Name: counting bacteria with dilution plates
Uploaded: 2023-04-30T07:09:34.000Z
Duration: 10 min 53 s
Channel: JoVE

1. Configurazione
<ol><li>Un diagramma di flusso che elenca tutti i materiali, il protocollo sperimentale graduale e il metodo per scartare le forniture dovrebbe essere scritto in un quaderno di laboratorio e tenuto vicino allo spazio di lavoro sperimentale.</li>
	<li>Gli spazi di lavoro devono essere sterilizzati con un antisettico appropriato (70% di etanolo) e lo sperimentatore dovrebbe mitigare il rischio di contaminazione indossando indumenti da laboratorio puliti che li proteggano anche dalle anomalie di esposizione. Gli indumenti adatti includono, ma non sono limitati a un cappotto da laboratorio, guanti in lattice o nitrile, google, respiratori e scarpe chiuse. È fondamentale mantenere la tecnica asettica in ogni momento.</li>
	<li>Preparare 90 ml di soluzione salina al 0,45%. Utilizzando un cilindro graduato pulito, misurare 90 ml di acqua sterile e trasferirlo in un matraccio Erlenmeyer pulito etichettato 0,45% soluzione salina. Pesare .405 g di cloruro di sodio (Sigma-Aldrich NaCl S9888) e aggiungerlo al matraccio etichettato 0,45% salino. Ruota ripetutamente fino a quando nessun soluto rimane visibile.</li>
	<li>Al termine, lo sperimentatore dovrebbe ri-sterilizzare tutte le superfici e scartare eventuali organismi indesiderati, scorte di diluenti, piastre di Petri o anelli di inoculazione usa e getta secondo le linee guida OSHA. Gli indumenti da laboratorio possono essere rimossi prima di lavarsi le mani.</li>
</ol>2. Preparazione dei supporti
<ol><li>Selezionare i mezzi appropriati per la coltivazione di un organismo desiderato. Nella maggior parte degli scenari, un brodo consentirebbe una crescita batterica sufficiente. Poiché qui si desiderano organismi di un protocollo Winogradsky, una colonna composta da carbonato di calcio, zolfo, cellulosa e fango è stata assemblata e lasciata indisturbata per 7 giorni. La colonna con nome è separata in sezioni aerobiche, microaerofile e anaerobiche.</li>
	<li>Scegli un mezzo appropriato per placcare l'organismo di interesse. L'integrazione di mezzi liquidi con agar di grado microbiologico è tipicamente impiegata come agente solidificante. LB medium/agar è sufficiente quando si raccolgono campioni dalle regioni aerobica, microaerofila e anaerobica della colonna prenaminata. Nota: i campioni della regione microaerofila non sono stati raccolti per questa procedura. Tuttavia, questi organismi dovrebbero essere coltivati in barattoli di candele. L'introduzione di una candela in questa camera di coltivazione prima della sigillatura crea un ambiente a basso contenuto di ossigeno adatto alla proliferazione microaerofila.</li>
	<li>Poiché desideriamo preparare 250 ml, utilizzare fiaschi Erlenmeyer da 500 ml (o più grandi) per evitare l'ebollizione durante l'autoclave. Etichetta uno "Brodo" e l'altro "Agar".</li>
	<li>Determinare la quantità di supporti necessari per creare ogni soluzione seguendo le raccomandazioni di concentrazione del produttore. LB Agar, usato qui, viene preparato combinando 25g / L con acqua ultrapura. Il nostro volume di 250 mL richiede una soluzione di 6,25 LB Agar/250 mL di acqua. Allo stesso modo, LB Broth viene preparato combinando lo stesso rapporto di LB Broth e acqua. Poiché non è integrato con un agente solidificante, non si indurirà quando raffreddato.</li>
	<li>Pesare il supporto e mescolarlo con acqua in proporzioni coerenti con le raccomandazioni del produttore. Aggiungere 6,25 g di LB Agar a un pallone etichettato "Agar" e 6,25 g di LB Broth a un pallone etichettato "Brodo". Aggiungere 250 ml di acqua ultrapura a ciascun pallone.</li>
	<li>Avvolgere un foglio di alluminio su ogni pallone e utilizzare un'autoclave per sterilizzare i mezzi per un minimo di 15 minuti a 121 ° C, 15 psi.</li>
	<li>Utilizzando un guanto o un cuscinetto resistente al calore, rimuovere i palloni dall'autoclave al termine del ciclo e metterli in un bagno d'acqua a 40-50 ° C.</li>
	<li>Una volta raggiunta la temperatura appropriata, versare il contenuto del matraccio etichettato "Brodo" in un Erlenmeyer da 250 ml o in un matraccio a fondo tondo. Etichettare il matraccio da 250 ml"soluzione 0".</li>
	<li>Ottenere piastre di Petri sterili da 10, 100 mm x 15 mm ed etichettarle con la data, il nome, il tipo di mezzo utilizzato e la zona della colonna Winogradsky da cui verranno raccolti gli organismi.</li>
	<li>Rimuovere il pallone etichettato "Agar" dal bagno d'acqua e iniziare a versare in ciascuna delle 10 piastre di Petri. Non più di 15 ml dovrebbero essere aggiunti a ciascun piatto. Questo può anche essere eseguito con un pipettor e una pipetta sierologica da 25 ml per migliorare la precisione. Utilizzare una punta di pipetta sterile per rimuovere eventuali bolle presenti, quindi coprire con i coperchi della piastra e lasciare solidificare durante la notte.</li>
</ol>3. Preparazione del diluente
<ol><li>Preparare dieci provette in grado di conservare 20 ml o più in un rack ed etichettarle T1-T10. Ogni numero di tubo è coerente con il fattore di diluizione a cui corrisponde (cioè T4 = 1x10-4 o 0,0001 o 1/10.000 di concentrazione di stock).</li>
	<li>Pipettare 9 mL di soluzione salina allo 0,45% in ciascuna delle 10 provette.</li>
	<li>Gli spazi vuoti salini sono ora pronti per essere sterilizzati in autoclave. Utilizzare un foglio di alluminio per coprire ciascuna delle 10 provette e quindi trasferirle su un rack per provette compatibile con l'autoclave. Sterilizzare per un minimo di 15 minuti a 121°C, 15 psi.</li>
	<li>Rimuovere gli spazi vuoti utilizzando guanti resistenti al calore e lasciare raffreddare. Coprire e conservare a 4°C fino a quando i tubi non hanno raggiunto la temperatura ambiente o quando sono freddi al tatto.</li>
</ol>4. Coltivazione dell'organismo bersaglio
<ol><li>Inoculare"soluzione 0"con una singola colonia da una piastra precedentemente striata o 50 μL di un brodo congelato. Lasciare all'organismo bersaglio il tempo di replicarsi posizionando la"soluzione 0"inoculata in un incubatore a 37°C durante la notte con agitazione (se necessario). (Nota: il pallone deve essere coperto per evitare contaminazioni. Se l'organismo bersaglio è aerobico, utilizzare una garza sterile e tappi di cotone per prevenire la contaminazione. Se si valutano le regioni della colonna Winogradsky, è sufficiente rimuovere 1 grammo da ciascuna zona desiderata (aerobica e anaerobica ai fini di questo studio) e risospentare in T1 prima di procedere al passaggio 5.3.</li>
</ol>5. Diluizione seriale
<ol><li>Ottenere il pallone etichettato "Brodo nutriente" dall'incubatrice e agitare vigorosamente.</li>
	<li>Pipettare 1 mL di"soluzione 0"nella provetta etichettata T1. Vortice T1. Se si valutano gli espianti di Winogradsky, pesare 1 grammo della zona desiderata e aggiungerlo a T1 prima del vortice. (Nota: qui viene utilizzato 1 mL per semplicità- possono essere utilizzati anche volumi più piccoli o più grandi di diluente).</li>
	<li>Rimuovere 1 mL dalla provetta T1 e aggiungerlo alla provetta T2. Vortice T2.</li>
	<li>Rimuovere 1 mL dalla provetta T2 e aggiungerlo alla provetta T3. Vortice T3.</li>
	<li>Rimuovere 1 mL dalla provetta T3 e aggiungerlo alla provetta T4. Vortice T4.</li>
	<li>Rimuovere 1 mL dalla provetta T4 e aggiungerlo alla provetta T5. Vortice T5.</li>
	<li>Rimuovere 1 mL dalla provetta T5 e aggiungerlo alla provetta T6. Vortice T6.</li>
	<li>Rimuovere 1 mL dalla provetta T6 e aggiungerlo alla provetta T7. Vortice T7.</li>
	<li>Rimuovere 1 mL dalla provetta T7 e aggiungerlo alla provetta T8. Vortice T8.</li>
	<li>Rimuovere 1 mL dalla provetta T8 e aggiungerlo alla provetta T9. Vortice T9.</li>
	<li>Rimuovere 1 mL dalla provetta T9 e aggiungerlo alla provetta T10.</li>
</ol>6. Placcatura diffusa
<ol><li>Pipetta 100 μL di un campione diluito da T1 direttamente su una capsula di Petri. Questo passaggio può essere, ma non è necessario che sia, ripetuto per ogni tubo.</li>
	<li>Ottenere un'asta di diffusione sterile e monouso o una fiamma sterilizzare un'asta di diffusione del vetro. In senso orario/antiorario, far scivolare la parte orizzontale dell'asta di diffusione per distribuire equamente il campione all'interno della capsula di Petri.</li>
	<li>Ripetere l'operazione per ogni zona della colonna Winogradsky da valutare.</li>
	<li>Incubare le piastre in un incubatore a 37°C per 24 ore. Per gli organismi anaerobici, utilizzare una camera anaerobica.</li>
</ol>7. Striature
<ol><li>Selezionare una diluizione appropriata dell'organismo bersaglio. Ad esempio,la soluzione 4 produrrà una diluizione di 1/10.000 della concentrazione iniziale. Tipicamente, le diluizioni di 1/1.000th (T3/Solution), 1/1.000.000th (T6/Solution6) e 1/1.000.000.000th (T9/Solution9) vengono valutate per enumerare i microbi.</li>
	<li>Utilizzando un anello di inoculazione monouso sterile in plastica o un anello di inoculazione in metallo riutilizzabile che è stato sotto tiro per non meno di 10 secondi, immergersi nella soluzione desiderata dal passaggio 5. I circuiti di inoculazione calibrati devono trasferire 0,01 ml. (Attenzione: non lasciare che il loop fiammato contatti i batteri immediatamente dopo la rimozione dal calore)</li>
	<li>Sollevare leggermente il coperchio della capsula di Petri su un lato in modo che solo l'anello inoculante possa accedere all'agar. Fai scivolare il loop inoculante attraverso la parte superiore del supporto a zig-zag facendo attenzione a non compromettere l'agar. Abbassare il coperchio della capsula di Petri.</li>
	<li>Utilizzare un nuovo ciclo di inoculazione monouso o risterizzare il ciclo riutilizzabile.</li>
	<li>Ruotare la piastra di circa 1/3 (~118°) e ridurre la frequenza del movimento a zig-zag.</li>
	<li>Ancora una volta, utilizzare un nuovo loop usa e getta o ri-sterilizzare un loop metallico prima di ruotare un tempo finale e ridurre ancora una volta la frequenza a zig-zag. Abbassare il coperchio della capsula di Petri.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 7.2 - 7.6 fino a quando almeno tre piastre di Petri sono state striate per tre diverse diluizioni, utilizzando un nuovo loop usa e getta o riaccheggiando un loop riutilizzabile (Figura 2).</li>
	<li>Mettere le piastre di Petri striate in un'incubatrice a 37 ° C durante la notte. Per gli organismi anaerobici, utilizzare una camera anerobica.</li>
</ol>8. Analisi dei dati e risultati
<ol><li>Le colture sono state raccolte dalle zone ossiche e anossiche di una colonna Winogradsky di 7 giorni. Queste zone sono adatte rispettivamente per anaerobi eterotrofici e ferro-ossidanti.</li>
	<li>Gli espianti a colonna sono stati diluiti in serie prima di striature o diffusione su piastre LB Agar.</li>
	<li>Streaking ha rivelato una popolazione mista da ciascuna delle zone Winogradsky valutate. Le piastre diffuse hanno prodotto risultati simili.</li>
	<li>Per calcolare CFU/mL o CFU/g, mediare il numero di colonie contate da tre piastre. Moltiplicare il numero medio di colonie per il fattore di diluizione e dividere per la quantità aliquota. Ad esempio, se una media di 65 colonie fosse contate su piastre inoculate con 0,1 mL disoluzione 6 (T6) la formula descritta in precedenza sarebbe pari a 650.000.000 CFU/mL.</li>
	<li>Le colonie isolate possono ora essere scelte da ciascuna piastra per l'uso in saggi di arricchimento per determinare l'identità delle specie.</li>
</ol>

L'enumerazione batterica e l'isolamento dei ceppi mediante placcatura richiedono concentrazioni gestibili di organismi bersaglio. Il successo della placcatura è quindi subordinato alla diluizione seriale. In quanto tali, le suddette tecniche rimangono la pietra angolare dell'esame e della sperimentazione microbiologica. Sebbene semplici per progettazione, i fattori di diluizione e la tecnica di placcatura possono essere modificati dallo sperimentatore per rafforzare i risultati senza compromettere l'integrità di ciascun metodo. Tracciare le quattro fasi della crescita batterica può essere utile quando si caratterizzano i microbi desiderati. Queste fasi, ritardo, log, stazionarie e morte, sono caratterizzate da cambiamenti nella replicazione batterica. La fase di ritardo presenta una crescita lenta dovuta all'adattamento fisiologico, la fase logarittiva è il periodo di massima proliferazione con un aumento esponenziale delle cellule vitali, la fase stazionaria viene poi raggiunta a causa di limitazioni ambientali e accumuli di tossine, prima della fase di morte in cui la conta cellulare inizia a diminuire. Ciò può essere ottenuto diluendo in serie (o diluendo in 1 fase per evitare confusione)Soluzione 0 ogni ora per un totale di 8 ore, a partire dal tempo0 (la soluzione 0 deve essere restituita a un incubatore vibrante dopo ogni diluizione). Calcolare il log10 di CFU/ml per un singolo diluente di Tempo0 e tracciare sull'asse Y. Ripetere questo calcolo per il tempocampione 1 (assicurarsi di calcolare CFU/mL utilizzando lo stesso fattore di diluizione del tempo0). Ripetete fino a quando ogni volta (Tempo1-Tempo8) vengono tracciati sull'asse X.

diluizioni seriali e piastratura: la conta microbica

Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

Fonte: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1e Christopher P. Corbo1 1 Dipartimento di Scienze Biologiche, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301
La valutazione quantitativa dei procarioti può essere onerosa data la loro abbondanza, la propensione alla proliferazione esponenziale, la diversità delle specie all'interno di una popolazione e le specifiche esigenze fisiologiche. Ad aggravare questa sfida, è la natura a quattro fasi in cui i batteri si replicano (ritardo, log, stazionario e morte). La capacità di stimare con precisione la concentrazione di microrganismi è necessaria per il successo dell'identificazione, dell'isolamento, della coltivazione e della caratterizzazione (6). Pertanto, i microbiologi hanno impiegato la diluizione seriale e varie tecniche di placcatura per oltre un secolo per quantificare in modo affidabile la carica batterica e virale in ambienti di laboratorio clinici, industriali, farmaceutici e accademici (2,4,6). Le descrizioni di questa metodologia apparvero per la prima volta nel 1883 quando lo scienziato e medico tedesco Robert Koch pubblicò il suo lavoro sugli agenti infettivi che causano malattie (2). Spesso indicato come il padre della batteriologia moderna, le tecniche prenominate di Koch sono diventate il gold standard per l'enumerazione di microrganismi, coltivabili o meno, in tutto il mondo.
La diluizione seriale è una riduzione sistematica di un'entità nota o sconosciuta (un soluto, un organismo, ecc.) attraverso la successiva risos sospensione di una soluzione iniziale(soluzione 0) in volumi fissi di un diluente liquido (spazi vuoti). Questi spazi vuoti di solito consistono di 0,45% di soluzione salina, anche se la composizione può essere variata (7). Mentre uno sperimentatore può scegliere qualsiasi volume per ogni diluente, è più spesso un multiplo di 10, facilitando la riduzione logaritmica del campione. Ad esempio, lasoluzione 0 contiene un totale di 100 cellule di E. coli sospese in 10 ml di brodo nutritivo. Se 1 mL disoluzione 0 viene rimosso e aggiunto a 9 mL di soluzione salina (diluente1), la nuovasoluzione (soluzione 1) conterrebbe 1/10 della concentrazione iniziale di E. coli. In questo esempio, la nuova soluzione(soluzione 1) conterrebbe 10 cellule di E. coli. Ripetendo questo processo rimuovendo 1 mL disoluzione 1 e aggiungendolo ad altri 9 mL di soluzione salina (diluente2)si produrrebbela soluzione 2, contenente solo una singola cellula di E. coli. Poiché ogni nuova soluzione (9 mL di diluente + 1 mL di soluzione) contiene un totale di 10mL, possiamo concludere che il fattore di diluizione per questa riduzione è 10 o che si è tratta di una diluizione seriale 10 volte (Figura 1). Poiché abbiamo iniziato solo con 100 cellule in questo esempio e stiamo diluendo di un fattore 10, sono necessari solo due passaggi per raggiungere la concentrazione minima assoluta di 1 cellula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig1.jpg"> Figura 1: Diluizione seriale di una soluzione stock. Un'aliquota di 1 mL della soluzione stock(soluzione 0) viene aggiunta al tubo 1 che contiene 9 mL di soluzione salina allo 0,45% (dilent1); il prodotto di questa miscela è lasoluzione 1. Ripetere aliquotando 1 mL dellasoluzione appena creata 1 e aggiungendola al tubo 2. L'aliquotazione e la ricaspensione continuano in questo modo fino al raggiungimento del tubo finale, diluendo la concentrazione di stock di un fattore di 10 ciascuno ad ogni passo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La diluizione seriale è la tecnica più semplice per ottenere concentrazioni gestibili di un organismo desiderato ed è completata da striature e spalmature di Petri, solo due delle molte tecniche di placcatura utilizzate dai microbiologi. Questo vantaggio di questo approccio è che lo sperimentatore può raccogliere ceppi puri di una singola specie o ceppi separati da una popolazione mista (7). La striatura si ottiene introducendo un organismo in un mezzo solido (generalmente costituito da agarose) su cui crescerà se sono disponibili i nutrienti appropriati. Spazzare delicatamente un ciclo inoculante sterile attraverso il mezzo (in modo che rimanga una striscia sottile) in un modello sinusoidale rigido distribuirà l'organismo proporzionalmente alla frequenza della forma d'onda dello sperimentatore. Dividere la capsula di Petri in terzi o quarti (striscia di quadrante) e diminuire la frequenza di ogni striscia quando viene inserita una nuova regione del piatto ridurrà gradualmente il numero di microrganismi che possono occupare quella regione, producendo singole colonie invece di un prato batterico non quantificabile. La placcatura diffusa non diluisce ulteriormente i campioni; uno spandi vetro sterile viene utilizzato per distribuire un'aliquota di mezzi di sospensione su un'intera capsula di Petri (Figura 2). Le colonie che crescono sulla piastra diffusa derivano da una singola cellula e ogni colonia sul piatto può essere contata per stimare il numero di unità formanti colonie per millilitro (CFU) in una data sospensione, rappresentata come CFU/mL (6) (Figura 3) L'agar morbido e la replica placcatura sono variazioni delle tecniche di cui sopra e consentono l'isolamento del batteriofago e lo screening mutante, rispettivamente (1,7).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig2.jpg"> Figura 2: Striature di piastre per l'enumerazione batterica e l'isolamento del ceppo. Etichettare il fondo di una capsula di Petri con informazioni di identificazione (nome dei batteri, data, supporto) e dividere in terzi. Dopo aver selezionato una diluizione appropriata del campione di riserva, prendere un anello di inoculazione sterile (monouso o fiammato) e immergerlo nella provetta (qui, T3). Sollevare leggermente il coperchio della capsula di Petri su un lato in modo che solo l'anello inoculante possa accedere all'agar. Fai scivolare il loop inoculante attraverso la parte superiore del supporto a zig-zag facendo attenzione a non compromettere l'agar. Ruotare la piastra di circa 1/3 (~118°) e ridurre la frequenza del movimento a zig-zag. Ruota un ultimo tempo e riduci ancora una volta la frequenza a zig-zag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig3.jpg"> Figura 3: Placcatura diffusa. 1 g della zona aerobica è stato sospenso in T1 e poi diluito in serie. Un'asta sterile di spargimento monouso in vetro o plastica viene utilizzata per distribuire l'inoculo in ogni piatto. Questo è stato ripetuto con 1 g della zona anaerobica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Come per le diluizioni seriali, viene utilizzata una scala logaritmica per esprimere la concentrazione dell'organismo. Il numero di colonie coltivate in piastre di Petri standard di 100 mm x15 mm può essere enumerato manualmente (o automatizzato con l'aiuto dell'elaborazione computazionale) identificando cluster isolati di crescita. I conteggi che ammontano a meno di 30 o superiore a 300 devono essere definiti rispettivamente come troppo pochi da contare (TFTC) o troppo numerosi da contare (TNTC). Nel caso di quest'ultimo, deve essere eseguita una diluizione seriale per ridurre la concentrazione prima di riaffermire una nuova capsula di Petri. Facendo la media del numero di colonie autonome identificate da tre piastre di Petri separate e moltiplicando la media per il fattore di diluizione si otterrà CFU/mL; tracciare il log10 di CFU/mL contro il tempo rivelerà il tempo medio di generazione dell'organismo (7).

Diluizioni seriali e piastratura: la conta microbica

Source: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1, and Christopher P. Corbo1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island ...

A volte, per identificare e studiare i batteri, è necessario prima isolarli e arricchirli da un campione. Ad esempio, i campioni ottenuti da una colonna di Winogradsky sono misti, il che significa che contengono più specie o ceppi di batteri, quindi studiare un singolo batterio o enumerare i diversi tipi presenti può essere difficile. A tal fine, le tecniche di diluizione e placcatura in serie sono tipicamente impiegate per quantificare in modo affidabile la carica batterica e isolare le singole colonie. La diluizione seriale è un processo attraverso il quale la concentrazione di un organismo, in questo esempio un batterio, viene sistematicamente ridotta attraverso una successiva risospensione in volumi fissi di diluente liquido. Di solito il volume del diluente è un multiplo di 10 per facilitare la riduzione logaritmica dell'organismo campione. Ad esempio, un grammo di sedimento viene prima rimosso dalla zona di interesse di Winogradsky e aggiunto a 10 millilitri di un mezzo liquido appropriato. Quindi, un millilitro di questa prima diluizione viene aggiunto a un altro tubo contenente nove millilitri di terreno. Il processo può essere ripetuto fino a quando non sono state preparate diverse concentrazioni di batteri. La diluizione seriale è la chiave per l'enumerazione dei batteri in questo esempio, poiché i campioni misti di una colonna di Winogradsky contengono un numero sconosciuto, spesso elevato, di batteri. Successivamente, la striatura e la placcatura diffusa consentono rispettivamente l'isolamento e l'enumerazione dei batteri all'interno di un campione. La striatura si ottiene introducendo un campione diluito in una sezione del mezzo solido integrato con sostanze nutritive, che viene diviso in terzi. Questo inoculo viene quindi distribuito su ciascun terzo della piastra a zig-zag. Poiché diverse sezioni della lastra sono striate, incrociandosi una sola volta dal campione precedente, il campione viene distribuito più sottilmente. Ciò significa che potrebbe essere necessario striare solo da una diluizione per ottenere singole colonie nelle sezioni successive. Dopo l'incubazione, le piastre striate consentono osservazioni della morfologia della colonia, informazioni che possono aiutare a differenziare tra diverse specie batteriche. In alternativa, se l'obiettivo principale è l'enumerazione dei batteri nel campione, si può utilizzare la placcatura diffusa. Nella placcatura diffusa, un'aliquota di un singolo campione viene distribuita uniformemente su tutta la superficie del mezzo solido. In genere, poiché non conosciamo il numero di batteri nel campione miscelato, viene realizzata una piastra di diffusione per ciascuna delle diluizioni o un campione rappresentativo di esse. Dopo l'incubazione, l'enumerazione può essere eseguita utilizzando queste piastre di diffusione. Tutte le piastre con un numero di colonie inferiore a 30 devono essere scartate, poiché i conteggi piccoli sono soggetti a un errore maggiore. Allo stesso modo, qualsiasi conteggio superiore a 300 dovrebbe essere scartato perché l'affollamento e la sovrapposizione delle colonie possono portare a una sottostima del conteggio delle colonie. Se il conteggio delle colonie di ciascuna di queste piastre rimanenti viene registrato e moltiplicato per il fattore di diluizione, e quindi diviso per il volume piastrato, si ottengono le unità formanti colonie, o CFU, per millilitro di sospensione. In questo video imparerete a valutare qualitativamente e quantitativamente un campione contenente un batterio noto e le comunità microbiche contenute in varie regioni di una colonna di Winogradsky tramite diluizione seriale, placcatura diffusa e placcatura a striature. Innanzitutto, indossa tutti i dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi camice da laboratorio, guanti e occhiali. Quindi, sterilizzare l'area di lavoro con etanolo al 70% e pulire la superficie. Quindi, raccogli due fiasche di Erlenmeyer da 500 millilitri ed etichetta un brodo e l'altro agar. Per preparare la soluzione di agar LB, mescolare circa 6,25 grammi di agar LB, tre grammi di agar tecnico e 250 millilitri di acqua distillata nel pallone etichettato come agar. Quindi, preparare il brodo LB unendo 2. 5 grammi di terreno LB e 100 millilitri di acqua distillata nel borraccia etichettato brodo. Dopo aver sterilizzato in autoclave i flaconi, utilizzare un guanto resistente al calore per rimuovere i palloni dall'autoclave e metterli a bagnomaria a 40-50 gradi Celsius. Una volta che i palloni sono a 50 gradi Celsius, preparare con cura tre aliquote da 100 millilitri della soluzione di brodo ed etichettare ogni soluzione aliquota come zero. Successivamente, raccogli 10 piastre di Petri sterili ed etichettale con la data, il nome, il tipo di terreno utilizzato e la zona della colonna Winogradsky da cui verranno raccolti gli organismi. Pipettare 15 millilitri di agar dal pallone di agar in ciascuna capsula di Petri. Quindi, utilizzare la punta della pipetta per rimuovere eventuali bolle, riposizionare i coperchi delle piastre e lasciarli solidificare sul piano di lavoro durante la notte. Il giorno successivo, pulire il piano di lavoro con etanolo al 70%. Quindi, etichettare 10 provette da 20 millilitri da T1 a T10 e posizionarle in un rack. Pipettare nove millilitri di soluzione fisiologica allo 0,45% in ciascuna provetta. Ora, copri ciascuna delle 10 provette senza stringere con i loro tappi e trasferiscile in un rack per provette compatibile con l'autoclave. Al termine del ciclo, rimuovere gli spazi vuoti salini utilizzando guanti resistenti al calore e lasciarli raffreddare. Conservare i tubi a temperatura ambiente fino a quando non hanno raggiunto circa 22 gradi Celsius. Per coltivare un organismo bersaglio noto, E. coli in questo esempio, inoculare 100 millilitri di soluzione zero con una singola colonia da una piastra precedentemente striata. Quindi, copri la provetta e incubala per una notte a 37 gradi Celsius. Per valutare le regioni di una colonna di Winogradsky, aggiungere circa un grammo di materiale dalla zona aerobica a T1 e risospendere mediante vortex. Quindi, ripetere questo processo con un grammo di materiale dalla zona anaerobica. Estrarre dall'incubatrice la provetta contenente la soluzione zero inoculata con E. coli e agitarla. Quindi, pipettare un millilitro di soluzione in una provetta T1 e agitare per mescolare. Prelevare un millilitro di soluzione da T1 e trasferirlo in T2, mescolando vorticosamente. Ripetere questo processo attraverso il tubo T10. Per valutare le zone aerobiche e anaerobiche della colonna Winogradsky, rimuovere un millilitro di soluzione da ciascuna delle provette T1 precedentemente preparate e trasferirle nelle provette T2 appropriate. Quindi, continuare le diluizioni seriali attraverso le provette T10 come precedentemente dimostrato. Per stendere la piastra, pipettare 100 microlitri del campione diluito da ciascuna provetta T3 sulla corrispondente piastra di Petri. Quindi, utilizzare un'asta di diffusione sterile per distribuire delicatamente il campione sulla capsula di Petri e riposizionare il coperchio della piastra. Ripetere questo processo per le diluizioni T6 e T9, come precedentemente dimostrato. Incubare le piastre contenenti organismi aerobici in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 24 ore. Incubare le piastre contenenti organismi anaerobici in una camera anaerobica impostata a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo rimuovere le piastre di diluizione T3, T6 e T9 dall'incubatore e dalla camera anaerobica e trasferirle sul piano del banco. Lavorando con una piastra alla volta, far scorrere un anello di inoculazione sterile sulla parte superiore del terreno in uno schema a zig-zag. Quindi, riposizionare il coperchio della capsula di Petri. Quindi, ruotare la piastra di 1/3 e sterilizzare l'anello per ridurre la frequenza del modello a zig-zag precedentemente realizzato. Anche in questo caso, dopo aver sterilizzato l'anello, ruotare la piastra di 1/3, ridurre la frequenza del modello a zig-zag un'ultima volta e riposizionare il coperchio. Ripetere questo metodo di striature per le piastre rimanenti, come mostrato in precedenza. Quindi, posizionare le piastre striate contenenti organismi aerobici in un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte e le piastre striate contenenti organismi anaerobici in una camera anaerobica impostata a 37 gradi Celsius durante la notte. Le colture sono state raccolte dalle zone aerobiche e anaerobiche di una Colonna Winogradsky di sette giorni. Quindi, le colture sono state diluite in serie prima della striatura e della diffusione su piastre di agar LB. Lo striaking ha rivelato una popolazione mista da ciascuna delle zone Winogradsky valutate, e le piastre di diffusione hanno prodotto risultati simili. Una piastra striata da una popolazione mista si tradurrà in colonie batteriche di diverse forme, dimensioni, consistenze e colori. Al contrario, le placche striate e sparse contenenti l'organismo noto, E. coli, hanno dimostrato una popolazione omologa. In generale, è meglio calcolare le CFU per millilitro utilizzando la conta media delle colonie di tre piastre sparse con lo stesso campione e fattore di diluizione. Moltiplicare il numero medio di colonie per il fattore di diluizione e dividere per la quantità quotata. Infine, le colonie isolate scelte da ciascuna piastra possono essere utilizzate in ulteriori saggi di arricchimento per determinare l'identità della specie.

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counting bacteria with dilution plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs.

Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed volume of diluent, or blank, such as 0.45% saline. When 1 mL is transferred into 9 mL of saline, the sample is diluted 10-fold. Repeating that step again lowers the concentration even more, and only two steps are needed in the example of 100 E. coli cells to reach a single cell.

Plating methods help separate microorganisms and make colonies visible. Streaking uses a sterile inoculating loop on agar, a solid growth medium, to spread cells across the plate. In a quadrant streak, the plate is divided into thirds or fourths, and each new area is streaked less often so fewer cells land there. This can produce single colonies instead of a bacterial lawn and can help isolate a pure strain from a mixed sample.

Spread plating uses a sterile glass spreader to distribute an aliquot over the whole petri dish. This method does not add another dilution step. The colonies that grow are counted as colony forming units, or CFU, which are reported as CFU/mL. Soft agar and replica plating are related methods. They can be used for bacteriophage isolation and mutant screening.

Colony counts are usually done on standard 100 mm by 15 mm petri dishes. Isolated colonies can be counted by hand or with computer tools. Plates with fewer than 30 colonies are too few to count, or TFTC. Plates with more than 300 colonies are too numerous to count, or TNTC. If a plate is TNTC, another serial dilution should be done before restreaking a new plate.

To estimate CFU/mL, scientists average the number of colonies from three separate plates and multiply by the dilution factor. The same log scale used in dilution work also helps show how organism concentration changes over time. Plotting log10 CFU/mL against time can reveal the mean generation time of the organism.

Counting Bacteria with Dilution Plates

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

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Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

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Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

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Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

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Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

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Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

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Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

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Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

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Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

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Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Questa collezione mostra gli strumenti chiave dell'indagine microbiologica, tra cui tecniche di mantenimento della sterilità e piastratura, come utilizzare terreni selettivi e arricchire i campioni e metodi di coltura per campioni misti o puri. Inoltre, esamina i metodi comuni per l'identificazione degli isolati microbici, nonché le procedure per la manipolazione genetica dei batteri.

Learn how serial dilution, streaking, and spread plating help scientists count bacteria, isolate colonies, and estimate CFU/mL in lab samples.

Counting Bacteria with Dilution Plates

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