Name: לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: חקור ביוגנזה של ממברנה באמצעות שיטת Luciferase מבוססת גן כתב. מדידת ביטוי גנים בתאי HEK293 לאחר פגוציטוזה של חרוזי לטקס מספקת מודל מעולה לחקר סינתזת ליפידים ותפקוד תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תא תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות במלאי של כליה עובריים אנושיים 293 (HEK293) התאים גדלים 10 ס&quot;מ מנות התרבות &quot;בינוני&quot;, המורכב בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת קוקטייל של אנטיביוטיקה (100 יחידות מ&quot;ל של פניצילין 100 מיקרוגרם לכל מ&quot;ל של סולפט סטרפטומיצין) ו -10% העובר בסרום שור (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את התאים לניסוי, המדיום הוא נשאב משם, התאים נשטפים פעמיים עם 5 מ&quot;ל של בופר פוספט תמיסת מלח (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS מוסר אז והוחלפו 0.6 מ&quot;ל של פתרון המכיל טריפסין 0.25%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המנה מודגרות ב 37 ˚ C עבור 2 דקות בערך עד שהתאים החלו לנתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5.5 מ&quot;ל של מדיום נוסף על מנת לנטרל את טריפסין והתאים נספרים עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם מדולל ל 320,000 תאים לכל מ&quot;ל ו לוותר על 0.1 מ&quot;ל לכל גם לתוך צלחת polylysine מצופה-96 גם תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תבשיל לתוך תרבות רקמות החממה ב 37 ˚ C עם אווירה המכיל CO2 8.8% ולגדול במשך 24 שעות. </li></ol> Transfections <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהכנות transfections, זה צריך להיחשב כמה משכפל הם להתבצע לפי תנאי הניסוי ומה הסכומים של הפלסמיד יהיה transfected. אנו שגרתי לבצע את כל התנאים בשלושה עותקים transfect סך של ng 50-100 של ה-DNA פלסמיד לכל טוב. תערובות פלסמיד צריכה לכלול לפחות עיתונאי לבנות להביע גחלילית בלוציפראז ולשלוט פלסמיד המבטא Renilla בלוציפראז מן מקדם מכוננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות פלסמיד הם pipetted לתוך 1.5-מ&quot;ל צינורות microcentrifuge שיושלם עם μl 10 לדגימה של DMEM סרום נטול אנטיביוטיקה בחינם. לדוגמה, אם 20 בארות הם כל להיות transfected עם DNA 50 מיקרוגרם, להוסיף 200 DMEM μl ל-DNA 1 מיקרוגרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי פתרון DMEM / הדנ&quot;א להוסיף 3 μl &#39;293 Transit מגיב &quot;(Mirus) לכל DNA מיקרוגרם. מערבבים על ידי pipetting למעלה &amp; למטה ולתת דגימות לעמוד בטמפרטורת החדר למשך לפחות 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, הסר את המדיה מהצלחת-96 גם תרבות ולהחליף μl 90 א בינוני טרי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף גם כל 10 μl של התערובת 293 DMEM / DNA / המעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תבשיל לתוך תרבות רקמות החממה ב 37 ˚ C עם אווירה המכיל CO2 8.8% ולגדול במשך 24 שעות. </li></ol> Phagocytosis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיות המכיל B בינוני (תערובת של 01:01 DMEM ו F12 של חם בינוני פלוס אנטיביוטיקה FBS 10%) בתוספת 0.75-מיקרומטר חרוזים לטקס בבית מ&quot;ג אפס 1 לכל מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהצלחת-96 גם בתרבות להחליף עם 0.1 מ&quot;ל של המתלים חרוז ב בינוני </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין את הצלחת 2 דקות ב 1000 x ז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים בתרבית אז 37 ˚ C במשך 6 עד 16 שעות. בהתאם לתנאי לבין האמרגן להשתמש בכונן בלוציפראז, ביטוי מוגבר גן הכתב ניתן להבחין לאחר 1-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרים אותו זה עשוי להיות נחוץ כדי לדגור התאים עם חרוזים למשך 30 דקות עד 60, ואז לעשות 2 שוטף עם PBS להסיר חרוזים מאוגדים, ולהוסיף התקשורת טרי לפני דוגרים התאים לתקופות נוספות של זמן. </li></ol> Dual-GloTM בלוציפראז Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: פרוטוקול שלנו באמצעות ערכת שונה במובנים מסוימים מזה המומלץ על ידי היצרן. זה כבר שונה כדי להפחית את כמות ריאגנטים הנדרש לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה של 1 M DTT, מתחלקים aliquots קטנים מרובים חנות ב -20 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ תמוגה המכיל 20 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.8), 10% (v / v) גליצרול, ו -0.5% (v / v) טריטון X-100. לפני השימוש, aliquot הסכום הדרוש לצורך הניסוי ולהוסיף 1 מ&quot;ל לכל μl של 1 M DTT פלוס מעכבי פרוטאז קוקטייל לריכוז סופי של 0.5 ל 1x. אין לעשות שימוש חוזר פתרון DTT שאריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת השימוש בערכה כפולה GloTM בפעם הראשונה, להכין את מגיב (גחלילית) בלוציפראז ידי העברת כל תכולת הבקבוק אחד הצפת Dual-GloTM בלוציפראז (מסופק עם הערכה) על בקבוק אחד של המצע Dual-GloTM בלוציפראז (בתנאי עם הערכה). מחלקים את מגיב בלוציפראז בשימוש לתוך 10 מ&quot;ל aliquots ולאחסן ב -20 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת 96-היטב את התרבות רקמות חממה ולמקם אותו על הקרח. הסר את התקשורת על ידי שאיפה, הוסף 40 μl לכל היטב חיץ תמוגה ולאחר מכן לעזוב את הצלחת על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב לבן, אטום 96-היטב צלחת (OptiplateTM-96, פרקין אלמר מספר קטלוג 6005290) aliquot 15 μl לכל מגיב היטב בלוציפראז, ולאחר מכן להוסיף 15 μl של lysate התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולאחר מכן קרא את הארה בקורא microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני השימוש, להכין כמות מתאימה של תמיסת המצע Renilla בלוציפראז ידי הוספת 1 חלק Dual-GloTM Stop &amp; Glo ®; מגיב (מסופק עם הערכה) עד 100 חלקים Dual-GloTM Stop &amp; Glo ® חוצץ (מסופק עם הערכה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף גם כל 15 μl של פתרון טוב לכל המצע Renilla בלוציפראז, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולאחר מכן למדוד את הארה שוב. </li></ol>

למחברים אין הצהרות לגבי ניגודי עניינים.

לימוד biogenesis ממברנה עם assay בלוציפראז מבוסס gene כתב

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

כדי לחקור את התיאום של מסלולים שונים סינתזה השומנים במהלך biogenesis קרום כדאי לעבוד עם מערכת ניסיונית שבה biogenesis הממברנה מתרחשת במהירות ובאופן ועין מתנהלת. מצאנו כי phagocytosis חרוזים לטקס היא מעשית למטרות אלה כמו תאים במהירות לסנתז שומנים קרום לחדש בריכות קרום לאיבוד כמו גלישת החומר במהלך היבלעות החלקיקים. כאן אנו מתארים נהלים לחקר שינויים בביטוי גנים phagocytosis המושרה עם גישה בלוציפראז מבוסס כתב הגן באמצעות מערכת Dual-Glo Assay בלוציפראז מ Promega.

כאן אנו מתארים נהלים לחקר שינויים בביטוי גנים phagocytosis המושרה עם גישה בלוציפראז מבוסס כתב הגן באמצעות מערכת כפולה GloTM Assay בלוציפראז מ Promega.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

כדי לחקור את התיאום בין מסלולי סינתזה שונים של ליפידים במהלך ביוגנזה של ממברנה, מועיל לעבוד עם מערכת ניסויית שבה ממברנה...

שלום, אני IL OV ולמדתי את התיאום של מסלולי סינתזה שונים של ליפידים לצורך זיכרון וביוגנזה. מועיל להשתמש במערכת ניסיונית שבה ביוגנזה של ממברנות מתרחשת במהירות וניתן להשראתה. מצאנו שפגוציטוזה של חלקיקי לטקס היא שימושית במיוחד למחקרים מעין אלה, כיוון שהתאים מסנתזים במהירות ממברנות חדשות כדי להשלים את אלו שאבדו כחומר עטיפה בשלב מוקדם של תהליך הבליעה.בסרטון זה, עמיתי Ong Zang ידגים את הפרוצדורות ששימשו למחקר שינויים בביטוי גנים המושרים על ידי פגוציטוזה, באמצעות גישת בדיקת דוחות (reporter assay) המבוססת על לוקיפראז. שלום, אני X מהמעבדה של exon North במחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת הרווארד. היום אראה לכם כיצד להשתמש בבדיקת גן דוח כדי לנתח את הבקרה של גנים המעורבים בביוגנזה של ממברנות לאחר פגוציטוזה. בואו נתחיל.עבור הליך זה, אנו משתמשים בתרביות של תאי כליה עובריים אנושיים 293. תאים אלו גדלים בצלחת תרבית של 10 סנטימטרים במדיום A, המורכב מ-Dulbecco's Modified Eagle Medium או DMEM, מועשר ב-10% fetal bovine serum או FBS ובשילוב של אנטיביוטיקה. באמצעות טכניקת סטנדרטיזציה, התאים מנתקים מהתחתית של הצלחת, נספרים ולאחר מכן נזרעים בלוחות 96 בארות מצופים בפוליליזין, שם הם גדלים במשך 24 שעות עד לתחילת הטרנספקציה.עבור התעתוק שלנו, אנו מבצעים באופן שגרתי את כל התנאים בשלוש חזרות, ובכל באר מעבירים סך של 50 עד 100 nanogram של plasmid DNA. תערובות הפלסמידים צריכות לכלול לפחות את מבנה הדגימה (reporter construct) המבטא firefly luciferase ואת הפלסמיד הבקרה המבטא renal luciferase מתוך פרומוטור קונסטיטוטיבי. ראשית, הכינו תערובת של serum-free DMEM עם אנטיביוטיקה וריאגנט transfection מסוג trans2N3; השתמשו ב-10 µL של DMEM עבור כל באר המיועדת לתעתוק, והוסיפו 3 µL של ריאגנט trans2N3 לכל microgram של plasmid DNA.לדוגמה, אם יש להעביר טרנספקציה ל-20 בארות, בכל אחת מהן 50 nanogram של DNA עם 3 µL של ריאגנט trans 2 9 3 בתוך 200 µL של DM EM. את התמיסה מערבבים על ידי שאיבה והזרקה חוזרת (pipetting) ולאחר מכן מניחים לה להישאר ללא הפרעה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן, מעבירים את ה-DNA למבחנות מיקרו-צנטריפוגה נפרדות. הריכוזים של תמיסות המלאי (stock solutions) שלנו הם בדרך כלל בין 10 ל-100 nanogram ל-µL.לאחר שמרקוב התערובת DM M דגרה במשך חמש דקות, מעבירים אותה לנבובת ה-DNA ומערבבים שוב את התמיסה באמצעות פיפטינג. לאחר מכן, משאירים את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. במהלך דגירה זו של 20 דקות, מסירים את המצע מלוח תרביות ה-96 ובמקומו מוסיפים 19 µL של מצע A טרי. עם השלמת הדגירה, מעבירים 10 µL מתערובת ה-D-M-M-D-N-A לכל באר.יש להעביר את התערובת באמצעות פיפט ישירות אל הנוזל הקיים. אין לאפשר לקצה הפיפטה לגעת בדופן המבחנה. כמו כן, חשוב לכלול שלוש בארות תאים שיושאירו ללא טיפול לצורך בדיקה.את פעילות הלוקיפראז הממוצעת בבארים אלו נחסיר מאוחר יותר כערך רקע. הכניסו את פלטת 96 הבארים למדגרה בטמפרטורה של 37 °C וגדלו את התאים למשך 24 שעות. עם השלמת הדגירה של 24 השעות, נמשיך להשראה של ביוסינתזה של ממברנה, ביוסינתזה של חרוזי lax. כדי להתחיל, הכינו תרחיף המכיל מצע גידול לתאים וחרוזי lax.כדי לעשות זאת, הכינו את מצע B, שהוא תערובת ביחס של אחד לאחד של DMEM ושל מצע F המכיל אנטיביוטיקה ו-10% FBS. לאחר מכן, הוסיפו חרוזי latex בגודל 0.75 מיקרון בריכוזים של עד 1 mg/mL. כמובן, כל ניסוי צריך לכלול בקרות שבהן לא נוספו חרוזים.לאחר מכן, הסירו את המצע מלוח התרבית בעל 96 הבארות והחליפו בכל בארה ב-100 µL של תרחיף החרוזיים. לאחר הוספת התרחיף, סובבו את הלוח במשך שתי דקות במהירות של 1000 G. פעולה זו מסייעת בריכוז החרוזיים בתחתית הבארה ומקלה על הפגוציטוזה. לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שש עד 16 שעות.בהתאם לתנאים ולפרומוטור המשמש להגברת ביטוי הגן של הלוציפראז, ניתן לזהות את ביטוי הגן לאחר שעה אחת עד שלוש שעות. בניסויים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להפריד את ה-fal מסנתז השומנים, למשל, כדי לבחון את השפעתם של תרופות מסוימות על סינתזת השומנים מבלי להשפיע על התהליך התמידי. במקרים אלו, דגרו את התאים עם החרוזים למשך 30 עד 60 דקות כדי לאפשר לתאים לבלוע את החרוזים.לאחר דגירה זו, שוטפים את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר חרוזיים שאינם קשורים. לאחר מכן מוסיפים מצע גידול טרי ומדגירים את התאים למשך שש עד 16 שעות לצורך ביטוי הגן המדווח. כעת אנו מוכנים להמשיך למדידות.כדי להתחיל את בדיקות ה-Lucifer, הכינו באפר xis המכיל 20 מיליון מולאר trees, HCL pH H 7.8, 10% נפח לנפח glycerol ו-0.5% נפח לנפח triton X 100 לפני השימוש, בכמות מספקת הדרושה לניסוי. לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד לכל מיליליטר של DTT בריכוז של מולאר אחד. אין להשתמש שוב בתמיסת DTT שנותרה.לאחר מכן, הוסיפו תערובת מעכבי פרוטאז (protease inhibitor cocktail) לריכוז סופי של 0.5 עד 1X. בעת שימוש בערכת ה-dual glow בפעם הראשונה, הכינו את ריאגנט ה-firefly lucifers על ידי העברת כל התוכן של בקבוק אחד של dual glow lucifers buffer לבקבוק אחד של dual glow luciferase substrate. חלקו את ריאגנט הלוסיפראז שאינו בשימוש למקבצים של 10 µL ואחסנו בטמפרטורה של 20°C-. לאחר שהריאגנט של הלוסיפראז מוכן, הוציאו את פלטת 96 הבארים מאינקובטור תרביות הרקמה והניחו אותה על קרח. לאחר מכן, הסירו את המצע באמצעות שאיבה, הוסיפו 40 µL של באפר ליזיס (lysis buffer) לכל באר והשאירו את הפלטה על קרח למשך 30 דקות.בשלב הבא, הוסף 15 µL של ריאגנט לוסיפרלז (Lucifer reagent) לכל באער. בלוח 96 באערים לבן ואטום, השתמשנו בלוח Perkin S optive plate 96. לאחר מכן, הוסף 15 µL של תסלול תאים (cell lysate) והדגה את הלוח בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.לאחר 10 דקות, קרא את הלומינסנציה (luminescence) במקורא מיקרופלייטים. לאחר מכן, בצע את בדיקת הלוסיפראז (luciferase assay) כדי לקבל נתונים עבור הפלסמיד של הביקורת. לשם כך, הכן מיד לפני השימוש כמות מתאימה של תמיסת סובסטרט לוסיפראז על ידי הוספת חלק אחד של ריאגנט Dual-Glo Stop & Glo ל-100 חלקים.תמיסת Dual glow, stop and glow buffer. לאחר מכן, הוסף 15 µL של תמיסת סובסטרט לכל באר. הדגר את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולאחר מכן מדוד שוב את הלומנסנס.שימו לב כי שינינו את הפרוטוקול המומלץ של היצרן עבור בדיקות dual glow ferous אלו. כדי להפחית את כמות הרכיבים הדרושה לדגימה, ניתן כעת לנתח את הפלטה שוב באמצעות קורא פלטות. לאחר איסוף הנתונים באמצעות קורא המיקרו-פלטות, ניתן להעבירם לתוכנת גיליונות נתונים כגון Microsoft Excel לצורך ניתוח נוסף.ראשית, חשבו את הממוצע משלוש הבארות שלא עברו רזקציה והפחיתו ערך זה מכל אחת מנקודות הנתונים. לאחר מכן, חלקו עבור כל בארה שעברה טרנספקציה את הערך עבור firefly luciferase. בצעו זאת עבור luciferase, ולאחר מכן, עבור כל סט של דגימות בשלוש חזרות, חשבו את הממוצע, את הסטייה ואת מקדם השונות.בדוגמה שלנו, השתמשנו בריכוזים השונים של חרוזיים ששורטטו על ציר ה-x מול היחס בין פעילות ה-firefly ל-vanilla lucifere. כפי שניתן לראות, קיימת עלייה תלוית-מינון ביחס זה. כעת הצגנו בפניכם כיצד להשתמש במערך גנים המבוסס על לוסיפראז כדי למדוד ביטוי מפרומוטור של קולטן LDL כמענה לפגוציטוזה של חרוזי לטקס.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא שהתאים נמצאים ברמת התמזגות (confluency) של 80% עד 90% בלבד במועד התעתוק. וזהו. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

studying-membrane-biogenesis-with-luciferase-based-reporter-gene

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

עם העניין הגובר טיפולים בתאי גזע, טכניקות הדמיה מולקולרית הם אידיאליים עבור התנהגות בתאי גזע ניטור לאחר ההשתלה. הגנים כתב בלוציפראז אפשרו פולשני, הערכה חוזרת של הישרדות התא, מיקום התפשטות in vivo. וידאו זה יהיה להדגים כיצד לעקוב אחר התפשטות hESC בעכבר חי.

במבחנה פליטת אור הדמיה vivo ג&#39;ין הכתב של בתאי גזע עובריים אנושיים

שעוני יממה לתפקד בתוך תאים בודדים, כלומר, הם תאים אוטונומיים. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת מודלי שעון תא אוטונומי באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית, לוציפראז מבוסס זמן אמת פליטת אור. תאי Reporter מספקים מערכות צייתניות, פונקציונליות מודל ללימוד ביולוגית יממה.

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

הסרטון מדגים את בדיקת לוציפראז המשמשת לכימות חלבונים המתויגים בלוציפראז. הבדיקה משתמשת באנזים לוציפראז מהונדס המורכב מקטע גדול שנקשר למקטע הקטן, אשר מצומד עם חלבון מעניין. תת-היחידות הכבולות יוצרות אנזים פעיל שבנוכחות המצע משחרר אות זוהר. אות זה מכומת לאחר מכן באמצעות לומינומטר.

בדיקת לוציפראז: בדיקת תפוקה גבוהה למדידת אותות זוהרים באמצעות ביו-כתבים מבוססי מערכת ננולוציפראז מהונדסים

סרטון זה מדגים את בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון. בבדיקה זו, החלבונים המעניינים מתויגים למקטעים קטנים וגדולים של האנזים לוציפראז. כאשר החלבונים מתקשרים, המקטעים הגדולים והקטנים משתלבים ליצירת קומפלקס אנזימים פעיל, אשר בנוכחות מצע מסוים, משחרר זוהר בהיר שניתן למדוד.

בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות

אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

וזמינותו ביולומינסנציה במבחנה כדי לקבוע סלולארית בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב מוצג. שיטה זו משתמשת בתרבית של תאים כתב פלסמידים לבטא גרם אולי לפגיעה ביציבות לוציפראז תחת השליטה של האמרגן ג'ין תקופה 2 . זה ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים כדי להעריך את ההשפעות איבר ספציפי על שעון ביולוגי.

במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב

לוציפראז מקודדים גנטית הוא עיתונאי לא פולשנית הפופולרי של ביטוי גנים. שימוש לוציפראז האורך אוטומטית הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין) מאפשר הקלטה אורכית מתאי זוהרים תחת מגוון רחב של מצבים. הנה אנחנו מראים איך תנין עשוי לשמש בהקשר של מחקר השעון הביולוגי.

גמיש מדידה של כתבים זוהרים באמצעות לוציפראז האורך אוטומטית של הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין)

תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

מקצבים צירקדיים, הקיימים ברוב האורגניזמים, מווסתים את הארגון הזמני של תהליכים ביולוגיים. אורגנואידים תלת-ממדיים התגלו לאחרונה כמודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה . פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכתבים ביולומינסנטיים כדי לצפות במקצבים צירקדיים באורגנואידים, ומאפשר חקירות חוץ גופיות של מקצבים צירקדיים במערכות רב-תאיות.

ניטור תנודות צירקדיות עם כתב ביולומינסנציה באורגנואידים

חקור ביוגנזה של ממברנה באמצעות שיטת Luciferase מבוססת גן כתב. מדידת ביטוי גנים בתאי HEK293 לאחר פגוציטוזה של חרוזי לטקס מספקת מודל מעולה לחקר סינתזת ליפידים ותפקוד תאי.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

גלה סרטונים נוספים