Name: לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: חקור ביוגנזה של ממברנה באמצעות שיטת Luciferase מבוססת גן כתב. מדידת ביטוי גנים בתאי HEK293 לאחר פגוציטוזה של חרוזי לטקס מספקת מודל מעולה לחקר סינתזת ליפידים ותפקוד תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תא תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות במלאי של כליה עובריים אנושיים 293 (HEK293) התאים גדלים 10 ס&quot;מ מנות התרבות &quot;בינוני&quot;, המורכב בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת קוקטייל של אנטיביוטיקה (100 יחידות מ&quot;ל של פניצילין 100 מיקרוגרם לכל מ&quot;ל של סולפט סטרפטומיצין) ו -10% העובר בסרום שור (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את התאים לניסוי, המדיום הוא נשאב משם, התאים נשטפים פעמיים עם 5 מ&quot;ל של בופר פוספט תמיסת מלח (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS מוסר אז והוחלפו 0.6 מ&quot;ל של פתרון המכיל טריפסין 0.25%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המנה מודגרות ב 37 ˚ C עבור 2 דקות בערך עד שהתאים החלו לנתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5.5 מ&quot;ל של מדיום נוסף על מנת לנטרל את טריפסין והתאים נספרים עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם מדולל ל 320,000 תאים לכל מ&quot;ל ו לוותר על 0.1 מ&quot;ל לכל גם לתוך צלחת polylysine מצופה-96 גם תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תבשיל לתוך תרבות רקמות החממה ב 37 ˚ C עם אווירה המכיל CO2 8.8% ולגדול במשך 24 שעות. </li></ol> Transfections <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהכנות transfections, זה צריך להיחשב כמה משכפל הם להתבצע לפי תנאי הניסוי ומה הסכומים של הפלסמיד יהיה transfected. אנו שגרתי לבצע את כל התנאים בשלושה עותקים transfect סך של ng 50-100 של ה-DNA פלסמיד לכל טוב. תערובות פלסמיד צריכה לכלול לפחות עיתונאי לבנות להביע גחלילית בלוציפראז ולשלוט פלסמיד המבטא Renilla בלוציפראז מן מקדם מכוננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות פלסמיד הם pipetted לתוך 1.5-מ&quot;ל צינורות microcentrifuge שיושלם עם μl 10 לדגימה של DMEM סרום נטול אנטיביוטיקה בחינם. לדוגמה, אם 20 בארות הם כל להיות transfected עם DNA 50 מיקרוגרם, להוסיף 200 DMEM μl ל-DNA 1 מיקרוגרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי פתרון DMEM / הדנ&quot;א להוסיף 3 μl &#39;293 Transit מגיב &quot;(Mirus) לכל DNA מיקרוגרם. מערבבים על ידי pipetting למעלה &amp; למטה ולתת דגימות לעמוד בטמפרטורת החדר למשך לפחות 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, הסר את המדיה מהצלחת-96 גם תרבות ולהחליף μl 90 א בינוני טרי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף גם כל 10 μl של התערובת 293 DMEM / DNA / המעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תבשיל לתוך תרבות רקמות החממה ב 37 ˚ C עם אווירה המכיל CO2 8.8% ולגדול במשך 24 שעות. </li></ol> Phagocytosis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיות המכיל B בינוני (תערובת של 01:01 DMEM ו F12 של חם בינוני פלוס אנטיביוטיקה FBS 10%) בתוספת 0.75-מיקרומטר חרוזים לטקס בבית מ&quot;ג אפס 1 לכל מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהצלחת-96 גם בתרבות להחליף עם 0.1 מ&quot;ל של המתלים חרוז ב בינוני </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין את הצלחת 2 דקות ב 1000 x ז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים בתרבית אז 37 ˚ C במשך 6 עד 16 שעות. בהתאם לתנאי לבין האמרגן להשתמש בכונן בלוציפראז, ביטוי מוגבר גן הכתב ניתן להבחין לאחר 1-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרים אותו זה עשוי להיות נחוץ כדי לדגור התאים עם חרוזים למשך 30 דקות עד 60, ואז לעשות 2 שוטף עם PBS להסיר חרוזים מאוגדים, ולהוסיף התקשורת טרי לפני דוגרים התאים לתקופות נוספות של זמן. </li></ol> Dual-GloTM בלוציפראז Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: פרוטוקול שלנו באמצעות ערכת שונה במובנים מסוימים מזה המומלץ על ידי היצרן. זה כבר שונה כדי להפחית את כמות ריאגנטים הנדרש לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה של 1 M DTT, מתחלקים aliquots קטנים מרובים חנות ב -20 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ תמוגה המכיל 20 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.8), 10% (v / v) גליצרול, ו -0.5% (v / v) טריטון X-100. לפני השימוש, aliquot הסכום הדרוש לצורך הניסוי ולהוסיף 1 מ&quot;ל לכל μl של 1 M DTT פלוס מעכבי פרוטאז קוקטייל לריכוז סופי של 0.5 ל 1x. אין לעשות שימוש חוזר פתרון DTT שאריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת השימוש בערכה כפולה GloTM בפעם הראשונה, להכין את מגיב (גחלילית) בלוציפראז ידי העברת כל תכולת הבקבוק אחד הצפת Dual-GloTM בלוציפראז (מסופק עם הערכה) על בקבוק אחד של המצע Dual-GloTM בלוציפראז (בתנאי עם הערכה). מחלקים את מגיב בלוציפראז בשימוש לתוך 10 מ&quot;ל aliquots ולאחסן ב -20 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת 96-היטב את התרבות רקמות חממה ולמקם אותו על הקרח. הסר את התקשורת על ידי שאיפה, הוסף 40 μl לכל היטב חיץ תמוגה ולאחר מכן לעזוב את הצלחת על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב לבן, אטום 96-היטב צלחת (OptiplateTM-96, פרקין אלמר מספר קטלוג 6005290) aliquot 15 μl לכל מגיב היטב בלוציפראז, ולאחר מכן להוסיף 15 μl של lysate התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולאחר מכן קרא את הארה בקורא microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני השימוש, להכין כמות מתאימה של תמיסת המצע Renilla בלוציפראז ידי הוספת 1 חלק Dual-GloTM Stop &amp; Glo ®; מגיב (מסופק עם הערכה) עד 100 חלקים Dual-GloTM Stop &amp; Glo ® חוצץ (מסופק עם הערכה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף גם כל 15 μl של פתרון טוב לכל המצע Renilla בלוציפראז, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולאחר מכן למדוד את הארה שוב. </li></ol>

למחברים אין הצהרות לגבי ניגודי עניינים.

לימוד biogenesis ממברנה עם assay בלוציפראז מבוסס gene כתב

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

כדי לחקור את התיאום של מסלולים שונים סינתזה השומנים במהלך biogenesis קרום כדאי לעבוד עם מערכת ניסיונית שבה biogenesis הממברנה מתרחשת במהירות ובאופן ועין מתנהלת. מצאנו כי phagocytosis חרוזים לטקס היא מעשית למטרות אלה כמו תאים במהירות לסנתז שומנים קרום לחדש בריכות קרום לאיבוד כמו גלישת החומר במהלך היבלעות החלקיקים. כאן אנו מתארים נהלים לחקר שינויים בביטוי גנים phagocytosis המושרה עם גישה בלוציפראז מבוסס כתב הגן באמצעות מערכת Dual-Glo Assay בלוציפראז מ Promega.

כאן אנו מתארים נהלים לחקר שינויים בביטוי גנים phagocytosis המושרה עם גישה בלוציפראז מבוסס כתב הגן באמצעות מערכת כפולה GloTM Assay בלוציפראז מ Promega.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

כדי לחקור את התיאום בין מסלולי סינתזה שונים של ליפידים במהלך ביוגנזה של ממברנה, מועיל לעבוד עם מערכת ניסויית שבה ממברנה...

שלום, אני IL OV ולמדתי את התיאום של מסלולי סינתזה שונים של ליפידים לצורך זיכרון וביוגנזה. מועיל להשתמש במערכת ניסיונית שבה ביוגנזה של ממברנות מתרחשת במהירות וניתן להשראתה. מצאנו שפגוציטוזה של חלקיקי לטקס היא שימושית במיוחד למחקרים מעין אלה, כיוון שהתאים מסנתזים במהירות ממברנות חדשות כדי להשלים את אלו שאבדו כחומר עטיפה בשלב מוקדם של תהליך הבליעה.בסרטון זה, עמיתי Ong Zang ידגים את הפרוצדורות ששימשו למחקר שינויים בביטוי גנים המושרים על ידי פגוציטוזה, באמצעות גישת בדיקת דוחות (reporter assay) המבוססת על לוקיפראז. שלום, אני X מהמעבדה של exon North במחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת הרווארד. היום אראה לכם כיצד להשתמש בבדיקת גן דוח כדי לנתח את הבקרה של גנים המעורבים בביוגנזה של ממברנות לאחר פגוציטוזה. בואו נתחיל.עבור הליך זה, אנו משתמשים בתרביות של תאי כליה עובריים אנושיים 293. תאים אלו גדלים בצלחת תרבית של 10 סנטימטרים במדיום A, המורכב מ-Dulbecco's Modified Eagle Medium או DMEM, מועשר ב-10% fetal bovine serum או FBS ובשילוב של אנטיביוטיקה. באמצעות טכניקת סטנדרטיזציה, התאים מנתקים מהתחתית של הצלחת, נספרים ולאחר מכן נזרעים בלוחות 96 בארות מצופים בפוליליזין, שם הם גדלים במשך 24 שעות עד לתחילת הטרנספקציה.עבור התעתוק שלנו, אנו מבצעים באופן שגרתי את כל התנאים בשלוש חזרות, ובכל באר מע

studying-membrane-biogenesis-with-luciferase-based-reporter-gene

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

עם העניין הגובר טיפולים בתאי גזע, טכניקות הדמיה מולקולרית הם אידיאליים עבור התנהגות בתאי גזע ניטור לאחר ההשתלה. הגנים כתב בלוציפראז אפשרו פולשני, הערכה חוזרת של הישרדות התא, מיקום התפשטות in vivo. וידאו זה יהיה להדגים כיצד לעקוב אחר התפשטות hESC בעכבר חי.

במבחנה פליטת אור הדמיה vivo ג&#39;ין הכתב של בתאי גזע עובריים אנושיים

שעוני יממה לתפקד בתוך תאים בודדים, כלומר, הם תאים אוטונומיים. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת מודלי שעון תא אוטונומי באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית, לוציפראז מבוסס זמן אמת פליטת אור. תאי Reporter מספקים מערכות צייתניות, פונקציונליות מודל ללימוד ביולוגית יממה.

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

הסרטון מדגים את בדיקת לוציפראז המשמשת לכימות חלבונים המתויגים בלוציפראז. הבדיקה משתמשת באנזים לוציפראז מהונדס המורכב מקטע גדול שנקשר למקטע הקטן, אשר מצומד עם חלבון מעניין. תת-היחידות הכבולות יוצרות אנזים פעיל שבנוכחות המצע משחרר אות זוהר. אות זה מכומת לאחר מכן באמצעות לומינומטר.

בדיקת לוציפראז: בדיקת תפוקה גבוהה למדידת אותות זוהרים באמצעות ביו-כתבים מבוססי מערכת ננולוציפראז מהונדסים

סרטון זה מדגים את בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון. בבדיקה זו, החלבונים המעניינים מתויגים למקטעים קטנים וגדולים של האנזים לוציפראז. כאשר החלבונים מתקשרים, המקטעים הגדולים והקטנים משתלבים ליצירת קומפלקס אנזימים פעיל, אשר בנוכחות מצע מסוים, משחרר זוהר בהיר שניתן למדוד.

בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות

אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

וזמינותו ביולומינסנציה במבחנה כדי לקבוע סלולארית בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב מוצג. שיטה זו משתמשת בתרבית של תאים כתב פלסמידים לבטא גרם אולי לפגיעה ביציבות לוציפראז תחת השליטה של האמרגן ג'ין תקופה 2 . זה ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים כדי להעריך את ההשפעות איבר ספציפי על שעון ביולוגי.

במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב

לוציפראז מקודדים גנטית הוא עיתונאי לא פולשנית הפופולרי של ביטוי גנים. שימוש לוציפראז האורך אוטומטית הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין) מאפשר הקלטה אורכית מתאי זוהרים תחת מגוון רחב של מצבים. הנה אנחנו מראים איך תנין עשוי לשמש בהקשר של מחקר השעון הביולוגי.

גמיש מדידה של כתבים זוהרים באמצעות לוציפראז האורך אוטומטית של הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין)

תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

מקצבים צירקדיים, הקיימים ברוב האורגניזמים, מווסתים את הארגון הזמני של תהליכים ביולוגיים. אורגנואידים תלת-ממדיים התגלו לאחרונה כמודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה . פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכתבים ביולומינסנטיים כדי לצפות במקצבים צירקדיים באורגנואידים, ומאפשר חקירות חוץ גופיות של מקצבים צירקדיים במערכות רב-תאיות.

ניטור תנודות צירקדיות עם כתב ביולומינסנציה באורגנואידים

חקור ביוגנזה של ממברנה באמצעות שיטת Luciferase מבוססת גן כתב. מדידת ביטוי גנים בתאי HEK293 לאחר פגוציטוזה של חרוזי לטקס מספקת מודל מעולה לחקר סינתזת ליפידים ותפקוד תאי.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

גלה סרטונים נוספים