לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

שלום, אני IL OV כדי לחקור את הקואורדינציה של מסלולי סינתזת שומנים שונים לזכור וביוגנזה. זה שימושי שתהיה מערכת ניסיונית שבה ביוגנזה של ממברנה מתרחשת במהירות ומעוררת. מצאנו שפגוציטוזיס של פעימות לטקס שימושי במיוחד למחקרים כאלה מכיוון שהתאים מסנתזים מהר מאוד ממברנות חדשות כדי לחדש את אלה שאבדו כחומר עוטף מוקדם במהלך תהליך הבליעה.

בסרטון זה, עמיתי אונג זאנג ידגים נהלים ששימשו לחקר שינויים הנגרמים על ידי פגוציטוזיס בביטוי גנים באמצעות גישת בדיקת דיווח מבוססת לוציפראז שבה, היי, אני X מהמינוף של אקסון צפון במחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת הרווארד. היום אראה לך כיצד להשתמש בבדיקת גנים לדיווח כדי לנתח את ויסות הגנים המעורבים בביוגנזה של הממברנה לאחר פגוציטוזיס. אז בואו נתחיל.

לצורך הליך זה, אנו משתמשים בתרביות של כליה עוברית אנושית 2 93 תאים. תאים אלה גדלים בצלחת תרבית של 10 סנטימטר במדיום A, המורכב מהחבילות שעברו שינוי נשרים אגוס מדיום או DMM בתוספת סרום B עוברי 10% או FBS וקוקטייל של אנטיביוטיקה. באמצעות טכניקת סטנדרטיזציה, התאים מנותקים מתחתית הצלחת, מתנגדים ולאחר מכן מצופים על צלחות 96 בארות מצופות פוליליזין שם הם גדלים במשך 24 שעות עד לתחילת העסקאות.

עבור הטרנספקט שלנו, אנו מבצעים באופן שגרתי את כל התנאים בטריפליקט ובטרנספקט, בסך הכל 50 עד 100 וננוגרם של DNA פלסמיד לבאר. תערובות משובצות צריכות לכלול לפחות את מבנה המדווח המבטא לוציפראז גחלילית ואת פלסמיד הבקרה המבטא לוציפרים כלייתיים ממקדם מכונן. כדי להתחיל, הכינו תערובת של מסגרת סרום ומסגרת אנטיביוטית DM EM עם מגיב טרנס שניים N שלושה טרנספקציה השתמש ב-10 מיקרוליטר של DMM עבור כל באר להעברה ובשלושה מיקרוליטר של מגיב טרנס 2 9 3 לכל מיקרוגרם של DNA פלסמיד.

לדוגמה, אם 20 בארות מכל אחת מהן יועברו עם 50 ננוגרם DNA בשלושה מיקרוליטר של טרנס 2 9 3 מגיב ל -200 מיקרוליטר של DM EM. התמיסה מעורבבת על ידי פיפטינג חוזר ונשנה למעלה ולמטה ואז נשארת ללא הפרעה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן, הדנ"א הוא צינור לצינורות מיקרו צנטריפוגות נפרדים. הריכוזים של תמיסות הפלוס-מטר שלנו הם בדרך כלל בין 10 ל-100 ננוגרם למיקרוליטר.

לאחר שתערובת המעבר DM M דגרה במשך חמש דקות, היא מועברת לצינור ה-DNA והתמיסה מעורבבת שוב על ידי פיפטינג. לאחר מכן נותן לדגימות לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. במהלך האינטובציה של 20 דקות, הסר את המדיה מצלחת תרבית הרשת 96 והחלף אותה ב-19 מיקרוליטר של מדיום טרי A לאחר השלמת הדגירה ב-10 מיקרוליטר של ה-D-M-M-D-N-A תרגום לשלוש תערובת לכל באר.

יש להזרים את התערובת ישירות לנוזל הקיים. אל תתנו לקצה הפיפטה לגעת בדופן הצינור. חשוב גם לכלול שלוש בארות של תאים שיישארו ללא בדיקה.

פעילות הלוציפראז הממוצעת בבארות אלה תופחת מאוחר יותר כאשר הרקע מניח את צלחת 96 הבאר לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס ומגדל את התאים במשך 24 שעות. לאחר השלמת הדגירה של 24 שעות, אנו ממשיכים בהשראת ביוסינתזה של ממברנה, ביוזה של חרוזים רפויים. כדי להתחיל, הכינו תרחיף המכיל מדיום תרבית תאים וחרוז רפוי.

לשם כך, הכינו מדיום B, שהוא תערובת תערובת אחד לאחד של DM EM וקנבוס, F טווח בינוני בתוספת אנטיביוטיקה ו-10% FBS. ואז בחרוזים רפויים של 0.75 מיקרון בריכוזים של עד מיליגרם אחד למיליליטר. כמובן, כל ניסוי צריך לכלול פקדים שבהם לא מוסיפים חרוזים.

לאחר מכן, הסר את המדיה מצלחת תרבית 96 הבאר והחלף כל באר ב-100 מיקרוליטר של מתלה החרוזים. לאחר הוספת המתלה, סובב את הצלחת למשך שתי דקות בחום של 1000 גרם.זה עוזר לרכז את החרוז בתחתית הבאר ומקל על פגוציטוזיס. לאחר מכן, לכוד את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שש עד 16 שעות.

בהתאם לתנאים ולמקדם המשמש להנעת עליית לוציפראז, ניתן לזהות את ביטוי הגן המקדם לאחר שעה עד שלוש שעות. עבור ניסויים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך לנתק את הפאל מסינתזת השומנים, למשל, כדי לחקור את ההשפעות של תרופות מסוימות על סינתזת השומנים מבלי להשפיע על החלקיקים בממשלה. במקרים כאלה, דגרו על התאים עם הקצב למשך 30 עד 16 דקות כדי לאפשר לתאים לציית את החרוזים.

לאחר הדגירה הזו, התאים נשטפים פעמיים עם PBS כדי להסיר חרוזים לא משולבים. לאחר מכן מתווספת מדיה טרייה ולאחר מכן מודגרים תאים למשך שש עד 16 שעות לדיווח על ביטוי גנים. עכשיו אנחנו מוכנים להמשיך עם הבדיקות האכזריות.

כדי להתחיל במבחני לוציפר הכינו מאגר xis המכיל 20 מיליון עצים טוחנים, HCL pH H 7.8 10% נפח לנפח גליצרול ו-0.5% נפח לנפח טריטון X 100 לפני השימוש בכמות המספקת הדרושה לניסוי. ואז במיקרוליטר אחד למיליליטר של DTT טוחנת אחת. אל תעשה שימוש חוזר בשאריות תמיסת DT T.

לאחר מכן, בקוקטייל מעכב פרוטאז לריכוז סופי של 0.5 עד פעם אחת בעת שימוש בערכת הזוהר הכפולה בפעם הראשונה, הכינו את מגיב לוציפר הגחליליות על ידי העברת כל התוכן של בקבוק אחד של חוצץ לוציפרים זוהר כפול לבקבוק אחד של מצע לוציפרז זוהר כפול. חלקו את מגיב הלוציפראז שאינו בשימוש ל-10 מילימטר quas ואחסנו במינוס 20 מעלות צלזיוס.לאחר שמגיב הלוציפראז מוכן, הסר את צלחת 96 הבאר מאינקובטור תרבית הרקמות והנח אותה על קרח. לאחר מכן, הסר את המדיאל על ידי שאיפה, ולאחר מכן הוסף את 40 המיקרוליטר לבאר של מאגר ליזה והשאיר את הצלחת על קרח למשך 30 דקות.

לאחר מכן, כ -15 מיקרוליטר של מגיב לוציפר לבאר. בצלחת לבנה אטומה 96 בארות, אנו משתמשים בצלחת אופטית Perkin S 96. ואז ב -15 מיקרוליטר של התא אכל ודגר על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר 10 דקות, קרא את הזוהר בקורא מיקרו-פלטה. לאחר מכן, בצע את לוציפרי הוניל על מנת לקבל נתונים עבור פלסמיד הבקרה. לשם כך, התכוננו מיד לפני, השתמשו בכמות מתאימה של תמיסת מצע לוציפראז על ידי הוספת חלק אחד מגיב זוהר כפול, עצירה וזוהר ל -100 חלקים.

מאגר זוהר, עצירה וזוהר כפול. לאחר מכן, הוסף 15 מיקרוליטר תמיסת מצע לכל אחד. ובכן דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ואז מדדו שוב את הזוהר.

שים לב ששינינו את הפרוטוקול המומלץ של היצרן עבור מבחני זוהר כפול אלה. על מנת להפחית את כמות הריאגנטים הנדרשים לדגימת המקצוענים, כעת ניתן לנתח את הצלחת שוב באמצעות קורא צלחות. לאחר איסוף הנתונים עם קורא המיקרו צלחות ניתן להעבירם לתוכנית גיליון אלקטרוני כגון Microsoft Excel להמשך ניתוח.

ראשית, חשב את הממוצע משלוש הבארות שלא נכרתו והחסר את הערך הזה מכל אחת מנקודות הנתונים. לאחר מכן, חלקו עבור כל עבר היטב את הערך עבור לוציפראז גחלילית. קנה את זה עבור לוציפראז ואז חשב אז עבור כל קבוצה של דגימות משולשות, חשב את הממוצע, ואז את הסטייה ומקדם השונות.

בדוגמה שלנו, אנו משתמשים בריכוזים השונים של חרוזים ששורטטו על ציר ה-x כנגד היחס בין גחלילית לפעילות של לוקר וניל. כפי שאתה יכול לראות, יש עלייה תלוית מינון ביחס זה. זה עתה הראינו לך כיצד להשתמש בדוח מבוסס לוציפר, בדיקת גנים כדי למדוד ביטוי ממקדם קולטן ה-LDL בתגובה לפגוציטוזיס של מהירויות לטקס.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להיות בטוח שהתאים הם רק 80 עד 90% מהמפגש בזמן טרנספקציה. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.