Name: ביצוע Patch ו-pipettes אלקטרודות שארפ עם פולר לתכנות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: למד להכין פיפטות patch ואלקטרודות שארפ לאלקטרופיזיולוגיה באמצעות פולר מתוכנת. שיטה זו כוללת ציפוי שעווה וליטוש באש לשיפור איכות הכלים למחקר תאי ועצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים סוכנויות מימון הבאים היסודות תמיכה: National Institutes of Health, הקרן הלאומית למדע, איגוד הלב האמריקני, איגוד ניוון שרירים, ב &#39;דונלד E. בקסטר דליה קרן, קרן Klingenstein ולקרן מק&#39; נייט למדעי המוח.

משיכת pipettes שימוש microelectrode כזה חולץ כמו סאטר P-97 Flaming / בראון, למשוך קבוצה של כ 10-20 pipettes. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זכוכית נימי שלך. אנו משתמשים בורוסיליקט נימים (סאטר BF150-110-10, 1.5mm קוטר חיצוני, קוטר פנימי 1.1mm, 10 ס&quot;מ אורך). אחסן את הכוס בזהירות כך הוא נשאר נקי אבק חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית עיצוב מושך. אנו להשתמש בתוכנית 5 צעד, עם החום יורד ומהירות בכל שלב, וכן למשוך קטן על המדרגה האחרונה. פיפטה של ​​סאטר בישול היא הפניה מצוינת לפתח תוכניות מתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הטיפים פיפטה תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע בקוטר הפתיחה החלקות. בטל מחוספס, טיפים אחידה, או לא סדיר. פרוטוקול משיכת טוב צריך להבטיח האלה הם נדירים. להקלטת תיקון-clamp סטנדרטי, פתחים טיפ צריך להיות 1-3 מיקרונים בקוטר. להתחדד תלול (בוטה קצה) מוביל התנגדות נמוכה יותר עבור קוטר הפתיחה זהה. הצורה והגודל ניתן לשנות על ידי ליטוש הלחץ. </li></ol> ליטוש אש pipettes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מעטה ליטוש (microforge) עם נימה פלטינה חימום מבוקר על ידי דוושת רגל. ערכת שימושי זמין ALA מדעי (CPM-2) או מנגנון דומה ניתן להרכיב טיפין טיפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: מעיל פיפטה עם מבודד כדי להקטין קיבוליות ולשפר את המאפיינים רעש. אנו משתמשים שעווה שיניים. Sylgard 184 ™ (poly-דימתיל אלסטומר siloxane הידוע גם בשם PDMS) היא גם אופציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות שעווה, לשמור על אספקת מותכת קטן בקרבת מקום. עם לחץ אוויר על גבו של פיפטה לשמור שעווה מלהיכנס פיפטה, טובלים את קצה בקצרה בשעווה נוזלית ולהסיר. עם Sylgard, אלסטומר חנות שהוכנו aliquots קפוא לצבוע את קצה פיפטה תחת מיקרוסקופ. מחממים לרפא את אלסטומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פיפטה (מצופה או לא) במנגנון ליטוש להביא את קצה ~ 50 מיקרון מן החוט. זכור כי החוט תרחיב כאשר מחומם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ: בצע את פרוטוקול נפרד עבור &quot;ליטוש לחץ&quot; כדי לשנות את הצורה של פיפטה להתנגדות אופטימלית קוטר קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדופק חום קצר (1-2 שניות) הוא מספיק כדי להסיר את השעווה מהקצה של פיפטה וחלק הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פיפטה סיים בתיבה סגורה על מנת להגן מפני אבק, חזור עבור 10 pipettes מוצלח. </li></ol>

<ol><li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

מאויר פרוטוקול כאן נמצא בשימוש יומיומי electrophysiology מעבדות משמש גם כדי להפוך את מחטי הזרקה של תאים וחיות. עם חולץ לתכנות, קל לעשות pipettes עבור מגוון רחב של שימושים. עם תשומת לב וטיפול, חולץ על נימה שלך יימשך שנה או יותר. בהצלחה עם הניסויים שלך.

<table><tbody><tr><td>מכשיר למשכה של מיקרופיפטות</td><td>מכשיר</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>או מכשיר דומה (למשל Sutter P-87 או P-2000)</td></tr><tr><td>קפילריות זכוכית</td><td>ריאגנט</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-86-10</td><td>או זכוכית קפילרית דומה. כדי להקל על מילוי הפיפטה, השתמשו בקפילריה עם סיב זכוכית.</td></tr></tbody></table>

ביצוע patch ו-pipettes אלקטרודות שארפ עם פולר לתכנות

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Microelectrodes זכוכית (הנקרא גם pipettes) היה סוס עבודה של electrophysiology במשך עשרות שנים. היום, טפטפות כאלה עשויים זכוכית נימים באמצעות חולץ לתכנות. כזה חום המכשירים נימי שימוש או נימה מתכת או לייזר להוציא את הזכוכית באמצעות הכבידה, מנוע או שניהם. Pipettes הקלטה תיקון-clamp נוצרות באמצעות חום כוח הכבידה בלבד, בעוד האלקטרודות חדה הקלטה תאיים להשתמש בשילוב של חום, כוח הכבידה, ואת המנוע. הליך המשמש לייצור טפטפות הקלטה תאיים דומה לזה המשמש לייצור הזרקת מחטים עבור מגוון של יישומים, כולל הזרקה לתוך ביציות Xenopus קרנה. בשנת זכוכית, כללי נימי &lt;1.2 מ&quot;מ קוטר היא נהגה להכין pipettes הקלטה מהדק תיקון, בעוד זכוכית צר משמש להקלטת תאיים (קוטר חיצוני = 1.0 מ&quot;מ). לכל אחד מהכלים, חולץ מתוכנת שונה במקצת. סרט הווידאו הזה מראה איך לעשות את שני סוגי pipettes הקלטה באמצעות שנקבעה מראש תוכניות חולץ.

וידאו זה מראה כיצד להשתמש חולץ לתכנות לעשות pipettes תיקון אלקטרודות חדה electrophysiology. הפרוצדורה זהה ניתן להשתמש כדי ליצור מגוון של כלי זכוכית, כולל הזרקה ומחטים.

ביצוע Patch ו-pipettes אלקטרודות שארפ עם פולר לתכנות

מיקרו-אלקטרודות מזכוכית (הנקראות גם פיפטות) מהוות כלי עבודה מרכזי באלקטרופיזיולוגיה כבר עשורים. כיום, פיפטות אלו מיוצרות מקפילריות זכוכית...

פיפטות קפילריות מזכוכית הפכו לנפוצות במעבדות עבור מגוון רחב של טכניקות, כגון אלקטרופורציה של תא בודד, מיקרו-הזרקת DNA ואלקטרופיזיולוגיה של patch clamp. כדי להכין אלקטרודות patch clamp קפילריות מזכוכית להקלטות, מושכת זכוכית סיליקט באמצעות מושך זכוכית תכנותי (programmable puller). קצות האלקטרודות מצופים בשעווה, ולאחר מכן הקצוות עוברים ליטוש באש ונשמרים לשימוש עתידי. שלום, אני מירים גודמן מהמחלקה לפיזיולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת סטנפורד.בסרטון זה, אדגים כיצד להכין פיפטות patch clamp ואלקטרודות חדות לאלקטרופיזיולוגיה. מיקרו-אלקטרודות מזכוכית, הנקראות גם פיפטות, מהוות כלי עבודה מרכזי באלקטרופיזיולוגיה כבר עשורים. כיום, פיפטות אלו מיוצרות מקפילריות זכוכית באמצעות מכשיר משיכה ניתן לתכנות.בואו נתחיל. כדי להכין פיפטות לטכניקת patch clamp, אנו משתמשים בנימי זכוכית מסוג Sutter borosilicate שהם נקיים וללא אבק, ואנו משתמשים במכשיר משיכת מיקרו-אלקטרודות מסוג Sutter P-97. ספר המתכונים לפיפטות של Sutter (Sutter's Pipette Cookbook) הוא מקור מידע מצוין לפיתוח תוכניות משיכה מתאימות.ראשית, הרימו את כיסוי האבק של השובך. לאחר מכן, קחו צינור קפילרי אחד מזכוכית מהקופסה. הקפידו להחזיר את המכסה כדי למזער את הצטברות האבק.בשלב הבא, החליקו ביד אחת את הנימיון אל תוך החריץ באחד מצדי הסיב, והדקו מעט את התפסן. בשלב זה, התפסן צריך להיות הדוק מספיק כדי למנוע מהצינור ליפול, אך רפוי מספיק כדי שניתן יהיה להחליקו אל תוך החריץ. כעת, שחררו את מעצור המתכת הקפיצי באותו צד.לאחר מכן, אחזו עם האגודל והאצבע במחברים המתכתיים המחוברים לתחתית שני הנשאיות. שחררו את מעצור הקפיץ המתכתי השני. משכו את הנשאיות זו לכיוון זו עד למקסימום והחזיקו אותן במקומן ביד אחת.בשלב הבא, החליקו את המבחנה דרך בית הפילמנט אל תוך החריץ של הנשא בצד השני. הימנעו מדחיקת הזכוכית אל תוך פילמנט החימום. הדקו את התפסנים בשני הצדדים.עליהם להיות הדוקים מספיק כדי להחזיק את הנשאיות במקומן, אך לא הדוקים מדי עד כדי ריסוק הזכוכית. כעת, סגרו את כיסוי האבק ולחצו על הכפתור הירוק. פיפטות בעלות קוטב מסומן להקלטות patch clamp נוצרות באמצעות תוכנית משיכה בת חמישה שלבים, עם חום ומהירות יורדים בכל שלב, וקוטב קטן בשלב הסופי.תוכנית זו משתמשת בחום ובכבידה. ההליך להכנת אלקטרודות חדות דומה מאוד, אך במקרה זה, אנו משתמשים בנימה דקה מזכוכית מבית Warner Instruments, בעלת קוטר חיצוני של 1 mm וקוטר פנימי של 0.78 mm. כמו כן, אנו מחלקים תוכנית משיכה המשתמשת במנוע בנוסף לחום ולכבידה, כאשר תוכניות המשיכה מסתיימות.הרימו את כיסוי האבק, שחררו את שני התפסים והוציאו את הפ pipette המוכנה. לאחר מכן, הניחו את ה-pipettes בקופסת עבודה. ניתן להכין את הקופסה על ידי הדבקת רצועת ספוג למסך של קופסת טיפים לפ pipette, ולאחר מכן חיתוך של שישה עד שמונה חריצים בספוג.הכניסו את הפפטות לחריצים. לאחר שהקופסה מלאה בפפטות שנמשכו, עברו לשלב הליטוש באש (fire polishing) כדי ללטש את הפפטות. הגדירו מערך מיקרו-forge עם פילמנט חימום מפלטינה הנשלט באמצעות דווש רגל לפני תחילת הליטוש באש.ראשית, הקיפו את הפפיטה בשעוות שיניים כדי להפחית את הקיבוליות ולשפר את מאפייני הרעש. לשם כך, החזיקו במאגר קטן של שעווה מומסת בקרבת מקום. הפילו לחץ אוויר בחלק האחורי של הפפיטה כדי למנוע מהשעווה לחדור אל הקצה.לאחר מכן, טבלו את הקצה למשך זמן קצר בשמע wax הנוזלי. הוציאו אותו כעת. הניחו את הפיפטה במכשיר הליטוש וקרבו את הקצה למרחק של כ-50 מיקרון מהסיב.יש לזכור כי הפילמנט יתרחב בעת החימום. יש להפעיל פולס חום קצר של שנייה אחת או שתיים כדי להסיר את השעווה מקצה הפיפטה ולהחליק את הזכוכית. יש לבחון את קצות הפיפטות תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את קוטר הפתח ואת רמת החלקות.עבור הקלטות patch clamp סטנדרטיות, פתחי הקצה צריכים להיות בקוטר של מיקרון אחד עד שלושה; יש להשליך קצוות גסים, לא אחידים או לא סדירים. הניחו את הפ pipette המוכנה בתיבת עבודה, וודאו שאתם סוגרים את המכסה כדי להגן על ה-pipettes מאבק; חזרו על הפעולה עד לקבלת 10 pipettes תקינות. הרגשתי כעת כיצד להכין patch clamp pipettes ו-sharp electrodes באמצעות puller ניתן לתכנות.ניתן להשתמש באותו הליך להכנת מגוון של כלי זכוכית, כולל מחטי הזרקה להשגת תוצאות אופטימליות ב-patch clamp. חשוב לזכור למשוך פיפטות חדשות נקיות מאבק באותו היום של הניסוי, ולהנחיתן (polish) בתוך שעה מהניסוי. כמו כן, יש לוודא באמצעות בדיקה ויזואלית שהפיפטות חלקות ומלוטשות.הקפידו לצפות בסרטון שלנו השני, המדגים כיצד לבצע הקלטת patch clamp של תעלות יונים המובעות בביצי Xenopus oocytes. אוקיי, זהו זה. כעת אתם מומחים בשימוש בפיפטה, ובהצלחה בניסוייכם.

making-patch-pipettes-and-sharp-electrodes-with-a-programmable-puller

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זהו מדריך כדי לשנות את הצורה של micropipettes זכוכית. באופן ספציפי, באמצעות חום ולחץ אוויר להתחדד הוא התרחב מבלי להגדיל את פתיחת קצה, המוביל פיפטה התנגדות נמוכה יותר. זה קריטי כדי להשיג הקלטות רעש נמוך של תאים קטנים אך שימושית ביישומים רבים.

לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים

Bilayers השומנים מישורי, הנקרא גם bilayers השומנים מלאכותית, מאפשרים לך ללמוד ניצוח יון ערוצי בסביבה מוגדרת היטב. הנה, אנחנו מדגימים את השלבים הפרט צריך להכין את החדר bilayer, האלקטרודות וכיצד הבדיקה bilayer מתאים ערוץ בודד במדידות.

הכנת Bilayers מלאכותית לניסויים Electrophysiology

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה למדידת נוקשות תא. העיקרון הכללי של גישה זו הוא למדוד עיוות קרום בתגובה ללחץ שלילי מוגדר היטב ליישם באמצעות micropipette על פני התא. שיטה זו מספקת כלי רב עצמה כדי לחקור את התכונות של תאי מצע biomechanical-מצורפים.

שאיפת micropipette של תאי מצע מצורפים להערכת נוקשות סלולריות

Iontophoresis של אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים במהלך...

ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל<em&gt; בחי</em&gt; מניפולציות תרופתיות של תגובות עצביות

הקלטות תיקון מהדק Multi-אלקטרודה מהוות משימה מורכבת. כאן אנו מראים כיצד, על ידי אוטומציה של רבים מהשלבים הניסיוניים, זה אפשרי כדי להאיץ את התהליך מוביל לשיפור איכותי בביצועים ומספר ההקלטות.

מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב

ערוצי mechanosensitive חיידקים יכולים לשמש כמתמר mechanoelectrical במכשירי biomolecular. bilayers אגל הממשק (דיבס), אבני בניין בהשראת תא למכשירים כאלה, מייצג פלטפורמות חדשות לשלב ולעורר ערוצי mechanosensitive. הנה, אנחנו מדגימים שיטה מבוססת micropipette חדש של יוצרי דיבס, המאפשר הלימוד של ערוצי mechanosensitive תחת גירוי מכאני.

רב תכליתיים, Micropipette מבוסס שיטה להתאגדות וגירוי של ערוצים בקטריאלי Mechanosensitive יון בbilayers ממשק אגל

אנו מציגים שיטות לבניית אלקטרודות לרישום בו זמנית של פעילות עצבית חוץ-תאית ולשחרור חומרים נוירואקטיביים מרובים בקרבת אתרי ההקלטה בעכברים ערים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של קלטים סינפטיים מקומיים משוערים לנוירון המעניין.

הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake

ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

כתב יד זה מתאר את היישומים של אלקטרודות פרוטון סלקטיבית, תיקון מחבר חובק למעקה שיטות למדוד את הפעילות של מערכות תחבורה פרוטון. אלה שיטות להתגבר על כמה מגבלות של טכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד פעילות התחבורה פרוטון, כגון רגישות בינונית, רזולוציה זמן ובקרה לא מספיקות כאורחים סביבה תאיים.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

פרוטוקול זה מפרט שיטה למדידה ישירה של פעילות תעלות יונים על שלפוחיות תוך תאיות באמצעות מערכת מהדק טלאי אנדוליזוזומלי ידנית. אנו מדגימים את השיטה הכוללת הגדלת אנדוליזוזומים ובידוד ידני של שלפוחיות אלה. גישה זו מבטיחה שחוקרים יוכלו לשכפל וליישם במדויק את ההליך.

טכניקות Patch-Clamp לניתוח שלפוחית אנדוליזוזומלית בודדת

למד להכין פיפטות patch ואלקטרודות שארפ לאלקטרופיזיולוגיה באמצעות פולר מתוכנת. שיטה זו כוללת ציפוי שעווה וליטוש באש לשיפור איכות הכלים למחקר תאי ועצבי.

ביצוע Patch ו-pipettes אלקטרודות שארפ עם פולר לתכנות

גלה סרטונים נוספים