Name: לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: למדו שיטה לליטוש מיקרופיפטות זכוכית באמצעות חום ולחץ אוויר להקלטות פאץ'-קלאמפ משופרות בתאים קטנים. טכניקה זו מפחיתה התנגדות הפיפטה מבלי להגדיל את פתח הקצה ומשפרת את איכות הנתונים האלקטרופיזיולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הטכניקה הלחץ ליטוש פותחה בשיתוף פעולה עם Lockery SR.

משיכת pipettes בעזרת חוט כזה חולץ כמו סאטר P-97 Flaming פולר microelectrode / בראון, למשוך קבוצה של כ 10-20 pipettes. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זכוכית שלך. אנו משתמשים בורוסיליקט (BF150-86-10, OD = 1.5 מ&quot;מ, ID = 0.86 מ&quot;מ). אחסן את הכוס בזהירות כך הוא נשאר נקי אבק חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית עיצוב מושך. המטרה העיקרית היא קצה הפתיחה בערך בגודל הרצוי, אשר יהיה תלוי ביישום. P-97 של סאטר Cookbook פיפטה 2 היא הפניה מצוינת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב pipettes שלך תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע בקוטר הפתיחה החלקות. בטל מחוספס, טיפים אחידה, או לא סדיר. להקלטת תיקון תקן מלחציים, פתח טיפ כי הוא 2-4 מיקרומטר לרוחב היא הטובה ביותר. טיפ בוטה מוביל התנגדות נמוכה יותר עבור קוטר הפתיחה זהה, אשר העדיפה. הצורה והגודל ניתן לשנות במהלך ליטוש, להלן. </li></ol> ליטוש לחץ pipettes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף בעל פיפטה אל קו נקי, אוויר דחוס. באמצעות הרגולטור, להגדיר את קו אוויר דחוס בלחץ ~ 40 PSI. חבר את קו אוויר דחוס שסתום 4-way שליטה שתאפשר את הלחץ בעל פיפטה להיות מופעלת לסירוגין. חבר בעל פיפטה אל שסתום הבקרה עם אורך של ⅛ ב Tygon ® צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתקן ליטוש (microforge) עם בעל בלחץ גבוה פיפטה, סליל ליטוש נשלט על ידי דוושת רגל, מיקרוסקופ המצויד בהגדלה נמוכה גבוהה, זמן עבודה מרחוק (באופן אידיאלי, 10x ו 100x) האוויר מטרות. זה קריטי כדי להיות מסוגל לראות את פתיחת פיפטה במהלך הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: מעיל עם פיפטה מבודדת הידרופובי להקטין קיבוליות ולשפר את המאפיינים רעש (ראה &quot;pipettes משיכת&quot; עבור בטכניקה זו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את שסתום הלחץ נמצא במצב כבוי. מניחים טפטפת לתוך מחזיק פיפטה והדק את הולם האצבע חזק. הערה בטיחות: אם פיפטה מוחזק בחוזקה לתוך מחזיק פיפטה, את לחץ האוויר תגרום פיפטה להיות נפלט מבעל פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פיפטה ומחזיק ב microforge. מיקום פיפטה בעל לבמה מיקרוסקופ כך הן קצה ואת סליל ליטוש גלויים בהספק (10x) נמוך microforge. תביאו את קצה ~ 75 מיקרון מן החוט. זכור כי החוט תרחיב כאשר מחומם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר אל המטרה גבוה כוח (100x). גם את קצה פיפטה ואת סליל ליטוש צריך להיות בפוקוס בתחום התצוגה. אם לא, להתאים את גובה של הסליל ליטוש. (עמדת פיפטה לא יכול להיות מותאמים). קצה פיפטה ו סליל ליטוש צריכה להיות קרובה צדי בתחום התצוגה. הימנע מיצוב סליל קרוב מדי לקצה פיפטה כי תרחיב כפי מחממת ולהיתקל פיפטה שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובבו את שסתום להפנות אוויר דחוס לתוך פיפטה, והחום קצה פיפטה עד להתחדד מאחורי קצה מתחיל בלון החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור חימום לפני קצה בלונים גם בהרחבה. ניסויים נדרשת כדי לקבוע את המרחק חום מתאים, וזמן עבור הצורה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: הקטנת קוטר הפתח טיפ על ידי ליטוש קצה בהעדר לחץ. שלבים 7 ו -8 ניתן חזר כדי לכוונן גם את הצורה ואת הממדים של קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את הלחץ תוך הצבעה על קצה פיפטה בכיוון בטוח, להסיר את פיפטה ולמקם אותו בתוך קופסת האחסון נקי איפה זה יהיה מוגן מפני אבק. הערה בטיחות: אם לחץ האוויר לא מבוטלת, פיפטה יכול להפלט מבעל פיפטה במהלך ההסרה. </li></ol> הערות על microforge אנו משתמשים microforge התאספו מעל המדף, חלקים זמינים מסחרית. (ניתן גם לקנות ערכת הלחץ ליטוש של מספר חברות, כגון: ALA המדע, GlassWorx). ללא קשר microforge, חיוני לקיים אופטיקה כי הם טובים מספיק כדי לראות את פתיחת קצה, אשר לעיתים קרובות רק כמה מיקרומטר קוטר. אנו משתמשים בעדשה ארוכת עובד מרחק 100x למטרה זו. כמו כן, המעיל סליל ליטוש עם כוס גבוהה נמס בטמפרטורה כדי למזער את הפקדת מתכת מתאדה על pipettes. חלק 3: התוצאות החזויות ליטוש לחץ מתונה יכולה להפחית את עמידות של טפטפת ללא שינוי ניכר בפתיחת קוטר. אם תרצה, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להפוך pipettes עם תת מיקרון פתחים התנגדויות בין 5-10MΩ.

<ol><li>Goodman, M. B., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+polishing%3A+a+method+for+re-shaping+patch+pipettes+during+fire+polishing.%C2%A0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. .</a> J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).</li>
<li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

אנחנו במקור פיתחו שיטה להפוך pipettes שימושי הקלטה תיקון-clamp 2-3 מיקרומטר נוירונים ב C. elegans 1. זה נמצא בשימוש שגרתי במעבדה גודמן. אנחנו בלחץ פולנית pipettes לא רק הקלטה מ ג זעיר נוירונים elegans, אלא גם לקבלת macropatch חד ערוצים הקלטות של תעלות יונים לידי ביטוי ביציות Xenopus. עבור בקוטר טיפ הפתיחה נתון, את הצורה הבוטה מייצרת פיפטה נמוך התנגדות. התנגדות פיפטה התחתון מוביל התנגדות סדרה נמוך יותר רעש הקלטות.

<table><tbody><tr><td>קפילריות זכוכית</td><td>חומר מתכלה</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-85-10 (או דומה)</td><td>השיטה עובדת עם כל סוג של קפילריה למעט כאלו העשויות קוורץ. עם זאת, אנו ממליצים להשתמש בקפילריות בעלות פילמנט.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL (או דומה)</td><td>כל מיקרוסקופ הפוך פשוט יספיק. עם זאת, חיוני שתהיה הגדלה מספקת כדי לראות את הפפטים במהלך הליטוש. למטרה זו אנו משתמשים בעדשה מטלורגית של 100x עם מרחק עבודה ארוך.</td></tr><tr><td>ערכת Microforge</td><td>כלי</td><td>ALA Science</td><td>CPM-2</td><td>מספקת סליל ליטוש, בקר ודוושה.</td></tr><tr><td>מקור לחץ אוויר</td><td>כלי</td><td>ALA Science</td><td>PR-60</td><td>אביזר לאספקת לחץ גבוה, כולל שסתום מתאים. לחלופין, ניתן להשתמש באוויר דחוס מהבניין יחד עם פילטר/רגולטור (המכוון ל-40 PSI) ושסתום 4 דרכים (ראו להלן).</td></tr><tr><td>שסתום 4 דרכים</td><td>כלי</td><td>Cole-Parmer</td><td>A-98150-01</td><td>יידרשו מחברים לחיבור השסתום לצינורית.</td></tr><tr><td>מחזיק פפטה עם מחבר Luer</td><td>כלי</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH-6S20</td><td>השתמש במחבר Luer-to-barb זכר כדי לחבר את מחזיק הפפטה לצינורית בלחץ גבוה.</td></tr><tr><td>צינורית Tygon&amp;#174;</td><td>כלי</td><td>Cole-Parmer</td><td>06408-62</td><td>השתמש בצינורית זו כדי לחבר את מחזיק הפפטה לשסתום 4 הדרכים.</td></tr></tbody></table>

לחץ לליטוש pipettes עבור patch-clamp הקלטה משופרים

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

לחץ לליטוש היא שיטה לעיצוב pipettes זכוכית הקלטה תיקון-clamp. אנחנו הראשונים שפותחו בשיטה זו בודה pipettes מתאים הקלטה מ (&lt;3 מ &#39;), גופים קטנים תאים עצביים. מנהל בסיסי דומה ניפוח זכוכית, והוא משלב לחץ אוויר וחום לשנות את הצורה של pipettes תיקון שהוכן על ידי חולץ micropipette קונבנציונאלי. זה יכול להיות מיושם רך שנקרא (סודה לימון) וקשה (בורוסיליקט) משקפיים. ככלל, ליטוש הלחץ יכול להפחית התנגדות פיפטה של ​​25% ללא ירידה בקוטר של פתיחת קצה (גודמן Lockery, 2000). זה יכול להיות מיושם כמעט כל סוג של זכוכית דורש רק תוספת של שסתום לחץ גבוה ו הולם microforge. טכניקה זו היא חיונית עבור הקלטת מתאי ultrasmall (&lt;5 מ &#39;) יכול גם לשפר את ההקלטה יחיד הערוץ על ידי צמצום התנגדות פיפטה. הצורה הבוטה שימושית גם עבור הקלטה מחורר, מהדק מאז תיקון זה צורה תוצאות הטיפ בועה קרום יותר עבור ניקוב.

זהו מדריך כדי לשנות את הצורה של micropipettes זכוכית. באופן ספציפי, באמצעות חום ולחץ אוויר להתחדד הוא התרחב מבלי להגדיל את פתיחת קצה, המוביל פיפטה התנגדות נמוכה יותר. זה קריטי כדי להשיג הקלטות רעש נמוך של תאים קטנים אך שימושית ביישומים רבים.

לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים

ליטוש בלחץ (Pressure-polishing) היא שיטה לעיצוב פיפטות זכוכית להקלטות patch-clamp. פיתחנו תחילה שיטה זו לייצור פיפטות המתאימות ל...

הליך זה מתחיל במיקום קצה הפ pipette ליד סיב הליטוש בהגדלה של 100 פעמים. לאחר מכן, הפעל את לחץ האוויר והחימום. הסיב.קצה הפ pipette יתרחב וייצור קצה בעל צורה קהה. כבה את החימום כדי לקבל פתח קטן יותר של הקצה. כבה שוב את הלחץ ואת החימום.שלום, אני ברנדון ג'ונסון מהמעבדה של ד"ר מרים גודמן במחלקה לפיזיולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת סטנפורד. היום נדגים לכם הליך להחלקת פיפטות patch באמצעות לחץ. אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור תעלות יונים וטלאי ממברנה (membrane patches) בנוירונים של *C. elegans*.אם כן, נתחיל. הכינו סט של שש עד 10 פיפטות למתיחה (patch pipettes). לעזרה, פנו למומחה מקומי או צפו בניסוי הוויזואלי שלנו להכנת פיפטות למתיחה ואלקטרודות חדות באמצעות מכשיר מתיחה תכנותי (programmable puller).כדי להתחיל את הפרוצדורה, הגדירו לחץ בקו האוויר הדחוס לכ-40 PS.I, ולאחר מכן חברו את קו האוויר הדחוס לשסתום בקרה ארבע-דרכי. חברו קטע של צינור פלסטיק לשסתום ארבע-הדרכים וחברו מחזיק פיפטה ללחץ גבוה לקצה החופשי של צינור הפלסטיק. השתמשו במערכת מיקרו-פורג' (micro forge rig) כדי לבצע את ההברקה.אנו משתמשים בערכת Ccpm two מבית LA Scientific. מערך זה כולל מחזיק פיפט ללחץ גבוה, פילמנט חימום מפלטינה הנשלט באמצעות דום רגל, ומיקרוסקופ המצויד בעדשות אוויר בעלות מרחק עבודה ארוך, עם הגדלה נמוכה של 10 times והגדלה גבוהה של 100 times. עדשות אלו הן אידיאליות מכיוון שקריטי להיות מסוגלים לצפות בפתח הפיפט במהלך הפרוטוקול.בשלב הבא, וודאו ששסתום הלחץ נמצא במצב כבוי. לאחר מכן, הניחו פיפט במחזיק הפיפטים והדקו את החיבור עד לסגירה ידנית (finger tight) למען בטיחות המעבדה. וודאו שהפיפט מוחזק היטב במחזיק הפיפטים.אחרת, לחץ האוויר יגרום להוצאת הפיפטה מהתושבת. כשלב אופציונלי, ניתן לצפות את הפיפטה במבודד הידרופובי כגון שעווה כדי להפחית את הקיבוליות ולשפר את מאפייני הרעש. כעת הניחו את תושבת הפיפטה במיקום המיקרו-פורג' (micro forge), ומקמו את תושבת הפיפטה על משטח המיקרוסקופ כך שגם הקצה וגם חוט הליטוש יהיו גלויים בהגדלה נמוכה של 10 פעמים במיקרו-פורג'.קרב את הקצה למרחק של כ-50 מיקרונים מהסיב, ולאחר מכן עבור לעדשה אובייקטיבית בעוצמה גבוהה של 100; הן קצה הפ pipette והן סיב הליטוש צריכים להיות במיקוד ובתוך שדה הראייה. אם לא,כוונן את גובה הסיב. כיוון שלא ניתן לכוונן את מיקום ה-pipette, קצה ה-pipette והסיב צריכים להימצא בצדדים מנוגדים של שדה הראייה.הימנעו ממיקום קצה הפ pipette קרוב מדי לסיב (filament) מכיוון שהוא יתרחב בעת החימום ועלול להיתקל ב-pipette שלכם. ברגע שקצה ה-pipette והסיב ממוקמים כראוי, סובבו את השסתום כדי להזרים אוויר תחת לחץ לתוך ה-pipette וחממו את קצה ה-pipette עד שההיצרות שמאחורי הקצה מתחילה להתנפח כלפי חוץ. הפסיקו את החימום לפני שקצה ה-pipette יתנפח יתר על המידה.נדרשת התנסות כדי לקבוע את המרחק, החום והזמן המתאימים לצורה הרצויה. כשלב אופציונלי, ניתן גם ללטש את הקצה בהיעדר לחץ כדי להקטין את קוטר פתח הקצה. כמו כן, יש לזכור שניתן לחזור על שלבי ליטוש אלה כדי להגיע לדיוק מרבי.כוון הן את הצורה והן את הממדים של קצה הפיפטה. עם סיום הליטוש, כבה את הלחץ והפנה את קצה הפיפטה לכיוון בטוח.הסר את הפ pipette והנח אותה בקופסת אחסון נקייה שבה תהיה מוגנת מאבק. למען בטיחות המעבדה, וודא כי הלחץ כבוי לפני הסרת הפ pipette. אחרת, היא עלולה להידחף החוצה מתושבת הפ pipette.עם הסילוק, הראינו לכם כיצד לבצע ליטוש בלחץ (pressure polish) לפיפטות לשיפור הקלטות patch clamp. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לצפות את סליל הליטוש בזכוכית בעלת טמפרטורת התכה גבוהה, כדי למזער את שקיעת המתכת המאודה על הפיפטות, ולהיזהר בעוד הפיפטות חשופות לאוויר בלחץ.וודאו שהפיפטה מוחזקת בחוזקה במחזיק וכבו את אספקת האוויר לפני הוצאת הפיפטה מהמחזיק. זה הכל. תודה שצפיתם.בהצלחה בליטוש בלחץ ובניסויים שלכם.

pressure-polishing-pipettes-for-improved-patch-clamp-recording

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מראה כיצד להשתמש חולץ לתכנות לעשות pipettes תיקון אלקטרודות חדה electrophysiology. הפרוצדורה זהה ניתן להשתמש כדי ליצור מגוון של כלי זכוכית, כולל הזרקה ומחטים.

ביצוע Patch ו-pipettes אלקטרודות שארפ עם פולר לתכנות

אנו משתמשים בטכניקה תיקון-clamp למדוד GABA המופעל יחיד ערוץ זרמים (GABAA ערוצים, קולטנים GABAA) לבין זרמים סינפטיים טוניק שהם מייצרים בנוירונים. הפעלת ערוצי פוחתת רגישות עצבית בבריאות...

GABA המופעל זרמים ערוץ בודד וטוניק פרוסות המוח עכברוש

פרוטוקול זה מתאר טכניקה הנקראת אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם, שהיא שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירוני מאוטנר ותאים רטיקולוספינליים אחרים בעוברים של דגי זברה.

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

סרטון זה מדגים טכניקה להקלטת מהדק טלאי מפני השטח של הממברנה הדנדריטית. זה עוזר לבחון ישירות את התכונות החשמליות של דנדריטים ותעלות יונים מגודרות מתח בסיסיות בנוירונים דופמינרגיים.

הקלטות מהדק טלאי מהדנדריט של נוירון דופמינרגי בפרוסת מוח

הקלטות תיקון מהדק Multi-אלקטרודה מהוות משימה מורכבת. כאן אנו מראים כיצד, על ידי אוטומציה של רבים מהשלבים הניסיוניים, זה אפשרי כדי להאיץ את התהליך מוביל לשיפור איכותי בביצועים ומספר ההקלטות.

מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

הקלטות מהדק טלאי תת-תאיות מציעות את האפשרות לחקור את התכונות הפונקציונליות של דנדריטים. עם זאת, מבנים עדינים אלה אינם נגישים בקלות בשל קוטרם הקטן. הפרוטוקול המתואר כאן נועד להקל על איסוף הקלטות יציבות ואמינות מהדנדריטים של נוירוני דופמין בפרוסות במבחנה.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים של אמצעי הזהירות הנדרשים לביצוע תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך מולטיפלקס תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ. טכניקה זו היא שיטה פשוטה ויעילה כדי לנתח את פרופיל ביטוי של קבוצת גנים מתא יחיד מאופיין על ידי תיקון-קלאמפ הקלטות מראש.

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע הקלטות חשמליות מתאי זרע של יונקים בתצורת תא שלם, במטרה להקליט ישירות את פעילות תעלות היונים. השיטה הייתה חיונית בתיאור הפרופילים האלקטרופיזיולוגיים של מספר תעלות יוני זרע וסייעה לחשוף את זהותם המולקולרית והוויסות שלהם.

רישום זרמים חשמליים על פני קרום הפלזמה של תאי זרע של יונקים

מוצגות כאן שיטות המספקות הוראות מפורטות לניתוח, ניתוק, תרבית ורישום מהדק טלאי מגנגליון שיווי המשקל ונוירוני גנגליון ספירלי באוזן הפנימית.

בידוד וטיפוח סומאטה גנגליון ווסטיבולרי וספירלי ממכרסמים יילודים להקלטות טלאי

פרוטוקול זה מפרט שיטה למדידה ישירה של פעילות תעלות יונים על שלפוחיות תוך תאיות באמצעות מערכת מהדק טלאי אנדוליזוזומלי ידנית. אנו מדגימים את השיטה הכוללת הגדלת אנדוליזוזומים ובידוד ידני של שלפוחיות אלה. גישה זו מבטיחה שחוקרים יוכלו לשכפל וליישם במדויק את ההליך.

טכניקות Patch-Clamp לניתוח שלפוחית אנדוליזוזומלית בודדת

למדו שיטה לליטוש מיקרופיפטות זכוכית באמצעות חום ולחץ אוויר להקלטות פאץ'-קלאמפ משופרות בתאים קטנים. טכניקה זו מפחיתה התנגדות הפיפטה מבלי להגדיל את פתח הקצה ומשפרת את איכות הנתונים האלקטרופיזיולוגיים.

לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים

גלה סרטונים נוספים