בעזרת פינצטה לייזר עבור מניפולציה נוירונים מבודד במבחנה
11 בספטמבר 2008
וידאו זה מתאר את המניפולציה של נוירונים בתרבית באמצעות לייזר פינצטה במבחנה.
Ashkin היה הראשון שהראה שפינצטות לייזר או מלכודות אופטיות הן כלי רב עוצמה למניפולציה של עצמים חיים ממוזערים במיקרון. בסרטון זה, נראה כיצד יישמנו טכנולוגיה זו כדי ללכוד ולהזיז נוירונים. זוהי תחנת העבודה של הפינצטות האופטיות.
החצים הירוקים מראים את הנתיב שעוברת קרן הלייזר דרך האופטיקה של המיקרוסקופ. כאשר קרן לייזר הממוקדת על ידי עדשת העדשה של המיקרוסקופ נשברת על ידי תא, הכוח המשנה את כיוון קרן האור פועל על התא ומזיז אותו לעבר מרכז המיקוד.
פעולה זו מייצרת כוחות של Pika Newton המספיקים כדי למשוך תא דרך תווך. בסרטון זה, נדון בייצור של צלחות, הכנה של תאי רשתית, זריעת תאים על צלחות תרבית, מניפולציה באמצעות פינצטה לייזרית ותצפית על צמיחת התאים. כיוון שתאים נדבקים לזכוכית, היינו צריכים ליצור אזור דוחה-תאים שבו ניתן ללכוד תאים בקלות באמצעות הפינצטות.
חצי מהצלחת ציפו ב-poly hema, פולימר דוחה תאים. החצי השני צופה ב-cell one, תשתית התומכת בצמיחת התאים שלנו. תחילה, מזהים תא בצד הדביק לתאים של הצלחת.
לאחר מכן, תא נוסף נלכד בצד הפולימר ומועבר לצד הדבקה, שם שני התאים מוצמדים זה לזה. להכנת הצלחונות, אנו משתמשים בצלחוני תרבית סטריליים של Polystar בקוטר 35 מילימטר, אשר עברו ניקוי מאבק. ראשית, אנו קודחים חור של סנטימטר אחד בתחתית באמצעות מחרטה קטנה או מקדחה שולחנית.
קחו זכוכית כיסוי נקייה מחומצה והניחו אותה במצב זקוף בסביבה נקייה מאבק, כגון מנדף. קחו את תמיסת ה-polyus המומסת ב-95%alcohol והניחו מספר טיפות ליד החלק העליון של זכוכית הכיסוי בחצי אחד בלבד. הניחו ל-poly hema להתייבש. סמנו את צד ה-polyus של זכוכית הכיסוי.
הניחו S guard מסביב לחור בתחתית צלחת הטיפוח. הדביקו את זכוכית הכיסוי לצלחת באמצעות ה-S guard. ודאו שהפוליאמיד נמצא בצד הפנימי וכן ודאו שאין דליפות דרך רווחי ה-sill guard.
הניחו את כיסוי הזכוכית כך ששפת ציפוי ה-poly hema תעבור במרכז הפיתה. הניחו לפיתה להתייבש למשך יומיים עד שלושה ימים, ולאחר מכן שרטטו את תחתית הפיתה בעזרת עט עם חוד יהלום כדי ליצור סימנים שישמשו כנקודות ייחוס למיקום הפיתה על במה המיקרוסקופ. הניחו את הפיתות במנדף ועקרו אותן תחת אור ultraviolet.
טפטפו טיפה אחת או שתיים של תמיסת נוגדן goat anti-US על הצד שאינו מצופה ב-polyus של הצלחת, תוך הקפדה שלא לשפוך אותה על הציפוי ה-poly hemic, והמתינו למשך כשלוש שעות. הסירו את התמיסה ושטפו עם ringer סטרילי. הניחו תמיסת נוגדן ראשוני לתאים באותו אזור והדגרימו למשך הלילה, כדי שהמדגם יהיה מוכן לניסוי למחרת.
התאים במעבדה שלנו מופקים מרשתית של סלמנדרה בוגרת בשלב המימי. הרשתית מבודלת ומוצאת, מעובדת בעיכול אנזימטי. לאחר מכן ניתן לזרוע את הצלחת התרבית עם התאים המבודדים.
העיניים מוסרות. הקרנית מבודלת ומוסרת. גביע העין מונח בתמיסת רינגר סטרילית.
את הרשתית מפרידים מגביע העין על ידי הוצאתה באמצעות קצה של פינצטה מעוקלת. פחמן דו-חמצני וחמצן מבעבעים לתוך תמיסת רינגר המכילה פרופאן, ולאחר מכן עוברים סטריליזציה באמצעות מסנן עדין של 0.2 מיקרון. את הרשתיות מניחים בתמיסת האנזים ומעכלים למשך כ-40 דקות תוך כדי ערבוב כדי לפרק את הרקמה.
לאחר שטיפה של שלוש פעמים, הרשתיות מופרדות באמצעות tri. באמצעות פיפט עם קצה כדורי בקוטר שלושה מילימטרים, התאים המבודדים מוכנים לזריעה לפני הזריעה. את צלחת התרבית המכילה מצע גידול מניחים עלבמת המיקרוסקופ ומכוונים אותה כראוי באמצעות סימני השריטה בתחתית הצלחת.
פעולה זו מאפשרת לשחזר במדויק את מיקום הצלחת במועד מאוחר יותר. לאחר מכן, התאים נזרעים הן על הצד של ה-poly hema והן על הצד של ה-cell one של הצלחת. מיקום הצלחת על במה המיקרוסקופ, כמו גם עוצמת הלייזר, נשלטים באמצעות הג'ויסטיק.
ראשית, זיהינו תא הדבוק לאחד מצדדי הכלי. זהו תא רטינלי מולטיפולרי (multipolar cell) שניתן לזהות אותו לפי הדנדריטים שלו. קואורדינטות מיקום התא נשמרות.
זהו תא פוטורספטור מסוג קולב (rod) בצד של ה-polyus cell repellent בצלחת. הצלחת מורדת, התא נלכד על ידי הלייזר ומורם מהדופן התחתונה של הצלחת. כעת התא מועבר לצד השני של הצלחת, לקואורדינטות של התא הרב-קוטבי (multipolar cell).
בפועל, התא ניצב במקום. הצלחת היא זו שזזה. התא עובר כעת מעל קצה ציפוי ה-poly hemo.
הבליטה המשתרעת מהתא היא סוף העקשון (axon terminal). התא נמצא במרחק בטוח משאריות ותאים אחרים בתחתית הצלחת, שעלולים להפריע לתנועתו. תמונות מחוץ למיקוד (defocus) של תאים בתחתית הצלחת נראות ברקע.
תא המוט מגיע לתא הרב-קוטבי וניתן למקם אותו במדויק בנקודה ובמרחק הרצויים מאותו תא. הצלחת מורמת והתא נצמד למצע התא. היתרונות העיקריים של הליך זה הם שניתן לבחור אילו תאים להזיז ושהמניפולציות יכולות להתבצע בתוך ניסוי סטרילי סגור.
ניתן לנטר אינטראקציות בין תאים באמצעות צילום וידאו במרווחי זמן (time lapse) או באמצעות צילום דיגיטלי. ניתן להשתמש בפינצטות לייזר בשילוב עם כל טכניקה ביולוגית; כאן, לדוגמה, טכניקת פלואורסצנציה מדגימה נוכחות של חלבוני סינפסה בנקודות החיבור בין תאים שהוזזו באמצעות הפינצטות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מתאר מניפולציה של נוירונים בתרבית באמצעות פינצטות לייזר (laser tweezers) in vitro. פינצטות לייזר מוצגות ככלי רב עוצמה ללכידה והזזה של נוירונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מניפולציה אופטית
- ביולוגיה של התא
רקע
- פינצטה לייזר הוצגה לראשונה על ידי Ashkin כשיטה למניפולציה של עצמים חיים מיקרוסקופיים.
- טכנולוגיה זו מאפשרת שליטה מדויקת בתנועות תאיות.
- הבנת המניפולציה של נוירונים יכולה לסייע ביישומים שונים של מחקר במדעי המוח.
- מלכודות אופטיות עושות שימוש בקרני לייזר ממוקדות כדי להפעיל כוחות על תאים.
מטרת המחקר
- להדגים את היישום של פינצטת לייזר במניפולציה של נוירונים.
- להמחיש את המכניקה של לכידה אופטית בהקשר ביולוגי.
- לספק תובנות לגבי השימושים הפוטנציאליים של טכנולוגיה זו במחקרים במדעי העצבים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בפינצטה לייזר למניפולציה של נוירונים בתרבית.
- תצפית על האינטראקציה בין אור הלייזר לתאים נוירונליים.
- שימוש במיקרוסקופ למיקוד קרן הלייזר.
- הדגמה של תנועת נוירונים לעבר מרכז המיקוד.
תוצאות עיקריות
- לכידה והזזה מוצלחות של נוירונים באמצעות פינצטה לייזר.
- ייצוג חזותי של נתיב קרן הלייזר דרך האופטיקה של המיקרוסקופ.
- הדגמה של הכוחות הפועלים על תאים עקב שבירת לייזר.
- המחשה של יעילותם של מלכודות אופטיות במחקר ביולוגי.
מסקנות
- פינצטות לייזר יעילות למניפולציה של נוירונים in vitro.
- טכניקה זו יכולה להעמיק את הבנתנו לגבי התנהגות נוירונלית.
- יישומים נוספים של פינצטות לייזר עשויים לקדם את המחקר במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פינצטות לייזר מאפשרות מניפולציה מדויקת וללא מגע של נוירונים בודדים in vitro, ובכך תומכות במחקרים מכניסטיים של קישוריות סינפטית וצמיחת נוריטים. יכולת זו משפרת את תיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות לבדיקה מבוקרת של אינטראקציות בין תאים בסביבה סטרילית וניתנת לצפייה. השיטה מספקת בקרה מרחבית כמותית המועילה להפחתת סיכונים בהשערות בשלבי הגילוי המוקדמים של מדעי העצבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות בקרה על תכוון נוירטים ובחירת שותפים סינפטיים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות נוירונליות באמצעות תצפית ישירה על התארכות והיצמדות של בליטות.
- ערך ניבויי: מפחית עמימות מכניסטית בבירור נתיבים על ידי בידוד התנהגויות נוירטים התלויות במשתנים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנת זוגות נוירונים סטנדרטיים להערכה עקבית של מולקולות דבקות או רמזי הדרכה.
- ערך תפעולי: מאפשר זריעה ומיקום הניתנים לשחזור על סובסטרטים דביקים או דוחים מוגדרים, לצורך אחידות הבדיקה.
- יכולת הרחבה: מסייע ביצירת קבוצות תאים מוגדרות לקריאות רב-פרמטריות בפורמטים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך במידול רלוונטי למחלה על ידי מתן אפשרות לשחזור מבוקר של מעגלים עצביים ברשתית.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר בדיקה של מולקולות הדרכה או מצעי היצמדות בזוגות נוריטים מבודדים לפני ביצוע מחקרים של רשתות מורכבות.
- ביטחון חיזוי: מספק נתונים ברזולוציה מרחבית כדי לבסס מודלים של מעורבות מטרה בניוון עצבי או בהתחדשות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פינצטות לייזר משתלבות בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי כך שהן מאפשרות מניפולציה מונחית-היפותזה של נוירונים מבודדים לפני סריקת תרכובות או פרופיל פנוטיפי.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבידוד משתנים במערכי בדיקה של צמיחת נוריטים ויצירת סינפסים.
- סריקה: יוצר תצורות עצביות סטנדרטיות לחשיפה עקבית לתרכובות ולקריאת תוצאות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידות מורפומטריות ומדידות מבוססות פלואורסצנציה מדויקות במרחקים בין-תאיים מוגדרים.
- מחקר תרגומי: מקשר למודלים פרה-קליניים באמצעות שחזור מבוקר של דפוסי סמיכות של תאי רשתית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה לשימוש חוזר למניפולציה של נוריטים במספר קמפיינים של תיקוף מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במנגנוני מטרה על ידי הפחתת רעשים הנובעים מאינטראקציות תאיות בלתי מבוקרות.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות ייצור סטנדרטי של צלחונות ומיקום מבוקר בלייזר.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת ראיות ישירות להתנהגויות נוריטים המתווכות על ידי המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון, המבוסס על פנוטיפים מאומתים של אינטראקציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בלכידה אופטית, תרביות נוירונים וטכניקות מיקרו-כירורגיות סטריליות.
- תלוי בתחנת עבודה של פינצטות לייזר, מיקרוסקופ הפוך וכלים להכנת צלחות תרבית.
- מחייב סטנדרטיזציה של דפוסי התשתית (למשל, Sal-1 לעומת poly-HEMA) בין צוותים לצורך השוואת נתונים.
- התאמה לסוגי נוירונים אחרים מחייבת תיקוף של תאימות ההיצמדות ויעילות הלכידה.
- מוגבל בקיבולת עבור סריקות בקנה מידה רחב, אך מתאים למעקב מכניסטי ותיקוף של תוצאות (hits).
