיה מגוונות (בואו להשתמש 1ml), נפח מ&quot;ל המשמש לגילוי colorimetric, אשר עשוי שונים המבוססים על קובט שלך. השתמשנו 2 MLS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micromoles של טירוזין מחולק זמן מדידת התשואות דקות של פעילות הפרוטאז שנקרא &quot;יחידות&quot;. אנחנו יכולים לבטל את יחידות למדידת נפח במונה וגם במכנה, משאיר מדידה של פעילות האנזים במונחים של יחידות / מ&quot;ל. על מנת לקבוע את הפעילות מדגם פרוטאז מוצק מדולל diluent האנזים, אנו מחלקים את הפעילות שלנו ביחידות / ml ידי ריכוז מוצק המשמש assay זה במקור מ&quot;ג / מ&quot;ל. והותיר אותנו עם פעילות במונחים של יחידות / מ&quot;ג . יחידות / מ&quot;ל אנזים יחידות / מוצק מ&quot;ג = _____________________ מ&quot;ג מוצק / מ&quot;ל אנזים </li></ol>

<ol><li>Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li>
<li>Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).</li>
</ol>

הוכחנו רק אותך איך לנתח פעילות הפרוטאז באמצעות פעילות assay אוניברסלי של סיגמא פרוטאז. בנוסף, assay זו שימושית כדי להבטיח פרוטאזות שלנו קבעו דווקא פעילות לפני שתקבל אותם עבור הניסויים שלך. כפי שראיתם, בעת ביצוע הליך זה, זה בעל חשיבות עליונה לזכור חום הן קזאין ופתרונות טירוזין לאט, לא להרתיח אותם. כמו כן, זה קריטי כדי להכין את החסר שונה עבור שני תקני שלך למדגם כל מבחן שיש לך.

<table><tbody><tr><td>פרוטאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, דיבסי, טריהידרט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>קזאין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריכלוראצטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>פולין &amp;ריאגנט הפנול של Ciocalteu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פחמתי, ללא מים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>סודיום אצטט, טריהידרט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>סידן אצטט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-טירוזין, בסיס חופשי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לפרופיל פרוטאזות (Protease Profiler Kit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לזיהוי פלואורסצנטי של פרוטאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

סיגמא של non-ספציפיים פעילות assay פרוטאז - קזאין כמו מצע

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

פרוטאזות לשבור אג&quot;ח הפפטיד. במעבדה, היא לעתים קרובות צורך למדוד ו / או להשוות את הפעילות של פרוטאזות. הלא ספציפית של סיגמא פעילות assay פרוטאז יכולים לשמש בהליך סטנדרטי כדי לקבוע את הפעילות של פרוטאזות, וזה מה שאנחנו עושים במהלך הליכי בקרת האיכות שלנו. ב assay זו, קזאין משמש מצע. כאשר אנו בודקים פרוטאז מעכל קזאין, טירוזין חומצה אמינית משוחרר יחד עם חומצות אמינו אחרות ושברי פפטיד. מגיב Folin ו Ciocalteus פנול, או של Folin בעיקר מגיב עם טירוזין חינם לייצר chromophore בצבע כחול, אשר לכימות ומדד כערך ספיגת על ספקטרופוטומטר. טירוזין יותר כי הוא שוחרר מבית קזאין, יותר chromophores נוצרים חזקה יותר פעילות של פרוטאז. ספיגת ערכים שנוצר על ידי פעילות של פרוטאז הם לעומת עקומת רגיל, אשר מופק על ידי מגיבים בכמויות ידוע של טירוזין עם מגיב FC לתאם שינויים ספיגת עם כמות של טירוזין ב micromoles. מתוך עקומת סטנדרט הפעילות של דגימות פרוטאז ניתן לקבוע במונחים של יחידות, המהווה את הסכום micromoles ושווי טירוזין שוחרר מבית קזאין לדקה. כדי להציג את המאמר הזה בסינית, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">לחץ כאן</a>

פרוטאזות לשבור אג&quot;ח הפפטיד. במעבדה, היא לעתים קרובות צורך למדוד ו / או להשוות את הפעילות של פרוטאזות. הלא ספציפית של סיגמא פעילות assay פרוטאז יכולים לשמש בהליך סטנדרטי כדי לקבוע את הפעילות של פרוטאזות.

סיגמא של Non-ספציפיים פעילות Assay פרוטאז - קזאין כמו מצע

פרוטאזים מפרקים קשרי פפטיד. במעבדה, לעיתים קרובות יש צורך למדוד ו/או להשוות את הפעילות של פרוטאזים. הפרוטאז הבלתי ספציפי של Sigma...

פרוטאזות מפרקות קשרי פפטיד במעבדה. לעיתים קרובות יש צורך למדוד ו/או להשוות את הפעילות של פרוטאזות. ניתן להשתמש בבדיקת הפעילות העקבית של פרוטאזות מבית Sigma כפרוצדורה סטנדרטית לקביעת פעילותן של פרוטאזות, וזו הפעולה שאנו מבצעים במהלך נהלי בקרת האיכות שלנו.בבדיקה זו, קזאין משמש כתסבס כאשר הפרוטאז הנבדק מעכל את הקזאין. חומצת האמינו טירוזין משתחררת יחד עם חומצות אמינו אחרות ומקטעי פפטידים. טירוזין חופשי מגיב לאחר מכן עם foliage ו-cyl cals phenol או עם reagent fallen כדי להפיק כרומופור בצבע כחול, שניתן לכימות ולמדידה כערך בליעה (absorbance) בספקטרופוטומטר.ככל שמשתחררת יותר טירוזין מהקזאין, כך נוצרים יותר כרומופורים ופעילות הפרוטאזה חזקה יותר. ערכי הבליעה הנוצרים כתוצאה מפעילות הפרוטאזה מושווים לעקומת סטנדרט, הנוצרת על ידי תגובה של כמויות ידועות של טירוזין עם ריאגנט FC, כדי להקיים מתאם לשינויים בבליעה. באמצעות כמות הטירוזין במיקרומולים מהעקומת סטנדרט, ניתן לקבוע את פעילות דגימות הפרוטאזה במונחים של יחידות, המגדירות את כמות שווה-המיקרומולים של טירוזין המשתחררים מקזאין לדקה. שלום, שמי היא Carrie Cup Vineyard ואני מדענית במתקן של Sigma Aldridge DeKalb כאן בסנט לואיס, מיזורי.היום אדגים לכם דרך ישימה באופן אוניברסלי לבדיקת פעילות פרוטאז ב-Sigma Aldridge. אנו משתמשים במבדק זה בעיקר בתחום בקרת האיכות שלנו כדי להבטיח שלפרוטאז יש פעילות מספקת לפני שנשלח אותו ישירות אליכם למעבדה. לפני תחילת המבדק, עלינו לוודא שהריאגנטים הבאים הוכנו כראוי.בופר פוטסיום פוספט 50 millimolar, pH 7.5. התמיסה מונחת בטמפרטורה של 37 °C לפני השימוש עם תמיסת kasian בריכוז של 0.65% משקל לנפח, שהוכנה על ידי ערבוב של 6.5 mg/mL בליטר אחד. טמפרטורת התמיסה מועלית בהדרגה תוך ערבוב עדין ל-80 עד 85 °C למשך כ-10 דקות, עד להשגת דיספרסיה הומוגנית.חשוב מאוד לא להרתיח את התמיסה. לאחר מכן מתאימים את ה-pH במידת הצורך באמצעות נתרן הידרוקסיד וחומצה כלורית. תמיסת חומצה טריכלוראצטית בריכוז 110 millimolar המוכנה על ידי דילול של תמיסת מקור בריכוז 6.1 normal ביחס של 1 ל-55 עם מים מזוקקים, 0.5 millimolar, Fallen and Seal calts או רכיב phenol fallen, שהיא התמיסה שתגיב עם טירוזין כדי ליצור שינוי צבע מדיד.זה יהיה קשור ישירות לפעילות של פרוטאזות. תמיסת נתרבן פחמתי (sodium carbonate) בריכוז 500 millimolar שהוכנה באמצעות 53 mg/mL של נתרבן פחמתי אנहाइडרבי במים מזוקקים, תמיסת דילול לאנזים, המורכבת מבאפר נתרבן אצטט (sodium acetate) בריכוז 10 millimolar עם 5 millimolar סידן ב-pH 7.5 ובטמפרטורה של 37 °C. תמיסה זו היא זו שבה נשתמש כדי להמיס דגימות פרוטאז מוצקות או לדלל תמיסות אנזים.תמיסת מלאי הסטנדרט של L tyrosine, אשר צריכה להיות בריכוז ראשוני של 1.1 millimolar (תמיסה של 0.2 milligram למיליליטר של L tyrosine), מוכנה במים מזוקקים ומחוממת בעדינות עד להמסת ה-tyrosine. בדומה ל-casein, אין להרתיח תמיסה זו. יש להמתין עד שהסטנדרט של L tyrosine יתקרר לטמפרטורת החדר.תמיסה זו תדלל עוד יותר להכנת עקומת הסטנדרטים במידת הצורך; דגימה מוצקה של פרוטאז עם פעילות שנקבעה מראש, המומסת באמצעות מדלל אנזימים לריכוז של 0.1 עד 0.2 יחידות למילליליטר. תמיסה זו משמשת כביקורת חיובית עבור בדיקת בקרת האיכות, וכתיקוף לחישובים שנבצע כדי לקבוע את הפעילות האנזימטית. כעת, לאחר שהכנו את הריאגנטים וכולם נמצאים בטמפרטורה הנכונה, נתחיל בבדיקת הפרוטאז.כדי להתחיל במדידה זו, מצאו מבחנות מתאימות בנפח של כ-15 milliliters. עבור כל אנזים שתיבחנו, תזדקקו לארבע מבחנות. מבחנה אחת תשמש כביקורת (blank), ושלוש נוספות ישמשו למדידת Activity של שלושה.דילול של הפרוטאז; שלושה דילולים הם שימושיים כאשר בודקים את החישובים הסופיים שלנו זה מול זה; לכל סט של ארבעה מבחנות, העבר 5 mL של תמיסת ה-0.65% kasian והשאר אותן להגיע לשיווי משקל באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך כחמש דקות. לאחר מכן, הוסף ריכוזים משתנים של תמיסת האנזים לשלוש ממבחנות הדגימה, אך לא למבחנת הביקורת (blank). ערבב אותן באמצעות סיבוב והדגס בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות בדיוק.פעילות הפרוטאז ושחרור הטירוזין הנובע מכך במהלך זמן הדגירה הם המדדים שיימדדו ויושוו בין דגימות הבדיקה שלנו. לאחר דגירה זו של 10 דקות, יש להוסיף חמישה מיליליטר של ריאגנט TCA לכל מבחנה. לאחר מכן, מוסיפים לכל מבחנה, כולל למבחנת הביקורת (blank), נפח מתאים של תמיסת אנזים, כך שהנפח הסופי של תמיסת האנזים בכל מבחנה יהיה מיליליטר אחד.פעולה זו מבוצעת כדי להביא בחשבון את ערך הבליעה של האנזים עצמו. כעת דגרו את התמיסות בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות. במהלך דגירה זו של 30 דקות, ניתן להכין את דילוציות התקן של הטירוזין, זאת באמצעות שימוש בשישה מבחנות DR.שבמסוג זה יכול להכיל בקלות שמונה מיליליטרים עבור ששת המבחנות. תמיסות סטנדרט של טירוזין בריכוז 1.1 millimolar מתווספות בנפחים הבאים במיליליטרים: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 ו-0.5. אין להוסיף סטנדרט של טירוזין לדגימת הביקורת (blank).ייתכן שיהיה צורך בתמיסות סטנדרט בריכוז נמוך יותר עבור דגימות בדיקת IPU שצפויות להניב שינוי צבע קטן. לאחר הוספת תמיסת הסטנדרט של טירוזין, הוסיפו נפח מתאים של מים מזוקקים לכל אחד מהסטנדרטים כדי להביא את הנפח לשני מיליליטרים. לאחר הדגירה, סננו כל אחת מתמיסות הבדיקה ואת תמיסת הביקורת (blank).באמצעות מסנן מזרק של 0.45 מיקרון, מוסיפים שני מיליליטרים של דגימות הבדיקה ומסנן ריק (blank) לארבעה מבחנות DR בעלות נפח של שמונה מיליליטרים לפחות. ניתן להשתמש באותו סוג של מבחנה שבה הוכנו התמיסות הסטנדרטיות. לכל המבחנות המכילות את התמיסות הסטנדרטיות ואת הסטנדרט הריק, מוסיפים חמישה מיליליטרים של sodium carbonate, ולתוצאות מיטביות, מוסיפים מיד לאחר מכן את הריאגנט המצוין. לאחר מכן, מוסיפים sodium carbonate לדגימות הבדיקה ולדגימה הריקה. ניתן להבחין כי תמיסות אלו הופכות לעכורות לאחר הוספת ה-sodium carbonate.לאחר מכן מוסיפים את הריאגנט ששקע, אשר יגיב עם טירוזין חופשי. את מבחנות ה-DRAM מערבבים בתנועות סיבוביות ומדגירים בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. ניתן להבחין כי לתמיסות הסטנדרט יש מדרג צבעים התואם לכמות הטירוזין שהתווספה, כאשר הריכוזים הגבוהים ביותר של טירוזין נראים ככהים ביותר.ניתן להבחין גם בשינוי צבע ניכר בדגימות הבדיקה שלנו. שני מיליליטר של תמיסות אלו מסוננים באמצעות מסנן מזרק של 0.45 micron וקווובטות מתאימות. כעת, לאחר שסיימנו את הבדיקה, נעבור לספקטרופוטומטר ונרשום את ערכי הבליעה שלנו.בליעת האור (Absorbance) של הדגימות שלנו נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר באורך גל של 660 ננומטרים. נתיב האור נקבע לסנטימטר אחד; רשמו את ערכי הבליעה עבור התמיסות הסטנדרטיות, עבור הבלנק (blank) של הסטנדרט, עבור דגימות הבדיקה השונות ועבור בלנק של הבדיקה. לאחר איסוף כל הנתונים, נוכל להכין את עקומת הסטנדרט שלנו.על מנת להפיק את העקומות, יש לחשב את הפרש הבליעה בין התמיסה הסטנדרטית לבין הבלנק של הסטנדרט. זהו ערך הבליעה המיוחס לכמות הטירוזין בתמיסות הסטנדרט. לאחר החישוב הפשוט, נבנה את עקומת הסטנדרט על ידי שרטוט השינוי בבליעה של הסטנדרטים שלנו על ציר ה-Y אל מול הכמות במיקרומול עבור כל אחד מחמשת הסטנדרטים שלנו על ציר ה-x.לאחר שהזנו את נקודות הנתונים ויצרנו קו התאמה מיטבית, נגלה את השינוי בבליעה בדגימות הבדיקה שלנו על ידי חישוב ההפרש בין הבליעה של דגימת הבדיקה לבין הבליעה של דגימת הביקורת (blank). בהתבסס על עקומת הסטנדרט, נזהה את ערך הבליעה עבור אחת מדגימות הבדיקה שלנו בציר Y. כעת, נשרטט קו במקביל לציר X ונעצור בנקודה שבה הוא פוגש את עקומת הסטנדרט.לאחר מכן, מתוך ערך ציר ה-X שנמדד בנקודה זו, נקבל את הכמות ואת מספר המיקרו-מול של טירוזין ששוחררו במהלך תגובה פרוטאוליטית ספציפית זו. כדי לחשב את פעילות האנזים ביחידות למבליליטר, בצעו את החישוב הבא: קחו את מספר שווי-ערכי המיקרו-מול של טירוזין ששוחררו, כפי שהתקבל מעקומת הסטנדרט, והכפילו אותו בנפח הכולל של הבדיקה במיליליטרים, שבמקרה שלנו הוא 11 מיליליטרים. לאחר מכן, חלקו ערך זה בשלושה גדלים נוספים.משך הבדיקה, שביצענו במשך 10 דקות, נפח האנזים ששימש בבדיקה, אשר השתנה. נשתמש ב-1 milliliter. נפח ה-milliliters ששימש בזיהוי הכולורימטרי, שעשוי להשתנות בהתאם ל-Q vet שלך.אנו משתמשים בשני מיליליטרים. חלוקת מספר המיקרומולים של טירוזין בזמן בדקות נותנת לנו את המדידה של פעילות הפרוטאז, אותה אנו מכנים יחידות. ניתן לבטל את יחידות מידת הנפח במונה ובמכנה, ובכך נותרים עם מדידה של פעילות האנזים במונחים של יחידות למיליליטר.כדי לקבוע את הפעילות בדגימה של פרוטאז מוצק המדולל בדילול אנזימים, נחלק את הפעילות ביחידות למילליליטר בריכוז של החומר המוצק ששימש במקור במדידה זו במילגרם למילליליטר, ובכך נקבל את הפעילות ביחידות למילגרם. כעת הצגנו בפניכם כיצד לנתח פעילות פרוטאז באמצעות בדיקת פעילות הפרוטאז האוניברסלית של Sigma. כפי שראיתם בעת ביצוע הליך זה, קריטי לזכור לחמם הן את תמיסות ה-casein והן את תמיסות ה-tyrosine באיטיות ולא להרתיח אותן.כמו כן, קריטי להכין בלאנקים (blanks) נפרדים הן עבור התמיסות הסטנדרטיות והן עבור כל דגימת בדיקה שברשותכם. זהו, תודה שצפיתם ובהצלחה במדידות פעילות הפרוטאז שלכם.

sigma-s-non-specific-protease-activity-assay-casein-as-a-substrate

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ערכת פלורסנט פרוטאז איתור מיועד למדידת פעילות הפרוטאז באמצעות fluorometry. זה מתאים גם זיהוי של כמויות זעירות של זיהום פרוטאז. השיטה מבוססת על hydroysis פרוטאוליטי של ניסוח קניינית של מצע קזאין FITC שכותרתו.

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

אנו מיישמים ללא תווית חלבון אינטראקציה באמצעות ניתוח X100 Biacore לניתוח המבנה והתפקוד של הכריכה של מוטציות ב 'מספר cystatin כדי papain דרך אפיון קינטי. כיול ללא ניתוח ריכוז (CFCA) מודד את הריכוז של חלבון עם פעילות מחייב שמר ללא צורך עקומת סטנדרט. אנו מראים כי אישור של ריכוזי באמצעות CFCA מגבירה את האמינות של הניתוח הקינטית כי קבועים הקינטית יכול להיקבע בצורה אמינה, גם אם את פעילותו של חלבון רקומביננטי מצטמצם.

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

סרטון זה מדגים בדיקת ביוסנסור מוליך כדי לחקור את האינטראקציה של נוגדן עם אנטיגן מטרה משותק על שבב מתמר. הביוסנסור מהונדס כך שיהיה לו חלבון כימרי דו-תפקודי – אנזים β-לקטמאז עם אתר קטליטי פונקציונלי המאוחה לננון לצורך קשירה לאנטיגן המטרה המשותק. עם הקשירה, ההידרוליזה הקטליטית של מצע אנטיביוטי על ידי האנזים β-לקטמאז מייצרת אות חשמלי - המאשר את האינטראקציה בין אנטיגן לנוגדן.

בדיקת ביוסנסור מוליך מבוססת β-לקטמאז לאינטראקציות חלבון-חלבון

סרטון זה מדגים בדיקה לסינון הפעילות הפרוטאוליטית של פרוטאזות באמצעות פפטידים פלואורוגניים. הפרוטאז מזהה את מיקום המחשוף שלו על הפפטיד, חותך אותו ומפריד את המרווה מהפלואורופור, מה שמאפשר את פליטת הפלואורסצנטיות שלו. האות הפלואורסצנטי מזוהה ומנותח כדי לבדוק את יעילות המחשוף של גרסאות פפטידים שונות.

בדיקת מחשוף פפטיד פלואורוגני לבדיקת הפעילות הפרוטאוליטית של פרוטאזות

סרטון זה מדגים כיצד למדוד את פעילות הפרוטאזום בתאים תת-תאיים שונים של האמיגדלה הצידית ממוחות של חולדות מותני פחד ולשלוט בהם באמצעות בדיקת פפטיד פלואורוגני. הפרוטאזום חותך את המצע הפפטידי הפלואורוגני, ומשחרר מולקולות פלואורסצנטיות, אשר מכומתות באמצעות קורא לוחות כדי להעריך את פעילות הפרוטאזום בשברים של חלבון גרעיני וסינפטי. פעילות גרעינית מוגברת מצביעה על שינויים בביטוי גנים, בעוד שפעילות סינפטית מופחתת מצביעה על ייצוב חלבונים הנחוץ לתחזוקת הזיכרון לטווח ארוך.

מדידת פעילות פרוטאזום בתאים תת-תאיים שונים במוח החולדה

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לסינון ואפיון מהיר של אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית. בדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות ובדיקת שחרור הצבע משתמשות במצעי חיידקי מטרה להערכת פעילות אנזימטית איכותית וכמותית.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע ירידה לפרטים פרוטאז ברקמת העכבר גולמי תמציות באמצעות ספקטרומטר MALDI-TOF.

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

אנו מציגים פפטיד fluorogenic assay המחשוף המאפשר הקרנה מהירה הפעילות הפרוטאוליטי של פרוטאזות על פפטידים המייצגים האתר המחשוף של פפטידים פיוז'ן ויראלי. שיטה זו יכולה לשמש גם על כל מוטיב חומצת אמינו אחרות בתוך רצף חלבונים כדי לבדוק את הפעילות פרוטאז.

Fluorogenic פפטיד Assay המחשוף, למסך לפעילות הפרוטאוליטי: יישומים עבור הקורונה ספייק הפעלת חלבון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור טכניקה שונה zymographic שבו ניאון פפטידים משמשים את המצע מתכלה במקום חלבונים מקורית. אלקטרופורזה של דגימות ביולוגיות בפפטיד פלורסנט zymograms מאפשר זיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות מאשר טכניקות zymographic הקודם.

זיהוי של פרוטאז פעילות על-ידי ניאון פפטידים Zymography

כתב יד זה, הקמנו שיטה תפוקה גבוהה לכמת פעילות פוספטאז אלקליין בתרבות biofilm S. aureus באמצעות גלופה תרביות רקמה...

ערכי צבע מוחלטים ניתוח אלקליין פוספטאז פעילות ב- S. aureus Biofilm

שיטה זו מתארת בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת לקטין כדי לכמת את זיקת הקישור של פוספטאז גלוקן ועמילופקטין. בדיקת שקיעה משותפת זו אמינה למדידת קשירת מצע גלוקן פוספטאז וניתן ליישם אותה על מצעים גלוקניים מסיסים שונים.

Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

למדו מדידת פעילות פרוטאזים בשיטת אסיי סטנדרטית המבוססת על עיכול קזאין ושחרור טירוזין. שיטה זו מאפשרת בקרת איכות מדויקת של הכנות אנזימים במעבדה.

סיגמא של Non-ספציפיים פעילות Assay פרוטאז - קזאין כמו מצע

גלה סרטונים נוספים