לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים
22 באוקטובר 2008
זהו מדריך כדי לשנות את הצורה של micropipettes זכוכית. באופן ספציפי, באמצעות חום ולחץ אוויר להתחדד הוא התרחב מבלי להגדיל את פתיחת קצה, המוביל פיפטה התנגדות נמוכה יותר. זה קריטי כדי להשיג הקלטות רעש נמוך של תאים קטנים אך שימושית ביישומים רבים.
ההליך מתחיל במיקום קצה הפיפטה סמוך לסיב הליטוש בהגדלה של 100 פעמים. לאחר מכן, הפעל את לחץ האוויר והחימום. הסיב.
קצה הפיפטה יתרחב ויהפוך לקצה בעל צורה קהה. כבו את החימום כדי לקבל פתח קטן יותר בקצה. כבו שוב את הלחץ ואת החימום.
שלום, אני ברנדון ג'ונסון מהמעבדה של ד"ר מיראם גודמן במחלקה לפיזיולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת סטנפורד. היום נראה לכם פרוצדורה להליטש בלחץ (pressure polishing) של פיפטות לטכניקת patch. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור תעלות יונים וקטעי ממברנה (membrane patches) בנוירונים של C. elegans.
אם כן, בואו נתחיל. הוציאו סט של שש עד 10 פיפטות למדידה (patch pipettes). ניתן להתייעץ עם מומחה מקומי או לצפות בניסוי המומחז שלנו להכנת פיפטות למדידה ואלקטרודות חדות באמצעות מכשיר משיכה תכנותי (programmable puller) לקבלת עזרה.
כדי להתחיל בהליך, הגדירו לחץ בקו האוויר הדחוס לכ-40 PS.I, ולאחר מכן חברו את קו האוויר הדחוס לשסתום בקרה ארבע-דרכי. חברו קטע של צינור פלסטיק לשסתום הארבע-דרכי והדקו מחזיק פיפטה ללחץ גבוה לקצה החופשי של צינור הפלסטיק. השתמשו במערכת micro forge כדי לבצע את הליטוש.
אנו משתמשים בערכה Ccpm two מבית LA Scientific. מתקן זה כולל מחזיק פיפט ללחץ גבוה, חוט חימום מפלטינה הנשלט באמצעות דוושה ומיקרוסקופ המצויד בעדשות אוויר עם מרחק עבודה ארוך בהגדלות נמוכה וגבוהה של 10 เท่า ו-100 เท่า. עדשות אלו הן אידיאליות מכיוון שביכולת לצפות בפתח הפיפט במהלך הפרוטוקול חשיבות מכרעת.
בשלב הבא, ודאו ששסתום הלחץ נמצא במצב כבוי. לאחר מכן, מקמו פיפטה במחזיק הפיפטות והדקו את החיבור עד להדקה ידנית לשם בטיחות במעבדה. ודאו שהפיפטה מוחזקת בבצורה יציבה במחזיק הפיפטות.
אחרת, לחץ האוויר יגרום לדחיפת הפיפטה מחוץ למחזיק. כשלב אופציונלי, ניתן לצפות את הפיפטה במבודל הידרופובי כגון שעווה כדי להפחית את הקיבוליות ולשפר את מאפייני הרעש. כעת הנח את הפיפטה במחזיק בעמדת המיקרו-פורג' (micro forge), ומקם את מחזיק הפיפטה עלבמת המיקרוסקופ כך שגם הקצה וגם חוט הליטוש יהיו גלויים בהגדלה נמוכה של 10x במיקרו-פורג'.
קרבו את הקצה למרחק של כ-50 מיקרון מהסיב, ולאחר מכן עברו לעדשה אובייקטיבית בהספק גבוה של 100; הן קצה הפ pipette והן סיב הליטוש צריכים להיות ממוקדים ובתוך שדה הראייה. אם לא, כווננו את גובה הסיב. מכיוון שלא ניתן לכוונן את מיקום ה-pipette, קצה ה-pipette והסיב צריכים להימצא בצדדים מנוגדים של שדה הראייה.
הימנעו ממיקום קצה הפיפטה קרוב מדי לסיב, כיוון שהוא יתרחב בעת החימום ועלול להיתקל בפיפטה. לאחר שקצה הפיפטה והסיב ממוקמים כראוי, סובבו את השסתום כדי להזרים אוויר בלחץ אל תוך הפיפטה וחממו את קצה הפיפטה עד שהחלק המצר (taper) מאחורי הקצה מתחיל להתנפח כלפי חוץ. הפסיקו את החימום לפני שקצה הפיפטה מתנפח באופן מוגזם.
נדרשת התנסות כדי לקבוע את המרחק, החום והזמן המתאימים לקבלת הצורה הרצויה. כשלב אופציונלי, ניתן גם ללטש את הקצה ללא הפעלת לחץ כדי להקטין את קוטר פתח הקצה. כמו כן, יש לזכור שניתן לחזור על שלבי ליטוש אלו לצורך דיוק נוסף.
כווננו הן את הצורה והן את הממדים של קצה הפיפטה. כאשר הליטוש מסתיים, כבו את הלחץ והפנו את קצה הפיפטה לכיוון בטוח.
הוצא את הפיפט והנח אותו בקופסת אחסון נקייה שבה יהיה מוגן מאבק. למען בטיחות המעבדה, וודא כי הלחץ כבוי לפני הוצאת הפיפט. אחרת, הוא עלול להידחף החוצה מתושבת הפיפט.
בסיום התהליך, הצגנו בפניכם כיצד לבצע ליטוש בלחץ (pressure polish) לפיפטות לצורך שיפור הקלטות patch clamp. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לצפות את סליל הליטוש בזכוכית בעלת טמפרטורת התכה גבוהה כדי לצמצם את שיקוע המתכת המאודה על הפיפטות, ולנקוט משנה זהירות בעוד הפיפטות חשופות לאוויר בלחץ.
וודאו שהפיפט מוחזק בבטחון במעמד וכבו את אספקת האוויר לפני הוצאת הפיפט מהמעמד. זהו, תודה שצפיתם.
הצלחה בליטוש בלחץ ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מדריך זה מפרט את שינוי צורתן של מיקרופיפטות זכוכית באמצעות חום ולחץ אוויר. תהליך זה מאפשר להרחיב את הקיצוף (taper) מבלי להגדיל את פתח הקצה, דבר החיוני להשגת הקלטות עם רעש נמוך ביישומים של תאים קטנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ייצור מיקרופיפטות
רקע
- מיקרופיפטות זכוכית הן כלים חיוניים בהקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
- התנגדות נמוכה יותר של הפיפטה נחוצה להשגות הקלטות באיכות גבוהה.
- שינוי הצורה יכול לשפר את הביצועים ביישומים שונים.
- טכניקה זו מועילה במיוחד להקלטות של תאים קטנים.
מטרת המחקר
- לספק שיטה לעיצוב מיקרופיפטות מזכוכית.
- להפחית את התנגדות הפיפטה ללא הגדלת פתח הקצה.
- לשפר את איכות ההקלטות מתאים קטנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקום חוד הפ pipette בקרבת סיב ליטוש בהגדלה גבוהה.
- הפעלת לחץ אוויר וחום להרחבת חוד ה-pipette.
- כיבוי החום להשגת פתח חוד קטן יותר.
- התאמות סופיות על ידי כיבוי הלחץ והחום.
תוצאות עיקריות
- ניתן לעצב מחדש את קצה הפיפטה לצורה קהה ביעילות.
- מתקבלת התנגדות נמוכה יותר ללא הגדלת גודל הקצה.
- שיטה זו משפרת את איכות ההקלטה מתאים קטנים.
- מדגימה גישה מעשית לשינוי מיקרו-פיפטות.
מסקנות
- עיצוב מיקרופיפטות מזכוכית הוא טכניקה בעלת ערך במחקרים בתחום מדעי העצבים.
- תכנון משופר של הפיפטה מוביל לאיכות נתונים טובה יותר.
- ניתן להחיל שיטה זו במגוון מחקרים אלקטרופיזיולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ליטוש פיפטות באמצעות לחץ מפחית את ההתנגדות החשמלית בהקלטות patch-clamp מבלי לשנות את קוטר הקצה, ובכך מאפשר מדידות בעלות נאמנות גבוהה יותר של תעלות יונים מאוכלוסיות נוירונליות קטנות. שיפור טכני זה תומך בתיקוף מטרות בתהליכי גילוי תרופות למדעי המוח על ידי שיפור יחסי האות-רעש במבדקים אלקטרופיזיולוגיים. איכות הקלטה משופרת מגבירה את רמת הביטחון החזיונית במחקרים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של עירור נוירונלי ותפקוד סינפטי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של תפקוד תעלות יונים בנוירונים בעלי קוטר קטן, אשר הם קריטיים עבור יעדים לטיפול בכאב נוירופתי ובאפילפסיה.
- ערך תפעולי: מפחית שונות בהקלטות של תעלה בודדת על ידי מזעור רעשים המושרים מהפיפטה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר גאומטריות סטנדרטיות של פיפטות עבור פאנלים ניתנים לשחזור של סריקה אלקטרופיזיולוגית.
- ערך תפעולי: תואם למיקרו-פיפטות מזכוכית רכה וקשה, מה שמאפשר תכנון גמיש של בדיקות עבור סוגי מטרות שונות.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: תומך ביישומים של patch-clamp עם נקבים על ידי יצירת קצוות קהים המגבירים את היווצרות בועות ממברנה (membrane blebs) עבור חומרים מחוררים אנטיביוטיים.
- ערך תפעולי: מאריך את משך ההקלטה בתרביות נוירונליות ראשוניות, ובכך משפר את התפוקה עבור מחקרי אופטימיזציה של תרכובות מובילות.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת בזרימות עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהן פנוטיפוּג אלקטרופיזיולוגי מסייע בבחירת המטרה ובאפיון של תרכובות מובילות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת תיקוף תפקודי של מטרות ערוצי יונים במודלים נוירונליים הרלוונטיים למחלה.
- סריקה: מספקת פיפטות בעלות התנגדות נמוכה לסריקת תרכובות בדיוק גבוה בפלטפורמות patch-clamp.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של זרם ומוליכות עם יציבות אות משופרת.
- מחקר תרגומי: מקלה על ביצוע הקלטות ארוכות (longitudinal) בנתחים אקוטים ובנוירונים בתרבית עבור מידול פרמקוקינטיקה-פרמקודינמיקה.
- שימוש חוזר ארגוני: דורשת שדרוג microforge בלבד, מה שהופך אותה לשיפור בר-הרחבה ובעלות נמוכה לתשתיות אלקטרופיזיולוגיה קיימות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את מידת הוודאות של תיקוף המטרה באמצעות פנוטיפים אלקטרופיזיולוגיים נקיים יותר.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור של הבדיקה בין אתרים ומבצעים על ידי סטנדרטיזציה של גאומטריית הפיפטה.
- ערך אסטרטגי: מפחית תוצאות שגויות שליליות בסריקת תעלות יונים על ידי מזעור רעשים טכניים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות go/no-go בתוכניות פרה-קליניות המטרות עוררות עצבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במיקרופיפטים ובאלקטרופיזיולוגיה.
- נחוץ מיקרופורג' (microforge) עם שסתום לחץ גבוה, פילמנט חימום ואופטיקה להגדלה.
- דורש סטנדרטיזציה של פרמטרי הלחץ, החום והתזמון בין משתמשים שונים.
- חובה להתחשב בהבדלים בין סוגי הזכוכית (סודה-lime לעומת בורוסיליקט) בתגובת הליטוש.
- מוגבל בשל הצורך במיקום ידני של הקצה ובמיומנות המפעיל כדי למנוע התרחבות יתר.
