Name: הצמד תיקון הקלטה של תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: למד טכניקות פאץ' קלאמפ לאלקטרופיזיולוגיה בביצי Xenopus laevis. הסרטון מדגים הסרת ממברנת הויטלין, יצירת איטום גיגה-אוהם והמרה לתצורת outside-out patch לחקר ערוצי יונים ביולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מתכון הפתרון הוא כיווץ מהמעבדה של RW אולדריץ&#39;. אנו מודים סוכנויות מימון הבאים היסודות תמיכה: National Institutes of Health, הקרן הלאומית למדע, איגוד הלב האמריקני, איגוד ניוון שרירים, ב &#39;דונלד E. בקסטר דליה קרן, קרן Klingenstein ולקרן מק&#39; נייט למדעי המוח.

חלק 1: הסרת הממברנה vitelline <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני סטים של מלקחיים. אנחנו מעדיפים 5 מס &#39;מלקחיים, שם קבוצה אחת כבר חידד מעט עם קובץ. כמו כן להכין פיפטה העברת זכוכית ידי זמירה ואת האש ליטוש 7 &quot;פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ: כדי למנוע את החלקת ביציות, לחתוך עיגול של רשת (1 ריבועים מ&quot;מ) דבק לתוך החלק התחתון של צלחת פטרי 60mm. מנה זו ניתן לעשות שימוש חוזר ללא הגבלת זמן, אם הזמן לנקות בין השימושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את צלחת פטרי באמצע פתרון hyperosmotic (ראו מתכון) ומקום תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 1-3 ביציות Xenopus מפתרון הדגירה שלהם עם פיפטה פסטר מקום מלוטשים לתוך המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו 15S - 2 דקות עבור תאים להתחיל להתכווץ. פעמים יותר קל להפוך תאים לקלף; זמנים קצרים יותר להוביל תאים בריאים עבור תיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התא מתכווץ, הקרום vitelline יתחילו להיות גלוי בקושי כמו שכבה שקופה מעל התא. בחר תא בריא (ללא דורים או פגמים) עבור קילוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של מלקחיים, בעדינות לתפוס את קרום vitelline מבלי לפגוע הממברנה הפלסמטית. עם זאת, לתפוס קרוב לאותה נקודה בעדינות לקרוע את קרום ברור מזה חינם של התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר, בזהירות להזיז את התא לתא הקלטה. שים לב כי התא יהיה שביר לאחר הסרת vitelline. </li></ol> חלק 2: דור Gigaseal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו פיפטה הקלטה עם מי מלח. השתמש נפח מינימלי של פתרון זה יוצר מגע חשמלי טוב עם חוט האלקטרודה כדי למזער קיבול פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פליק מספר פעמים כדי לאפשר פיפטה בועות והחלק לצוף על חוט האלקטרודה. החל הלחץ פיפטה מלא. ניתן לעשות זאת דרך הפה או באמצעות משאבה אקווריום בחנות לחיות מחמד. לחץ זה הוא קריטי כדי לשמור על פיפטה מנקה כפי שהוא חוצה את ממשק נוזל עובר התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את הביצית בחדר להתמקד בחדות על קצה של התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה מתוך האמבטיה, במרכז קצה (מחוץ לפוקוס) מעל התא. הפעם ממזער בילה באמבטיה לפני דור חותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק את פיפטה לתוך להתמקד חדה ליד התא. תביאו אותו בסמיכות (~ 50 מיקרון). אתה צריך לראות עיוות קטן של פתרון דחף מתוך פיפטה בלחץ בחזרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנה מהדק תיקון, לבדוק את ההתנגדות של פיפטה (המטרה שלנו היא כ 3-4 MΩ) ואפס הנוכחי באמצעות מתח לקזז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם לחץ חיובי על פיפטה, העבר את קצה באיטיות לעבר התא תוך ניטור עמידות ויזואלית או באמצעות צג השמע שיוצר צליל אשר תדירות הוא יחסי ההתנגדות. כאשר קצה מתחיל לגעת התא, התנגדות יגדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתאום אך בעדינות לעבור חיובי ללחץ שלילי של ערך מוחלט זהה בקירוב. ההתנגדות צריכה להגדיל לאטום היווצרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוב הזמן, היווצרות חותם מתרחשת תוך מספר שניות, לפעמים 30-60 שניות נדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתנגדות היא ב 1GΩ, לחץ יוכלו להשתחרר נייטרלי. כעת יש לך כתם על תאים. עבור תיקון מבפנים החוצה, להתרחק מן התא במהירות. במשך מחוץ החוצה, ראה להלן. </li></ol> חלק 5: מחוץ הקצוב טופולוגיה (אופציונלי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר השגת קרע gigaseal, הממברנה. ניתן לעשות זאת עם יניקה חדה, אבל אנחנו מעדיפים 1 V הדופק עבור 1 ms. ההתנגדות צריכה לרדת על מעט יותר מ ההתנגדות הראשונית פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את פיפטה מן התא לאט בצורה חלקה. אתה אמור לראות קטע למשוך את התא עם פיפטה. לפתע, ותוך כמה שניות, התא יהיה הצמד חזרה ההתנגדות צריך מיד לחזור בו זמנית GΩs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת יש לך כתם בתצורת מחוץ החוצה. Ectodomains של כל תעלות יונים כלל חשוף באמבטיה. </li></ol> חלק 6: התוצאות החזויות באופן כללי, חותמות התנגדות גבוהה עדיפים וחי יותר. 10 GΩ הוא מנחה טוב באיכות גבוהה חותמות. מניסיוננו, את הסיכויים חותמות איכות זו משתנה עם גורמים רבים, במיוחד תא פיפטה איכות. רכישת שיעורי תיקון יכול להיות מעל 95% עם תאים בריאים, טפטפות נקי, חוקר מנוסה. תיקונים אלה עשויים להימשך דקות ארוכות ומתאימים לכל מחקר אלקטרו של תעלות יונים לידי ביטוי ביציות Xenopus, כולל ערוץ אחד ההקלטות.

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Sackmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSackmann%2C+B+%22Single-channel+Recording%22">Single-channel Recording</a>. , Plenum Press. New York. (1983).</li>
</ol>

ישנם פרמטרים רבים הקלטה אלקטרו לא נדון כאן. התקנת המתקן, רעש מערכת ניהול, הביטוי הערוץ, ופרוטוקולים הקלטה דבר קריטי גם תוצאות הניסוי טוב. מניסיוננו, אלו הם הפרמטרים הקריטיים ביותר עבור יצירת חותמות אמין: ביציות באיכות גבוהה, הסרת קרום vitelline מהר (aka, &quot;פילינג&quot;), משך השימוש pipettes החדש מוגן מפני אבק, טפטפות חלקה, לחץ חיובי מוחל בעת הזנת אמבטיה הפתרון, פעמים קצר באמבטיה לפני האיטום. להיות זה אמר, חוויה משתנה מאוד ואחרים סטים משלהם הגורמים הח...

<table><tbody><tr><td>מגבר Patch Clamp &amp;תוכנה</td><td>מכשיר</td><td>HEKA Instruments</td><td>EPC-10</td><td>או מכשיר דומה אחר (למשל HEKA EPC-9 או Axopatch 200B)</td></tr><tr><td>פינצטות מס' 5 (שני זוגות)</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסה לכיווץ ביציות</td><td>ריאגנט</td><td></td><td></td><td>רכיב N-methyl-D-glucamine בריכוז mMN
HEPES 220
MgCl2 10
EGTA 1
חומצה אספרטית 220
KCl 2
pH ל-7.4 באמצעות N-methyl-D-glucamine</td></tr><tr><td>רשת ארוגה</td><td>800 מיקרון</td><td>Spectrum Labs</td><td>146481</td><td></td></tr></tbody></table>

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות xenopus

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

מאז הפיתוח שלה על ידי Sakmann ואת נהר 1, 2, מהדק את התיקון הפך הוקמה טכניקה שימושית מאוד עבור מדידה אלקטרו של תעלות יונים יחיד או מספר תאים. טכניקה זו ניתן להחיל על תעלות יונים בסביבה הן מולדתם והביעו בתאים Heterologous, כגון ביציות שנקטפו מן הצפרדע טפרים אפריקה, Xenopus laevis. כאן אנו מתארים את הטכניקה מבוססת היטב של הקלטה תיקון מהדק מ ביציות Xenopus. טכניקה זו משמשת כדי למדוד את המאפיינים של תעלות יונים לידי ביטוי גם באוכלוסיות (macropatch) או בנפרד (יחיד ערוץ הקלטה). אנו מתמקדים וטכניקות על מנת למקסם את איכות הביצית הכנה הדור חותם. עם כל הגורמים אופטימיזציה, טכניקה זו נותנת הסתברות של הדור חותם מוצלח מעל 90 אחוז. התהליך עשוי להיות מותאם באופן שונה על ידי כל חוקר מבוסס על הגורמים הוא או היא מוצאת החשוב ביותר, ואנחנו מציגים את הגישה כי יש להוביל להצלחה רבה בידינו.

זה נועד כהקדמה תיקון הקלטה מהדק מ ביציות Xenopus laevis. היא משתרעת על הסרת vitelline קרום, היווצרות חותם gigaohm (gigaseal), ואת ההמרה אופציונלי של תיקון כדי טופולוגיה מחוץ הקצוב.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

מאז פיתוחה על ידי Sakmann ו-Neher 1, 2, הפכה שיטת ה-patch clamp לטכניקה מבוססת ומועילה ביותר לבדיקות אלקטרופיזיולוגיות...

ההליך מתחיל בהסרת ממбраנת הווילין (vilin) מתוך Opus Cytes, וזאת כדי ליצור בהצלחה את אטמי ההתנגדות בסדר גודל של ג'יגה-אוהם (giga ohm) הדרושים להקלטות patch clamp. לאחר השגתו של תצורת ה-on cell patch clamp, ניתן להפעיל שאיבה בפיפטה כדי להשיג גישה חשמלית לציטופלזמה של התא, בתצורה המכונה whole cell patch. לאחר מכן, ניתן למשוך את קצה הפיפטה מהממברנה הפלזמית עד להחזרתה למקומה, כדי להשיג פיס קטן של ממbrane שבו הדומיינים החיצוניים (ecto domains) של התעלות חשופים לתמיסת הרחץ; תצורה זו ידועה כ-outside out patch. שלום, אני אוסטין בראון מהמעבדה של ד"ר מירים גודמן במחלקה לפיזיולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת סטנפורד.ואני בראנדון ג'ונסון, גם אני ממעבדת גודמן. בסרטון קודם, הדגמנו כיצד להכין פיפטות ל-patch clamp ואלקטרודות חדות עבור אלקטרופיזיולוגיה. היום נציג מבוא להקלטת patch clamp של תעלות יונים המובעות ב-zpa.מאז פיתוחה על ידי S Sacramento ואייר בסוף שנות ה-70, הפכה שיטת רישום ה-patch clamp לטכניקה חיונית למדידה אלקטרופיזיולוגית של תעלות יון בודדות או מרובות בתאים. אז בואו נתחיל. כדי שפיפטות ה-patch clamp יוכלו לגשת לממברנה הפלזמית של האוציט, יש להסיר את ממברנת הווילין החיצונית.לביצוע פעולה זו, הכינו תחילה שתי סדרות של פינצטות מספר חמש. השחיזו קלות סדרה אחת של הפינצטות בעזרת פצירה. הכינו גם פ

patch-clamp-recording-of-ion-channels-expressed-in-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי...

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

אנו מתארים שיטה לכימות הפעילות של ATPases מסוג P-countertransport K+ על ידי ביטוי הטרולוגי של האנזימים בביציות Xenopus ומדידת קליטת Rb+ או Li+ לתאים בודדים על ידי ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית. השיטה מהווה אלטרנטיבה רגישה ובטוחה לניסויי שטף רדיואיזוטופים המאפשרים מחקרים קינטיים מורכבים.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

פיתחנו הכנת מוח השדרה שלמה כבל כדי להקליט ולעקוב אחר פעילות חשמלית באמצעות הקלטת מהדק תיקון מתאי העצב ותאי מאוטנר reticulospinal אחרים בעוברי דג הזברה. לפיכך, אנו מסוגלים להקליט זרמים מעוררים ומעכבים הסינפטי, פעילות ערוץ מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מתא העצב מרכזי בעובר מתפתחת.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

גישת פער זלין החתך פתוח משמשת להשגת הקלטות רעש נמוכות של זרמים יוניים וgating מתעלות יונים מתח תלוי מבוטאים בביציות Xenopus עם רזולוציה גבוהה של קינטיקה ערוץ מהר. עם שינוי קל, fluorometry מהדק מתח יכול להיות מצמידים את פרוטוקול ביצית החתך פתוח.

<em&gt; Xenopus</em&gt; טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ"א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי.

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי חלבוני צומת פערים בביציות קסנופוס ורישום זרם צומתי בין שתי ביציות באמצעות מגבר מסחרי המיועד לרישומי מהדק מתח ביציות כפול במצב מדידת זרם צד גבוה.

הקלטת זרם צומת גאפ מביציות קסנופוס

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

למד טכניקות פאץ' קלאמפ לאלקטרופיזיולוגיה בביצי Xenopus laevis. הסרטון מדגים הסרת ממברנת הויטלין, יצירת איטום גיגה-אוהם והמרה לתצורת outside-out patch לחקר ערוצי יונים ביולוגיים.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

גלה סרטונים נוספים

הצמד תיקון הקלטה של תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus