בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה
2 בספטמבר 2008
הרכבה קרום הגרעין היא צעד חיוני במחזור חלוקת התא, תהליך זה יכול להיות משוכפל במבחנה על ידי שילוב של הכרומטין Xenopus זרע, cytosol, וכן שברים קרום אור. גרעינים השלם נוצרים, כולל ממברנות הגרעין עם מתחמי הנקבובית, ואלה גרעינים מחדש מסוגלים תהליכים גרעיניים רגילים.
תמציות ביצים של Xip Labus שימושיות כחומר ציטופלזמי וחומרי אברונים לשחזור in vitro של אירועים תאיים כגון הרכבת הגרעין וייבוא חלבונים לגרעין. כאשר DNA של כרומטין מזרה מתווסף לתמציות ביצי XUS גולמיות או מופרדות, שלפוחיות ממברנה הנמצאות בתמצית נקשרות לפני השטח של הכרומטין, מתמזגות, ומטמיעות רכיבי נקבים גרעיניים כדי ליצור גרעינים סינתטיים תפקודיים באופן מלא. אפיון הבסיס המולקולרי של תהליכים אלו אפשרי לאחר מכן באמצעות דילול אימונולוגי (immuno depletion) של התמציות ובעריכת חלבונים.
שלום, שמי מארי קרוס ואני סטודנטית לתואר מתקדם במעבדתה של ד"ר מורן פאוור במחלקה לביולוגיה של התא באוניברסיטת אמורי באטלנטה, ג'ורג'יה. היום נראה לכם כיצד להשריש גרעינים in vitro באמצעות תמריות ביצים של זבובים שעברו פרקציונציה. הליך זה כולל את השלבים הבאים: ביצוע תגובת הרכבת הגרעין והערכת היווצרות הגרעינים.
אם כך, נתחיל. כדי להתחיל בהרכבה גרעינית, קחו מנה של ציטוסול שעבר פרקציונציה והוסיפו פוספוקריאטין מתוך תמיסת מקור בריכוז 0.2 molar עד לריכוז סופי של 20 millimolar. לאחר מכן, הוסיפו קריאטין קינאז מתוך תמיסת מקור בריכוז חמישה מיליגרם למיליליטר עד לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר.
לבסוף, הוסיפו 20 micromolar ATP באמצעות תמיסת סטוק בריכוז 0.2 molar. לאחר מכן, הוסיפו ממברנות קלות לציטוסול בדילול של 1 ל-10. פעולה זו מקריבה את כמות הממברנה שנמצאת בתמצית הגולמית המקורית.
ערבב את כל הרכיבים באמצעות פיפוט מעלה ומטה כדי להפיץ את הממברנות בתוך התמצית. יש לבצע זאת לפני הוספת הכרומטין של תאי הזרה. לאחר מכן, הוסף כרומטין של תאי זרה לתמצית המופרדת בריכוז הרצוי, וערבב מיד את התמצית ותאי הזרה יחד באמצעות פיפוט עדין מעלה ומטה עם טיפ קטום (cutoff tip).
כאשר כרומטין של תאי זרע מתווסף לתמצית, הוא מתחיל מיד להתפרק, להתעבות ולהפוך לרגיש לגזירה. בדרך כלל, תגובות אלו מכינים בתוך מבחנות צנטריפוגה של 500 microliter בנפח כולל של פחות ממאה microliters. תמציות הביצית יתמכו ביצירה של עד 8,000 עד 9,000.
גרעינים למיקרוליטר; דגרו את התערובת במשך שעה אחת עד שעתיים בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לגרעינים להיווצר. הגרעינים נצבעים לצורך ויזואליזציה. לאחר כ-30 דקות, הגרעינים שנוצרו יהיו קטנים ובעלי צורה אובלית.
ה-DNA עדיין דחוס למדי, והגרעין אמור להיראות כחול בהיר אחיד בשלב הסיבוב של הוו (hook spinning) כאשר הוא נצפה בערוץ ה-UV בעוד ה-DNA נדחס. בנוסף, הצביעה הכחולה תהיה פחות הומוגנית, כאשר בהמשך יופיעו רווחים שחורים. ניתן להדמיות את היווצרות המעטפת הגרעינית על ידי הוספה של מיקרוגרם אחד לזכר של 3,3-diaminocarboxamine או DHCC למקבע.
DHCC הוא צבע ליפופי פלואורסצנטי המדמים בערוץ פלואורסצאין. בשלבים המוקדמים של הרכבת הגרעין, שלפוחיות ממбраנה נקשרות לפני השטח של הכרומטין ומתחילות להתמזג בכתמים. דבר זה מוביל למראה לא אחיד ובלתי רציף של הממברנה המתרקבת.
ברגע שהממברנה מושלמת, היא נמתחת על פני הגרעין ותיראה כטבעת אחידה ובלתי פסוקה סביב ה-DNA. תהיה כמות ניכרת של פלואורסצנציית רקע בציטוזול שסביב בשל שלפוחיות ממברנה שלא שולבו בגרעינים. הצגנו כעת שחזור גרעיני in vitro באמצעות פראקציות ממיסות וממברנות קלות ממיצוי ביצי xenopus.
חשוב לזכור שניתן להשתמש בתמצית גולמית להרכבת גרעין, אך לא לאחר הקפאה והפשרה. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
מאמר זה דן בשחזור in vitro של הרכבת הגרעין באמצעות תמריות ביצים של Xenopus. התהליך כולל שילוב של כרומטין של זרע עם רכיבים ציטוזוליים ליצירת גרעינים תפקודיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- הרכבת הגרעין
- טכניקות In Vitro
רקע
- הרכבת המעטפת הגרעינית היא קריטית במהלך חלוקת התא.
- תמציות ביצים של Xenopus מספקות מודל לחקר תהליכים גרעיניים.
- גרעינים ששוחלבו יכולים לבצע תפקודי גרעין תקינים.
- הבנת הרכבת הגרעין יכולה לסייע במחקר ביולוגיה תאית.
מטרת המחקר
- להדגים את היווצרות הגרעינים in vitro.
- לאפיין את המנגנונים המולקולריים המעורבים בהרכבת הגרעין.
- לספק פרוטוקול מפורט עבור חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת ציטוזול מופרקט והוספה של פוספוקריאטין, קריאטין קינאז ו-ATP.
- שילוב של ממברנות קלות וכרומטין של זרע לתוך התמצית.
- דגירה של התערובת כדי לאפשר היווצרות גרעינים.
- הדמיה של הגרעינים באמצעות טכניקות צביעה פלואורסצנטית.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של גרעינים סינתטיים מכרומטין של זרע וממיצויי ביצית.
- ויזואליזציה של הרכבת ממברנת הגרעין ושילוב קומפלקס הנקבים.
- אפיון של תהליך ההרכבה באמצעות דילול אימונולוגי (immunodepletion) ועריכת חלבונים.
- תצפית על דינמיקת מיזוג של שלפוחיות ממברנה במהלך ההרכבה.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה מהימנה להרכבה של גרעין in vitro.
- הושגו תובנות לגבי המנגנונים של היווצרות ממברנת הגרעין.
- ניתן להשתמש בפרוטוקול זה למחקרים נוספים בביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הרכבה גרעינית in vitro באמצעות תמרירי ביצי Xenopus שחולקו למ fractions מאפשרת ניתוח מכניסטי של היווצרות ממברנה גרעינית, אירוע קריטי בחלוקת התא ובמדורו של הגנום. מערכת זו מספקת פלטפורמה נשלטת לבדיקת הביוגנזה של המעטפת הגרעינית, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בתהליכי גילוי מוקדמים ותיקוף מטרות. המודולריות וההדירות שלה הופכות אותה לבעלת ערך עבור סטנדרטיזציה של בדיקות הרכבה גרעינית ברחבי תיקי פיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של היפותזות לגבי הרכבת הגרעין על ידי מניפולציה של הרכב התמצית.
- תומך בתיקוף תפקודי של חלבונים מועמדים באמצעות דיפלציה אימונולוגית או הוספת חלבון.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד משתנים בתהליך היווצרות מעטפת הגרעין.
- מספק מדד כמותי להבהרת מסלולים ולתיעדוף מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מבסס מערכת in vitro הניתנת לשחזור להערכת מודולטורים של הרכבה גרעינית.
- מספק פלטיים סטנדרטיים וקוונטיפיביליים באמצעות ויזואליזציה גרעינית מבוססת פלואורסצנציה.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) של הבדיקה ובשחזור בין מעבדות לצורך סריקת תרכובות.
- מאפשר ביצוע Benchmarking מהימן של אירועי ייבוא גרעיני והיתוך ממברנות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מסלולים הרלוונטיים למחלות המערבים את שלמות המעטפת הגרעינית.
- מספק רצף מגילוי מכניסטי ועד לתיקוף במודל פרה-קליני.
- תומך בקידום של אסטרטגיות טיפוליות המכוונות לגרעין, תוך התאמה לסיכונים.
- מציע הפחתת סיכונים חזויה עבור פגמים בהרכבת הגרעין המעורבים במחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מערכת הרכבה זו in vitro מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת בדיקה מונחית-היפותזה של תהליכי ההיווצרות והתפקוד של המעטפת הגרעינית.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבידוד ובמניפולציה של משתני הרכבת הגרעין לצורך ניתוח מסלולים.
- סריקה: מספק פלטפורמה חסונה להערכה כמותית של היווצרות הגרעין והיתוך ממברנות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה מבוססת פלואורסצנציה של קינטיקה ושלב ההשלמה של הרכבת הגרעין.
- מחקר תרגומי: מקל על מידול פגמים במעטפת הגרעין הרלוונטיים למחלות אנוש.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע בדיקה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר להרכבת הגרעין על פני מספר תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במנגנוני הרכבה גרעינית ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה סטנדרטיות וניתנות לשחזור למחקרי הרכבה גרעינית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך ביצוע (go/no-go) על ידי הבהרת תלויות במסלולים גרעיניים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של נכסים המכוונים לגרעין.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהכנת תמציות ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב גישה לתמציות ביצי Xenopus מופרדות ולריאגנטים ייעודיים לצביעה.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך הדירות (reproducibility).
- עשוי לדרוש התאמה למקורות שונים של כרומטין או ממברנה.
- תלוי באיכות התמצית הטריה; הקפאה והפשרה עלולות לפגוע בתוצאות.
