לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים
22 באוקטובר 2008
זהו מדריך כדי לשנות את הצורה של micropipettes זכוכית. באופן ספציפי, באמצעות חום ולחץ אוויר להתחדד הוא התרחב מבלי להגדיל את פתיחת קצה, המוביל פיפטה התנגדות נמוכה יותר. זה קריטי כדי להשיג הקלטות רעש נמוך של תאים קטנים אך שימושית ביישומים רבים.
הליך זה מתחיל במיקום קצה הפיפטה ליד חוט הליטוש בהגדלה פי 100. לאחר מכן, הפעל לחץ אוויר וחום. הנימה.
קצה הפיפטה יתרחב ליצירת קצה בצורת קהה. מכבים את האש כדי לקבל פתח קצה קטן יותר. כבה את הלחץ ומחמם שוב.
היי, אני ברנדון ג'ונסון מהמעבדה של ד"ר מרים גודמן במחלקה לפיזיולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת סטנפורד. היום נראה לכם נוהל לליטוש פיפטות תיקון בלחץ. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור תעלות יונים וכתמי ממברנה ונוירונים של NC elgan.
אז בואו נתחיל. משוך סט של שש עד 10 פיפטות תיקון. התייעץ עם מומחה מקומי או עם הניסוי הוויזואלי שלנו להכנת פיפטות טלאי ואלקטרודות חדות עם קוטבי הניתן לתכנות לקבלת עזרה.
כדי להתחיל בהליך, הגדר לחץ אוויר דחוס לכ-40 PS. לאחר מכן אני מחבר את חברת התעופה הדחוסה לשסתום בקרה לארבעה כיוונים. חבר אורך של צינורות פלסטיק לשסתום הארבע-כיווני והצמד מחזיק פיפטה בלחץ גבוה לקצה הרופף של צינור הפלסטיק. השתמש במתקן מיקרו פורג' כדי לבצע את הליטוש.
אנו משתמשים בערכת Ccpm 2 מ-LA Scientific. לאסדה זו מחזיק פיפטה בלחץ גבוה, חוט חימום פלטינה הנשלט על ידי דוושת רגל ומיקרוסקופ המצויד בהגדלה נמוכה וגבוהה פי 10 באורך פי 100. מטרות אוויר למרחק עבודה הן אידיאליות מכיוון שזה קריטי להיות מסוגל להתבונן בפתיחת הפיפטה במהלך הפרוטוקול.
לאחר מכן, ודא ששסתום הלחץ נמצא במצב כבוי. לאחר מכן הנח פיפטה לתוך מחזיק הפיפטה והדק את האביזר לאצבע חזקה למען בטיחות המעבדה. ודא שהפיפטה מוחזקת היטב במחזיק הפיפטה.
אחרת, לחץ האוויר יגרום לפליטת הפיפטה מהמחזיק. כשלב אופציונלי, ניתן לצפות את הפיפטה במבודד הידרופובי כגון שעווה כדי להפחית את הקיבול ולשפר את מאפייני הרעש. כעת הנח את הפיפטה במחזיק במיקרו זיוף מקם את מחזיק הפיפטה על שלב המיקרוסקופ כך שגם הקצה וגם חוט הליטוש נראים בעוצמה נמוכה פי 10 על המיקרו זיוף.
הביאו את הקצה כ-50 מיקרון מהחוט, ולאחר מכן עברו לעוצמה גבוהה 100 מטרה, גם קצה הפיפטה וגם חוט הליטוש צריכים להיות בפוקוס ובשדה הראייה. אם לא, התאם את גובה הנימה. מכיוון שלא ניתן לכוונן את מיקום הפיפטה, קצה הפיפטה והחוט צריכים להיות בצדדים הנגדיים של שדה הראייה.
הימנע ממיקום קצה הפיפטה קרוב מדי לחוט מכיוון שהוא יתרחב ככל שהוא מתחמם ועלול להיתקל בפיפטה שלך. לאחר שהקצה והחוט ממוקמים כראוי, סובב את השסתום על מנת לכוון אוויר בלחץ לתוך הפיפטה ולחמם את קצה הפיפטה עד שהמתחדד מאחורי הקצה מתחיל להתנפח כלפי חוץ. עצור את החימום לפני שהקצה מתנפח בצורה נרחבת מדי.
נדרשים ניסויים כדי לקבוע את המרחק, החום והזמן המתאימים לצורה הרצויה. כשלב אופציונלי, ניתן גם ללטש את הקצה בהיעדר לחץ על מנת להקטין את קוטר פתח הקצה. כמו כן, זכור כי ניתן לחזור על שלבי הליטוש הללו עד לסדר.
כוונן גם את הצורה וגם את הממדים של קצה הפיפטה. בסיום הליטוש. כבה את נקודת הלחץ את קצה הפיפטה בכיוון בטוח.
הסר את הפיפטה והנח אותה בקופסת אחסון נקייה בה היא תהיה מוגנת מפני אבק. למען בטיחות המעבדה, הקפד לכבות את הלחץ לפני הסרת הפיפטה. אחרת, ניתן להוציא אותו ממחזיק הפיפטה.
לאחר ההסרה, זה עתה הראינו לך כיצד ללחוץ על פיפטות פוליש להקלטות מהדק תיקון משופרות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לצפות את סליל הליטוש בזכוכית בטמפרטורת התכה גבוהה על מנת למזער את שקיעת המתכת המאודה על הפיפטות. ולנקוט משנה זהירות בזמן שפיפטות חשופות לאוויר בלחץ.
ודא שהפיפטה מוחזקת היטב במחזיק ולכבות את האוויר לפני הוצאת הפיפטה מהמחזיק. אז זהו. תודה שצפית.
ליטוש לחץ שמח ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מדריך זה מפרט את שינוי צורתן של מיקרופיפטות זכוכית באמצעות חום ולחץ אוויר. תהליך זה מאפשר להרחיב את הקיצוף (taper) מבלי להגדיל את פתח הקצה, דבר החיוני להשגת הקלטות עם רעש נמוך ביישומים של תאים קטנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ייצור מיקרופיפטות
רקע
- מיקרופיפטות זכוכית הן כלים חיוניים בהקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
- התנגדות נמוכה יותר של הפיפטה נחוצה להשגות הקלטות באיכות גבוהה.
- שינוי הצורה יכול לשפר את הביצועים ביישומים שונים.
- טכניקה זו מועילה במיוחד להקלטות של תאים קטנים.
מטרת המחקר
- לספק שיטה לעיצוב מיקרופיפטות מזכוכית.
- להפחית את התנגדות הפיפטה ללא הגדלת פתח הקצה.
- לשפר את איכות ההקלטות מתאים קטנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקום חוד הפ pipette בקרבת סיב ליטוש בהגדלה גבוהה.
- הפעלת לחץ אוויר וחום להרחבת חוד ה-pipette.
- כיבוי החום להשגת פתח חוד קטן יותר.
- התאמות סופיות על ידי כיבוי הלחץ והחום.
תוצאות עיקריות
- ניתן לעצב מחדש את קצה הפיפטה לצורה קהה ביעילות.
- מתקבלת התנגדות נמוכה יותר ללא הגדלת גודל הקצה.
- שיטה זו משפרת את איכות ההקלטה מתאים קטנים.
- מדגימה גישה מעשית לשינוי מיקרו-פיפטות.
מסקנות
- עיצוב מיקרופיפטות מזכוכית הוא טכניקה בעלת ערך במחקרים בתחום מדעי העצבים.
- תכנון משופר של הפיפטה מוביל לאיכות נתונים טובה יותר.
- ניתן להחיל שיטה זו במגוון מחקרים אלקטרופיזיולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ליטוש פיפטות באמצעות לחץ מפחית את ההתנגדות החשמלית בהקלטות patch-clamp מבלי לשנות את קוטר הקצה, ובכך מאפשר מדידות בעלות נאמנות גבוהה יותר של תעלות יונים מאוכלוסיות נוירונליות קטנות. שיפור טכני זה תומך בתיקוף מטרות בתהליכי גילוי תרופות למדעי המוח על ידי שיפור יחסי האות-רעש במבדקים אלקטרופיזיולוגיים. איכות הקלטה משופרת מגבירה את רמת הביטחון החזיונית במחקרים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של עירור נוירונלי ותפקוד סינפטי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של תפקוד תעלות יונים בנוירונים בעלי קוטר קטן, אשר הם קריטיים עבור יעדים לטיפול בכאב נוירופתי ובאפילפסיה.
- ערך תפעולי: מפחית שונות בהקלטות של תעלה בודדת על ידי מזעור רעשים המושרים מהפיפטה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר גאומטריות סטנדרטיות של פיפטות עבור פאנלים ניתנים לשחזור של סריקה אלקטרופיזיולוגית.
- ערך תפעולי: תואם למיקרו-פיפטות מזכוכית רכה וקשה, מה שמאפשר תכנון גמיש של בדיקות עבור סוגי מטרות שונות.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: תומך ביישומים של patch-clamp עם נקבים על ידי יצירת קצוות קהים המגבירים את היווצרות בועות ממברנה (membrane blebs) עבור חומרים מחוררים אנטיביוטיים.
- ערך תפעולי: מאריך את משך ההקלטה בתרביות נוירונליות ראשוניות, ובכך משפר את התפוקה עבור מחקרי אופטימיזציה של תרכובות מובילות.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת בזרימות עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהן פנוטיפוּג אלקטרופיזיולוגי מסייע בבחירת המטרה ובאפיון של תרכובות מובילות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת תיקוף תפקודי של מטרות ערוצי יונים במודלים נוירונליים הרלוונטיים למחלה.
- סריקה: מספקת פיפטות בעלות התנגדות נמוכה לסריקת תרכובות בדיוק גבוה בפלטפורמות patch-clamp.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של זרם ומוליכות עם יציבות אות משופרת.
- מחקר תרגומי: מקלה על ביצוע הקלטות ארוכות (longitudinal) בנתחים אקוטים ובנוירונים בתרבית עבור מידול פרמקוקינטיקה-פרמקודינמיקה.
- שימוש חוזר ארגוני: דורשת שדרוג microforge בלבד, מה שהופך אותה לשיפור בר-הרחבה ובעלות נמוכה לתשתיות אלקטרופיזיולוגיה קיימות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את מידת הוודאות של תיקוף המטרה באמצעות פנוטיפים אלקטרופיזיולוגיים נקיים יותר.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור של הבדיקה בין אתרים ומבצעים על ידי סטנדרטיזציה של גאומטריית הפיפטה.
- ערך אסטרטגי: מפחית תוצאות שגויות שליליות בסריקת תעלות יונים על ידי מזעור רעשים טכניים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות go/no-go בתוכניות פרה-קליניות המטרות עוררות עצבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במיקרופיפטים ובאלקטרופיזיולוגיה.
- נחוץ מיקרופורג' (microforge) עם שסתום לחץ גבוה, פילמנט חימום ואופטיקה להגדלה.
- דורש סטנדרטיזציה של פרמטרי הלחץ, החום והתזמון בין משתמשים שונים.
- חובה להתחשב בהבדלים בין סוגי הזכוכית (סודה-lime לעומת בורוסיליקט) בתגובת הליטוש.
- מוגבל בשל הצורך במיקום ידני של הקצה ובמיומנות המפעיל כדי למנוע התרחבות יתר.
