Name: measuring bacterial resistance with e-tests
Uploaded: 2023-04-30T07:10:10.000Z
Duration: 13 min 39 s
Channel: JoVE

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High School

Life Sciences

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From Molecules To Organisms: Structures And Processes

HS-LS1-8

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Antibiotic Susceptibility Testing: Epsilometer Tests to Determine MIC Values of Two Antibiotics and Evaluate Antibiotic Synergy

1. Test epsilometrici (E-test)
<ol><li>
Configurazione
	<ol>
<li>Indossare guanti e un cappotto da laboratorio</li>
		<li>Prepara lo spazio di lavoro sterilizzandolo con etanolo al 70%</li>
		<li>Raccogli le piastre di agar Mueller-Hinton (piastre MHA)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di uno standard di torbidità McFarland n. 0.5
	<ol>
<li>Preparare una soluzione all'1% di cloruro di bario (BaCl2): Aggiungere 1 grammo di cloruro di bario anidro (BaCl2) in 100 ml di acqua distillata. Vortice bene.</li>
		<li>Preparare una soluzione all'1% di acido solforico (H2SO4): Aggiungere 1 mL di H2SO4 concentrato in 99 mL di acqua distillata. Vortice bene.</li>
		<li>Preparare uno standard di torbidità McFarland n. 0.5: 50 μL di soluzione di BaCl2 in 5 mL di soluzioneall'1%di H 2 SO4. Vortice la soluzione bene per ottenere una sospensione torbida.</li>
		<li>Mantenere lo standard di torbidità McFarland n. 0,5 in un tubo coperto di lamina. Conservare a 25°C per un massimo di 6 mesi. Vortice bene ad una soluzione omogenea prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle piastre MHA
	<ol>
<li>Raschiare i batteri del gruppo G di streptococco dalla piastra di agar del sangue usando un anello sterile. Mescolare in 1 ml di soluzione salina e vortice in una sospensione dei batteri.</li>
		<li>Confronta la sospensione con uno standard McFarland n. 0.5 per ottenere la stessa torbidità in modo da avere la stessa dimensione dell'inoculo durante gli esperimenti. Regolare la concentrazione utilizzando soluzione salina o batteri aggiuntivi.</li>
		<li>Inoculare le piastre MHA utilizzando un applicatore sterile con punta in cotone. Tamponare delicatamente la piastra per coprire la superficie. Procedere con uno dei tre metodi descritti di seguito (1.4-1.6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Singolo test di resistenza agli antibiotici. Streptococco gruppo G, resistenza alla penicillina G o alla gentamicina<ol>
<li>Posizionare una striscia reattiva E (penicillina G o gentamicina) al centro della piastra MHA (Figura 1 A, B).</li>
		<li>Incubare per 18-20 ore, 37°C.</li>
		<li>Leggi i risultati. Il MIC è misurato come la zona di inibizione che interseca la striscia reattiva antibiotica graduata (Figura 1 C,D).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig1.jpg"> Figura 1: Singolo E-test. Posizionamento di una striscia reattiva E di A) penicillina G e B) gentamicina su una piastra di agar Mueller Hinton ricoperta da colonie batteriche di streptococchi di gruppo G prima(A e B)e dopo(C e D)incubazione notturna a 37°C 5% CO2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="5"><li>
Approccio incrociato di test sinergici. Streptococco gruppo G, resistenza alla penicillina G e alla gentamicina.<ol>
<li>Posizionare due strisce reattive E con diversi antibiotici (ad es. penicillina G e gentamicina) sulla piastra MHA inoculata in una formazione incrociata.<ol>
<li>Per i risultati più accurati, mirare a posizionare la croce con un angolo di circa 90 ° all'intersezione tra le scale ai loro valori MIC, precedentemente determinati su un singolo test di resistenza agli antibiotici (Figura 2 A).</li>
			<li>Si noti che una volta che le strisce sono posizionate sulla piastra di agar, non devono essere spostate, poiché alcuni antibiotici potrebbero già essere stati assorbiti dalla piastra. Pertanto, è più appropriato mantenere le strisce ad un angolo leggermente errato (ad esempio 85°) e fino a 1-2 mm dal valore MIC effettivo. Si consiglia di eseguire l'esperimento in triplice copia per ridurre questo problema.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incubare per 18-20 ore, 37°C.</li>
		<li>Leggi i risultati. La MIC viene misurata come la zona di inibizione che interseca la striscia reattiva antibiotica graduata su ciascuna rispettiva striscia reattiva E (Figura 2 B).</li>
		<li>Utilizzare la formula per la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC) (Equazione 1) per determinare la sinergia.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig2.jpg"> Figura 2: Rilevamento sinergico - test incrociato. Risultati dei test di sinergia antimicrobica di MIC di penicillina G e gentamicina su Streptococco gruppo G prima (A) e dopo (B) incubazione durante la notte a 37°C 5% CO2. Si forma un angolo di 90° tra i due singoli valori MIC (penicillina G: 0,094 μg/mL, gentamicina: 8 μg/mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="6"><li>
Synergy testing approccio non cross. Streptococco gruppo G, resistenza alla penicillina G e alla gentamicina.<ol>
<li>Posizionare la striscia reattiva E al centro della piastra MHA (Figura 3 A,D).</li>
		<li>Contrassegnare la posizione in cui si trovava il valore MIC determinato in precedenza su ciascuna striscia.</li>
		<li>Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Scartare la striscia reattiva E per ogni piastra MHA (Figura 3 B,E).</li>
		<li>Posizionare la seconda striscia reattiva E (contenente un antibiotico diverso) rispettivamente sull'area della striscia rimossa in precedenza in modo che i loro valori MIC corrispondano al segno e siano allineati.</li>
		<li>Incubare per 18-20 ore, 37°C.</li>
		<li>Leggi i risultati. Il MIC è misurato come la zona di inibizione che interseca la striscia reattiva antibiotica graduata su ciascuna rispettiva striscia reattiva E (Figura 3 C, F).</li>
		<li>Per determinare la sinergia, viene utilizzata la formula per la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC) (Equazione 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig3.jpg"> Figura 3: Rilevamento del sinergismo - test non incrociato. Risultati dei test di sinergia antimicrobica della MIC della penicillina G e della gentamicina sul gruppo streptococco G. A) Striscia di gentamicina (8 μg/mL centrata) sopra i batteri del gruppo G dello streptococco, B) Rimozione della striscia di gentamicina, C) Striscia combinata di gentamicina / penicillina G (0,094 μg / mL centrata) sopra i batteri del gruppo G dello streptococco, D) Striscia G di penicillina G (0,094 μg / mL centrata), E) Rimozione della striscia G di penicillina, F) Striscia combinata di penicillina G / gentamicina (8 μg / mL centrata) sopra i batteri del gruppo G dello streptococco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. Test del brodo
<ol><li>
Configurazione
	<ol>
<li>Indossare guanti e un cappotto da laboratorio</li>
		<li>Prepara lo spazio di lavoro sterilizzandolo con etanolo al 70%</li>
		<li>Raccogliere 15mL di brodo MH con il 50% di sangue di cavallo lisato e 20 mg / mL di β-NAD (MH-F)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(Facoltativo) Eseguire un E-test [Protocollo 1] per determinare il MIC su supporto solido
	<ol>
<li>Sebbene facoltative, tali conoscenze consentiranno una migliore progettazione sperimentale (ad esempio, le concentrazioni di antibiotici aggiunti possono essere progettate per circondare il valore MIC determinato dalla piastra), migliorando le possibilità di un esperimento di successo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di un inoculo batterico. Come detto sopra, la concentrazione batterica può essere stimata mediante misurazioni OD nm o standard di torbidità McFarland<ol>
<li>
Metodo OD600 nm
		<ol>
<li>Ottenere una sospensione batterica con una concentrazione batterica stabilita</li>
			<li>Diluire la coltura in brodo MH-F per ottenere un OD600 di 0,003</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Metodo di torbidità di McFarland
		<ol>
<li>Mettere 15 ml di brodo MH-F in un tubo sterile.</li>
			<li>Inoculare il brodo MH-F con batteri (da un piatto) a un livello di McFarland. Vortice la soluzione vigorosamente. Versare la soluzione in una capsula di Petri sterile.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di antibiotici
	<ol>
<li>Determinare la concentrazione di antibiotici desiderata<ol>
<li>Identificare il valore MIC dal test E- (es. 0,125 μg/mL per la penicillina G e 8 μg/mL per la gentamicina)</li>
			<li>Moltiplicare il valore MIC della piastra di agar per 24-27, corrispondente a quattro-sette diluizioni seriali 2x. Questa sarà la concentrazione iniziale di antibiotici. (es. per la penicillina G, sette diluizioni seriali 2x: 0,125 μg/mL x2 7 = 16 μg/mL; per la gentamicina, quattro diluizioni seriali 2x 8 μg/mL x 24 = 128 μg/mL</li>
			<li>Moltiplicare il valore di partenza desiderato 100x per determinare generare una concentrazione stock degli antibiotici (es. scorte di 1,6 mg/ml di penicillina G e 12,8 mg/ml di gentamicina)</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare una concentrazione di stock di antibiotici 100 volte di conseguenza<ol>
<li>Sciogliere gli antibiotici in 10 ml di acqua autoclavata e vortice per generare una soluzione madre (es. 16 mg di penicillina G e 128 mg di gentamicina per creare le scorte di cui sopra)</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aggiungi batteri ai pozzi delle micropiasche
	<ol>
<li>Aliquota 200 μl DI BRODO MH-F contenente inoculo di batteri ai pozzetti nelle prime 3 file di una piastra di microtitolato a 96 pozzetti per un esperimento di triplice copia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aggiungere antibiotici ai pozzi delle micropiasse
	<ol>
<li>Aggiungere 200 μL di brodo MH-F extra con batteri alla prima colonna di pozzetti (A1, B1, C1) per portare il volume totale a 400 μL.</li>
		<li>Aggiungere 4 μL della concentrazione stock di antibiotici alla prima colonna di pozzi. Poiché il campione contiene 400 μL, si otterrà una diluizione 100x degli antibiotici.</li>
		<li>Generare una diluizione seriale 2x trasferendo 200 μL di batteri/antibiotici da A1 ad A2, fino ad A11. Pipettare vigorosamente tra le diluizioni. Ripetere il passaggio per righe aggiuntive.</li>
		<li>Rimuovere 200 μL dalla colonna 11 in modo che il volume finale in tutti i pozzi sia di 200 μL.</li>
		<li>Lasciare l'ultima colonna (A12, B12, C12) senza antibiotici, come controlli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinare i valori MIC
	<ol>
<li>Incubare la piastra di microtitoli a 96 pozzi per 24 ore a 37°C senza agitare.</li>
		<li>Il valore MIC è definito come l'ultimo pozzo della serie di diluizione che non presenta alcuna crescita visibile di batteri (Figura 4). Questo valore, tuttavia, può essere considerato attendibile solo se la dimensione dell'inoculo originale era corretta.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig4.jpg"> Figura 4: Determinazione del MIC mediante diluizione del brodo. MIC è qui definito come l'ultimo pozzo che mostra chiarezza (nessuna crescita di batteri) prima che cambi torbidità. Le righe sono duplicati del valore MIC della penicillina G e le righe sono duplicati del valore MIC della gentamicina, entrambi rispetto a un isolato del gruppo streptococco G. A) risultato sperimentale effettivo, B) interpretazione schematica dei valori da A (grigio = nessuna crescita; bianco = crescita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig5.jpg"> Figura 5: Procedura schematica delle serie di diluizione per contare la concentrazione di batteri originali. Le diluizioni sono state eseguite come descritto (20 μL diluiti in 180 μL per una serie di diluizione 10x), e quindi 10 μL dalle file A-H sono placcati su due piastre di agar del sangue separate come indicato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="8"><li>
Determinare la dimensione dell'inoculo originale NOTA BENE: I saggi di microbroto sono altamente sensibili per le dimensioni originali dell'inoculo utilizzate. Una dimensione eccessiva dell'inoculo darà un risultato falso positivo, poiché gli antibiotici aggiunti non saranno più in grado di inibire la crescita a quel rapporto. Pertanto, è fondamentale verificare quanti batteri sono stati aggiunti ai microwell. Mentre i dati non saranno disponibili al punto dell'esperimento (a causa della necessità di incubazione di 24 ore) serviranno come controllo. Se il numero di batteri aggiunti rientra nell'intervallo di concentrazione dichiarato, è possibile fidarsi dei valori MIC. Se l'inoculo era troppo alto o troppo basso, l'esperimento deve essere ripetuto.<ol>
<li>
Diluire in serie i batteri
		<ol>
<li>Preparare una piastra di microtitolo a 96 pozzetti per diluire la concentrazione batterica originale al fine di determinare la dimensione dell'inoculo. L'optimum è un volume di 200 μL con 105-6 batteri. Per eseguire le diluizioni, prima aliquota 180 μL PBS sterile a ciascun pozzo in B-H (in triplice 1-3).</li>
			<li>Quindi, aggiungere 100 μl di soluzione batterica ad A (in triplice 1-3).</li>
			<li>Generare una diluizione seriale 10x (in triplice) trasferendo 20 μl di batteri da A a B, pipetta vigorosamente. Ripetere i passaggi per C-H.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Placcare le diluizioni batteriche per la determinazione delle dimensioni dell'inoculo
		<ol>
<li>Contrassegnare le piastre di agar del sangue secondo la Figura 5.</li>
			<li>Trasferire 10 μL dalla diluizione seriale alla piastra secondo la Figura 5.</li>
			<li>Incubare la piastra a 37°C per 20-24 ore.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Determinare la dimensione dell'inoculo batterico
		<ol>
<li>Contare i numeri batterici in punti all'interno di 5-50 colonie (Figura 6).</li>
			<li>Calcolare la dimensione iniziale dell'inoculo calcolando la media dei campioni triplicati, moltiplicare per il fattore di diluizione (ad esempio 10x per i campioni B, 100x per i campioni C, 1000x per i campioni D, ecc.) e quindi per 100 per compensare il volume di spotting di 10 μL, con conseguente dimensione dell'inoculo in cfu/mL. Se l'inoculo è entro 105-6 cfu / mL i dati MIC possono essere considerati attendibili.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig6.jpg"> Figura 6: Determinazione della dimensione dell'inoculo. I batteri inoculati secondo la figura 5 sono stati incubati per 20-24 ore a 37°C e poi contati. La riga D ha un buon numero di colonie da contare (ad esempio 5-50). I campioni in A non sono diluiti, B è diluito 10x, C è diluito 100x e D è diluito 1000x, e solo 10 μL è placcato in ogni punto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

La resistenza agli antibiotici è un problema di salute in tutto il mondo. Al fine di determinare i meccanismi di resistenza dei microbi, i metodi di test per la sinergia e l'antagonismo con diversi antibiotici sono cruciali. Il metodo E-test è rapido, facile da replicare e può essere utilizzato per studiare qualsiasi potenziale sinergico delle terapie combinate. Il metodo di diluizione del brodo può anche essere valutato per prevedere l'attività battericida. Al fine di studiare i meccanismi di resistenza di diversi micro...

test di suscettibilità agli antibiotici: test dell'epsilometro per determinare i valori mic di due antibiotici e valutare la sinergia antibiotica

Fonte: Anna Bläckberg1, Rolf Lood1 1 Dipartimento di Scienze Cliniche Lund, Divisione di Medicina delle Infezioni, Centro Biomedico, Università di Lund, 221 00 Lund Svezia
La conoscenza delle interazioni tra antibiotici e batteri è importante per capire come i microbi evolvono la resistenza agli antibiotici. Nel 1928, Alexander Fleming scoprì la penicillina, un antibiotico che esercita la sua funzione antibatterica interferendo con la rigenerazione della parete cellulare (1). Successivamente sono stati scoperti altri antibiotici con diversi meccanismi d'azione, tra cui farmaci che inibiscono la replicazione del DNA e la traduzione proteica nei batteri; tuttavia, negli ultimi anni non sono stati sviluppati nuovi antibiotici. La resistenza agli antibiotici attuali è in aumento, con conseguenti gravi malattie infettive che non possono essere trattate efficacemente (2). Qui, descriviamo diversi metodi per valutare la resistenza agli antibiotici nelle popolazioni batteriche. Ognuno di questi metodi funziona, indipendentemente dal meccanismo d'azione degli antibiotici utilizzati, perché la morte batterica è il risultato misurato. La resistenza agli antibiotici non è solo rapidamente diffusa in modo specifico attraverso le impostazioni ospedaliere, ma anche in tutta la società. Al fine di studiare tali mezzi di resistenza, sono stati sviluppati diversi metodi, tra cui il test Epsilometro (E-test) e il test di diluizione del brodo (3).
L'E-test è un metodo consolidato ed è uno strumento economico che quantifica i dati della concentrazione minima inibitoria (MIC), la concentrazione più bassa di un antimicrobico che inibisce la crescita visibile di un microrganismo. A seconda del ceppo batterico e degli antibiotici utilizzati, il valore del MIC può variare tra sub μg/mL e &gt;1000 μg/mL (4). L'E-test viene eseguito utilizzando una striscia di plastica contenente un gradiente antibiotico predefinito, che è impresso con la scala di lettura MIC in μg / mL. Questa striscia viene trasferita direttamente sulla matrice di agar quando viene applicata alla piastra di agar inoculata. Dopo l'incubazione, una zona di inibizione ellittica simmetrica è visibile lungo la striscia poiché viene impedita la crescita batterica. MIC è definito dall'area di inibizione, che è il punto finale in cui l'ellisse interseca la striscia. Un altro metodo comune per determinare la MIC è il metodo di diluizione delle microbroti. La diluizione dei microbroti incorpora diverse concentrazioni dell'agente antimicrobico aggiunto a un mezzo di brodo contenente batteri inoculati. Dopo l'incubazione, la MIC è definita come la più bassa concentrazione di antibiotico che impedisce la crescita visibile (5). È anche un metodo quantitativo e può essere applicato a diversi batteri. Gli svantaggi di questo metodo includono la possibilità di errori durante la preparazione delle concentrazioni dei reagenti e il gran numero di reagenti necessari per l'esperimento. Misurare la resistenza agli antibiotici è imperativo sia dal punto di vista clinico che di ricerca, e questi metodi in vitro per studiare la resistenza sono discussi e mostrati di seguito.
Il profilo di resistenza per un batterio specifico può essere applicato al fine di ottimizzare il trattamento antibiotico per determinare se un paziente trarrebbe beneficio dal trattamento combinato rispetto alla singola terapia. Per l'uso di più di un antibiotico alla volta, è imperativo conoscere le loro interazioni tra loro e se hanno un effetto additivo, sinergico o antagonista. Un effetto additivo può essere visto quando l'effetto congiunto degli antibiotici è uguale alla potenza dei singoli antibiotici somministrati a una dose uguale. La sinergia tra antibiotici, d'altra parte, è presente quando l'effetto congiunto degli antibiotici è più potente che se il farmaco fosse somministrato da solo (6). L'applicazione di combinazioni di trattamento antimicrobico viene utilizzata per evitare il verificarsi di resistenza antimicrobica, migliorando così l'effetto del trattamento antibiotico individuale (7). La conoscenza dell'antagonismo è anche altrettanto importante per prevenire l'uso non necessario di combinazioni antimicrobiche. La metodologia E-test offre modi semplici e diversi per determinare possibili sinergie e antagonismi tra diversi agenti antimicrobici. Per far fronte alla proliferazione di patogeni resistenti agli antibiotici, è importante conoscere i possibili meccanismi sinergici e antagonisti di alcuni antibiotici con conseguente efficacia clinica e lotta contro la multifarmaco-resistenza.
La determinazione della sinergia utilizzando gli E-test può essere suddivisa in due approcci generali: cross e non cross testing. Mentre entrambi i test sinergici si basano sulla precedente conoscenza dei singoli valori MIC, i due approcci sono leggermente diversi nella metodologia e nell'approccio concettuale. In un test di sinergia non incrociata, il primo antibiotico nella coppia da testare viene posto su una piastra di agar inoculata con batteri. Dopo aver permesso agli antibiotici della prima striscia di infondere la piastra (ad esempio dopo 1 ora), la striscia viene rimossa e una nuova striscia contenente il secondo antibiotico viene posizionata nello stesso punto esatto del primo, assicurandosi di posizionare i due singoli valori MIC uno sopra l'altro. La zona di inibizione risultante può quindi essere analizzata come descritto sopra e la sinergia calcolata in base all'equazione 1.
Equazione 1 - Concentrazioni inibitorie frazionarie (FIC)
<img src="/files/ftp_upload/10512/10512eq1.jpg">
Valori &gt;0,5 dimostra sinergia.
Mentre premia l'esaminatore con piastre facili da analizzare, il metodo è un po 'laborioso e richiede tempo a causa del cambio di strisce, nonché della necessità di utilizzare due piastre per esperimento. Invece, viene spesso utilizzato un test incrociato. Invece di aggiungere le due diverse strisce E-test successivamente una sopra l'altra (dopo la rimozione della prima), entrambe vengono posizionate contemporaneamente ma sotto forma di una croce <img align="center" src="/files/ftp_upload/10512/10512eq3.jpg"> (angolo di 90 °), con i due valori MIC precedentemente determinati che formano l'angolo di 90 °. Con questo approccio è necessaria una sola piastra per test sinergico, oltre a meno lavoro, rendendola una scelta preferita nonostante sia leggermente più difficile da analizzare. I nuovi valori MIC nell'approccio combinato agli antibiotici possono essere visualizzati come zone di inibizione modificate, dopo di che la sinergia può essere determinata dall'equazione 1.
Invece di utilizzare un approccio a piastra di agar, un approccio a microbroto può spesso essere preferenziale a causa della sua maggiore flessibilità (ad esempio la capacità di scegliere concentrazioni specifiche di antibiotici al di fuori dei limiti di una striscia reattiva E). Inoltre, si suggerisce che i test delle microbrotole siano più sensibili a causa della loro distribuzione uniforme degli antibiotici in una soluzione liquida, non dipendenti dalla dissociazione all'interno di una fase solida (piastra di agar). I pozzetti in una micropiastra a 96 pozzetti saranno inoculati con un determinato numero di batteri (106 cfu / mL: la concentrazione batterica può essere stimata da misurazioni OD600 nm, standard di torbidità o diffondendo campioni di placcatura da 10x diluizioni seriali batteriche) e antibiotici in diverse diluizioni saranno aggiunti ai pozzetti. Allo stesso modo, per le strisce reattive E MIC è determinato come l'intersezione (pozzo / spot) con la più bassa concentrazione di antibiotici che inibiscono la crescita visibile dei batteri.
Obiettivo sperimentale
<ul><li>Il progetto seguente descrive le strategie per determinare i valori MIC della penicillina G e della gentamicina dello streptococco gruppo G con due diversi metodi, E-test e diluizione dei microbroti. Per l'E-test, le placche di agar Mueller-Hinton inoculate con Streptococcus gruppo G sono state utilizzate in combinazione con strisce sfumate di penicillina G e/o gentamicina; mentre il brodo MH con il 50% di sangue di cavallo llisi e 20 mg/mL di β-NAD è stato utilizzato con antibiotici solubili insieme allo Streptococco di gruppo G in un approccio a microbroto.</li>
</ul>Materiali
<ul><li>Colonie batteriche su una piastra di agar nel sangue, conservate &lt;7 giorni in 4°C</li>
	<li>Piastre di agar di sangue</li>
	<li>0.5 Standard McFarland<ul>
<li>1% BaCl2
</li>
		<li>1% H2SO4
</li>
	</ul>
</li>
	<li>Tubo salino (2 mL)</li>
	<li>Applicatore con punta in cotone</li>
	<li>Piastre di agar Mueller-Hinton (piastre MHA)</li>
	<li>Brodo MH con sangue di cavallo lisato al 50% e 20 mg/mL β-NAD (MH-F)</li>
	<li>E-test penicillina/gentamicina (o antibiotici di interesse) (BioMerieux, Marcy l'Etoile, Francia, Svezia)</li>
	<li>Antibiotici penicillina/gentamicina (o antibiotici di interesse (polvere/soluzione))</li>
</ul>Nota: i mezzi specifici utilizzati per la crescita batterica possono variare a seconda delle specie.

Valori MIC in E-test I valori MIC individuali sono stati identificati nella Figura 1 come 0,094 μg/mL per la penicillina G e 8 μg/mL per la gentamicina. Per i test sinergici, entrambi hanno dimostrato un valore MIC per la penicillina G di 0,064 μg /mL (Figure 2, 3), mentre la gentamicina ha avuto un MIC 4 μg / mL per test incrociati e non incrociati. Si noti che può verificarsi una leggera discrepanza tra i test incrociati e non incrociati a c...

Test di suscettibilità agli antibiotici: test dell'epsilometro per determinare i valori MIC di due antibiotici e valutare la sinergia antibiotica

Source: Anna Bl&#228;ckberg1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 ...

La suscettibilità agli antibiotici è definita come la sensibilità di un batterio agli antibiotici e può essere misurata utilizzando un test di diluizione del brodo o un test dell'epsilometro, chiamato anche test E. Nel metodo di diluizione del brodo, un numero standardizzato di batteri viene aggiunto a un terreno di crescita contenente diluizioni antibiotiche seriali. Se sensibili, i batteri non possono crescere alle concentrazioni più elevate di antibiotici, ma continuano a moltiplicarsi alle concentrazioni più basse di antibiotici, causando l'intorbidamento dei mezzi. La concentrazione minima di antibiotico alla quale i batteri non possono più sopravvivere o moltiplicarsi è indicata come il valore minimo di concentrazione inibitoria, o MIC, dell'antibiotico per i batteri in questione. In un E-test, una striscia di plastica impregnata con un gradiente predefinito di antibiotico viene applicata su un prato di batteri appena sparso su una piastra di Petri di Mueller-Hinton agar, o MH-A. L'antibiotico si diffonde nel terreno di coltura agar, dove viene assorbito dai batteri. Se suscettibili, i batteri non possono moltiplicarsi e moriranno, formando una zona chiara attorno alla striscia E, che viene definita zona di inibizione della crescita. Nel punto in cui la crescita si interseca con la striscia E, il valore corrispondente sulla scala fornisce il valore MIC dell'antibiotico. Spesso gli antibiotici vengono utilizzati in combinazione per prevenire l'emergere di ceppi di batteri resistenti agli antibiotici. Questo spesso si traduce in un effetto sinergico, piuttosto che additivo. Sinergico significa che l'effetto combinato dei due antibiotici è maggiore della somma delle loro attività individuali. Tuttavia, l'effetto è considerato significativo solo quando il valore MIC della combinazione di antibiotici diminuisce di almeno due volte. Questo criterio viene valutato calcolando l'indice di concentrazione inibitoria frazionaria, o FIC. Sommando il rapporto tra la MIC di ciascun antibiotico in combinazione con la MIC di ciascun antibiotico individualmente, un indice FIC inferiore a 0,5 indica una sinergia. La sinergia antibiotica può essere misurata utilizzando due metodi basati su E-test: un test non incrociato o un test incrociato. In un test non incrociato, in primo luogo, le strisce E per due diversi antibiotici con valori MIC predeterminati vengono applicate a due piastre separate. Dopo che gli antibiotici si sono diffusi nel terreno, le strisce E originali vengono rimosse e le strisce E per gli antibiotici alternativi vengono posizionate in modo tale che le loro scale MIC si trovino esattamente sopra le scale MIC delle strisce precedenti. In un test incrociato, che è una versione più veloce del test non incrociato, le strisce E dei due antibiotici vengono poste insieme in una formazione a croce, in modo tale che le squame dei loro segni MIC formino un angolo di 90 gradi all'intersezione. Dopo l'incubazione in entrambe le tecniche, il valore MIC di ciascun antibiotico in combinazione con l'altro antibiotico viene letto nel punto in cui la zona di inibizione della crescita si interseca con il bordo della striscia E. Quindi, viene calcolato l'indice FIC. Questo video dimostrerà come determinare il valore MIC di un determinato antibiotico per un determinato batterio utilizzando un E-test e un test di diluizione con micro brodo. Imparerai anche come determinare la sinergia tra due antibiotici utilizzando un test incrociato e un test non incrociato. Per iniziare, indossa tutti i dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi guanti da laboratorio e camice da laboratorio. Quindi, sterilizzare lo spazio di lavoro utilizzando etanolo al 70%. Successivamente, raccogliere 15 millilitri di brodo sterile Mueller-Hinton con il 50% di sangue di cavallo lisato e 20 milligrammi per millilitro di beta-nicotinamide. E da cinque a otto piastre di agar Mueller-Hinton. Ora, per preparare uno standard di torbidità di McFarland numero 0,5, misurare 9,95 millilitri di soluzione di acido solforico all'1%. Quindi, aggiungere 50 microlitri di soluzione di cloruro di bario all'1% alla soluzione di acido solforico. Agitare bene la soluzione per ottenere una sospensione torbida. Coprite il tubo con un foglio di alluminio e mettetelo da parte. Quindi, erogare un millilitro di soluzione salina in una provetta da 15 millilitri. Usa un anello sterile per raschiare un campione della crescita batterica dalla tua piastra di test batterico, qui, Streptococcus gruppo G. Quindi, posizionare l'ansa carica di batteri nella soluzione salina, mescolare delicatamente e quindi agitare bene il tubo. A questo punto, posizionare la sospensione batterica e gli standard di torbidità McFarland fianco a fianco e confrontarli per l'equivalenza della torbidità. Aggiungere ulteriori colonie saline o batteriche fino a quando la torbidità della sospensione batterica non corrisponde a quella dello standard. Una volta ottenuta la torbidità desiderata, immergere un applicatore di cotton fioc sterile nella sospensione batterica. Per inoculare la piastra MH-A, tamponare delicatamente l'intera superficie della piastra con un movimento a zigzag. Quindi, etichettare i lati inferiori delle piastre con il nome dei batteri e la data. Per iniziare, estrai una striscia di test E alla penicillina G, tenendola per il bordo con una pinza. Posizionare delicatamente la striscia al centro della piastra MH-A appena tamponata e riposizionare il coperchio. In questo esempio, viene testato anche un secondo antibiotico, la gentamicina. Pertanto, il processo di posizionamento della striscia viene ripetuto con la seconda piastra e una striscia per il test E della gentamicina. Per determinare i risultati dell'E-test, raccogliere la prima piastra che contiene la striscia E-test E della penicillina G. Ora, determina il punto in cui la zona di inibizione si interseca con la striscia antibiotica. Leggere il valore numerico corrispondente sulla scala. Questo valore rappresenta il valore MIC della penicillina G. Determinare il valore MIC per la gentamicina allo stesso modo. Per iniziare, inoculare una piastra MH-A con batteri del ceppo di Streptococcus di gruppo G. Etichettare il fondo del piatto con il nome dei batteri, gli antibiotici da utilizzare e la data. Ora, posiziona una striscia reattiva elettronica per l'antibiotico di interesse al centro della piastra. Quindi, tieni la seconda striscia reattiva a un angolo di 90 gradi rispetto alla prima striscia e individua il suo segno MIC. Appoggiare delicatamente la seconda striscia E sopra la prima nel punto in cui i due valori MIC si intersecano. Una volta posizionate le strisce, non spostarle. Quindi, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 18-20 ore. Dopo aver inoculato due piastre MH-A, con batteri del ceppo di Streptococcus di gruppo G, posizionare una striscia reattiva E per un antibiotico sulla superficie di una piastra. Quindi, posizionare una striscia reattiva E per l'altro antibiotico sulla seconda piastra come dimostrato. Utilizzando un anello di inoculazione in plastica, segnare il valore MIC di ciascun antibiotico sulla superficie della rispettiva piastra. Quindi, coprire le piastre e incubarle a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, usa una pinza per rimuovere le strisce E. Quindi, raccogli una delle piastre e una striscia reattiva E per l'altro antibiotico. Tenere la striscia E-test sull'impronta lasciata dalla prima striscia e individuare il punto in cui il valore MIC sulla striscia E si allinea con la linea contrassegnata. Posizionare delicatamente la striscia in questo punto di intersezione. Ripetere questo processo per la seconda piastra e incubare entrambe le piastre a 37 gradi Celsius per 18-20 ore. Innanzitutto, ottenere una sospensione batterica con una concentrazione batterica stabilita e diluire la coltura in brodo MHF per ottenere un OD600 di 0,003. Quindi, pesare 16 milligrammi di penicillina G e 128 milligrammi di gentamicina. Trasferire ogni antibiotico secco pesato in provette coniche da 215 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di acqua distillata a ciascuno dei tubi conici e mescolare bene a vortice. Etichettare i tubi con il nome e la concentrazione dell'antibiotico. Eseguendo il saggio in triplicato, aggiungere 400 microlitri della soluzione batterica di lavoro nei primi pozzetti di tre file di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 200 microlitri della soluzione batterica di lavoro nel brodo MHF ai pozzetti delle tre file. Ora, per generare una doppia diluizione seriale di antibiotici, aggiungere prima quattro microlitri di stock di antibiotico al primo pozzetto, generando una diluizione di 100 volte. In sequenza, trasferire 200 microlitri di soluzione batterico-antibiotica in ciascun pozzetto, a partire dal primo pozzetto fino al penultimo pozzetto di ogni fila, assicurarsi che la miscelazione sia corretta pipettando due o tre volte dopo ogni trasferimento. Scartare gli ultimi 200 microlitri di soluzione batterico-antibiotica. Per determinare i risultati del test di microdiluizione del brodo per la penicillina G, individuare innanzitutto i pozzetti che non mostrano una crescita batterica visibile, indicata da una mancanza di torbidità. Da questi pozzetti, identificare il pozzetto con la più bassa concentrazione di antibiotici. Questo rappresenta il valore MIC della penicillina G per i batteri testati. Il valore MIC della gentamicina può essere determinato utilizzando lo stesso test e la stessa tecnica. Per determinare i risultati del test non incrociato, raccogliere la prima piastra, che contiene una striscia di penicillina G E. Quindi, determinare il punto in cui la zona di inibizione della crescita si interseca con la striscia antibiotica. Il valore corrispondente sulla scala rappresenta il valore MIC per la penicillina G in combinazione con la gentamicina. In questo esempio, il valore MIC in combinazione è 0,064 microgrammi per millilitro. Ora, raccogli la seconda piastra, che contiene la striscia di gentamicina E, e determina il valore MIC in combinazione come precedentemente dimostrato. Per valutare l'effetto della combinazione, calcolare prima la concentrazione inibitoria frazionata o FIC per la penicillina G dividendo la MIC in combinazione per la MIC del solo antibiotico. Ripeti questo processo per la gentamicina. Quindi, calcola l'indice FIC utilizzando l'equazione mostrata qui. Una riduzione di due volte del valore MIC in combinazione produce un valore dell'indice FIC inferiore o uguale a 0,5 e dimostra una sinergia tra penicillina G e gentamicina. In questo caso, il valore FIC calcolato è 1,18, che è maggiore di 0,5. Pertanto, i risultati non dimostrano una sinergia tra penicillina G e gentamicina contro il ceppo di Streptococcus di gruppo G. Per determinare i risultati del test incrociato, determinare prima il punto in cui le zone di inibizione della crescita si intersecano con le rispettive strisce E. Leggere il valore numerico su ciascuna striscia reattiva E che corrisponde a questo punto di intersezione. Questi valori rappresentano il valore MIC in combinazione per penicillina G e gentamicina. Successivamente, per valutare l'effetto della combinazione, calcola l'indice FIC utilizzando l'equazione mostrata qui. In questo esempio, il valore FIC calcolato è 1,18, che è maggiore di 0,5. Ciò significa che la penicillina G e la gentamicina non agiscono sinergicamente contro il ceppo di streptococco del gruppo G.

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measuring bacterial resistance with e-tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform.

The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with bacteria, and the MIC scale is printed directly on the strip in micrograms per milliliter. After incubation, an ellipse-shaped zone appears where growth is blocked. The MIC is read where that inhibition zone meets the strip.

A similar MIC method is microbroth dilution. In this approach, bacteria are placed in broth with different antibiotic concentrations. After incubation, the MIC is the lowest concentration that still stops visible growth. This method is quantitative and can be used with several bacteria, although it can require many reagents and careful preparation of the concentrations.

Knowing a bacterium’s resistance profile can help guide treatment choices. It can show whether a patient may benefit from one antibiotic or from a combination. When two antibiotics are used together, they may act in an additive, synergistic, or antagonistic way. Additive means the combined effect matches the effect of each drug at equal dose, while synergy means the combined effect is stronger than either drug alone.

E-tests can also be used to look for synergy and antagonism between antimicrobial agents. One method is non-cross testing. In this setup, one antibiotic strip is first placed on the agar plate, allowed to diffuse, and then removed. A second strip is placed in the same position, with the two MIC values aligned, and the result is used to calculate the fractional inhibitory concentration, or FIC. Values above 0.5 show synergy. This method is simple to read, but it takes more time and uses two plates.

A faster option is the cross test. Here, both E-test strips are placed at the same time in a 90-degree cross, with the known MIC values meeting at the angle. Only one plate is needed, so the method saves work, although the result can be a little harder to analyze. The changed inhibition zones are then used to determine whether the antibiotics act synergistically.

A broth-based approach can also be used for combination testing. It gives more flexibility because specific antibiotic concentrations can be chosen outside the limits of an E-test strip. It may also be more sensitive because the antibiotics are evenly distributed in liquid, rather than relying on diffusion through agar. In this method, wells in a 96-well plate are filled with a set number of bacteria and different antibiotic dilutions, and the MIC is the lowest concentration that prevents visible growth.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

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creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

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Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

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Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

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Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

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Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

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Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

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Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Questa collezione mostra gli strumenti chiave dell'indagine microbiologica, tra cui tecniche di mantenimento della sterilità e piastratura, come utilizzare terreni selettivi e arricchire i campioni e metodi di coltura per campioni misti o puri. Inoltre, esamina i metodi comuni per l'identificazione degli isolati microbici, nonché le procedure per la manipolazione genetica dei batteri.

Learn how E-tests and microbroth dilution measure MIC values, and how cross and non-cross setups reveal antibiotic synergy in bacteria.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests | JoVE K12

Georgia Standards of Excellence

9-12

Biology

SB6.e

Anna Bläckberg

Rolf Lood

Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center

Lund University

Concepts

Preparation of Plates and Bacteria

Determining MIC Using E-Test

Synergy Testing: Cross Approach

Synergy Testing: Non-Cross Approach

MIC Determination Using Broth Dilution

Data Analysis: Broth Microdilution

Data Analysis and Results: Synergy Testing

Nucleic Acids and Nucleotides

Nucleic acids are the most important macromolecules for the continuity of life. They carry the cell&#39;s genetic blueprint and have instructions for its ...

Nucleic Acid Structure

The pentose sugar in DNA is deoxyribose, while in RNA the pentose sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group ...

DNA Base Pairing

Erwin Chargaff&#x2019;s rules on DNA equivalence paved the way for the discovery of base pairing in DNA. Chargaff&#x2019;s rules state that in a ...

From DNA to Protein

The flow of genetic information in cells from DNA to mRNA to protein is described by the central dogma, which states that genes specify the sequence of ...

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

The Central Dogma

The central dogma explains the flow of genetic information from DNA nucleotides to the amino acid sequence of proteins.
RNA is the Missing Link Between ...

Genomic DNA in Prokaryotes

The genome of most prokaryotic organisms consists of double-stranded DNA organized into one circular chromosome in a region of cytoplasm called the ...

Genomic DNA in Eukaryotes

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. To fit their genomes into a cell, eukaryotic DNA is packaged extraordinarily tightly inside the ...

Overview

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most ...

DNA Packaging

Overview

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. In order to fit their genomes into a cell, eukaryotes must pack their DNA tightly inside ...

RNA Structure

Overview
The basic structure of RNA consists of a five-carbon sugar and one of four nitrogenous bases. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

RNA Stability

Intact DNA strands can be found in fossils, while scientists sometimes struggle to keep RNA intact under laboratory conditions. The structural variations ...

pre-mRNA Processing

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Types of RNA

Overview
Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs ...

DNA as a Genetic Template

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

What are Cells?

Cell Diversity

The concept of a cell started with microscopic observations of dead cork tissue by Robert Hooke in 1665. Hooke coined the term &#34;cell&#34; based on the ...

Cells of the Epidermis

The epidermis is made of four or five layers of epithelial cells, depending on its location in the body. From deep to superficial, these layers are the ...

Bone Cells and Tissue

Bones contain a relatively small number of cells entrenched in a matrix of organic and inorganic components. Although bone cells compose only a small ...

Gross Anatomy of Skeletal Muscles

The connective tissues play a significant role in arranging the muscle fibers into a hierarchical structure that forms a complete muscle. Consider a ...

Structure of Cardiac Muscles

Cardiac muscle, or myocardium, is a specialized type of muscle found exclusively in the heart. Its unique structural and functional characteristics enable ...

structure-and-organization-of-smooth-muscles

Structure and Organization of Smooth Muscles

In the human body, smooth muscle tissue is found lining the visceral and tubular organs such as the liver, lungs, blood vessels, and respiratory tract.
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Chromosome Replication

Before a cell can divide, it must accurately replicate all of its chromosomes, including the DNA and its associated histone and non-histone ...

Neurons: The Cell Body and the Dendrites

A typical nerve cell comprises three main components: the cell body, dendrites, and the axon. The cell body, also known as the soma or perikaryon, serves ...

Lampbrush Chromosomes

In 1882, Flemming observed lampbrush chromosomes (LBC) in salamander eggs. Later in 1892, R&#252;ckert observed LBCs in shark egg cells and coined the ...

Neurons: The Axon

The axon is a long, thin extended portion of the neuron that carries impulses from its cell body toward the effector cell.
Axoplasm, the axon&#39;s ...

Polytene Chromosomes

Polytene chromosomes are giant interphase chromosomes with several DNA strands placed side by side. They were discovered in the year 1881 by Balbiani in ...

Nervous Tissue: Neuron Types

Neurons, the fundamental units of the nervous system, can be classified based on both their structural and functional characteristics.
Structurally, ...

Euchromatin

The extent of chromatin compaction can be studied by staining chromatin using specific DNA binding dyes. Under the microscope, the dense-compacted regions ...

Nervous Tissue: Glial Cells

Glial cells or neuroglia are non-neuronal cells in the nervous system that outnumber neurons. These include astrocytes, oligodendrocytes, microglia, and ...

Heterochromatin

Lymphoid Cells and Tissues

Lymphoid cells and lymphoid tissues are the two major components of lymphoid organs.
Lymphoid cells consist of immune system cells such as B and T ...

chromatin-position-affects-gene-expression

Chromatin Position Affects Gene Expression

Chromatin is the massive complex of DNA and proteins packaged inside the nucleus. The complexity of chromatin folding and how it is packaged inside the ...

Two structural features of the DNA molecule provide a basis for the mechanisms of heredity: the four nucleotide bases and its double-stranded nature. The ...

Organization of Genes

Chromosome Structure

A functional eukaryotic chromosome must contain three elements: a centromere, telomeres, and numerous origins of replication.
The centromere is a DNA ...

Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells. Emphasis is on the conceptual understanding that DNA sequences determine the amino acid sequence and thus protein structure. Students can produce scientific writing, or presentations, and/or physical models that communicate constructed explanations.

HS-LS1-1

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

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Levels of Organization

Biological organization is the classification of biological structures, ranging from atoms at the bottom of the hierarchy to the Earth&#x27;s biosphere. ...

The Scientific Method

The scientific method is a detailed, empirical problem-solving process used by biologists and other scientists. This iterative approach involves ...

Taxonomy

Taxonomy is the science of defining and naming groups of biological organisms based on shared characteristics. It uses a hierarchy of increasingly ...

Phylogeny

Phylogeny is concerned with the evolutionary diversification of organisms or groups of organisms. A group of organisms with a name is called a taxon ...

Develop and use a model to illustrate the hierarchical organization of interacting systems that provide specific functions within multicellular organisms. Emphasis is on functions at the organism system level such as nutrient uptake, water delivery, or organism movement in response to neural stimuli. An example of an interacting system could be an artery depending on the proper function of elastic tissue and smooth muscle to regulate and deliver the proper amount of blood within the circulatory system.

HS-LS1-2

Overview of Metabolism

Living cells constantly carry out various chemical reactions which are necessary for their proper functioning. These reactions are interlinked to one ...

Regulation of Metabolism

Cellular needs and conditions vary from cell to cell and change within individual cells over time. For example, the required enzymes and energetic demands ...

Positive and Negative Feedback Loops

Animal organs and organ systems constantly adjust to internal and external changes through a process called homeostasis (&#34;steady state&#34;). Examples ...

Functions of Life

Human life is characterized by a variety of functions that are essential for survival and well-being. These functions include metabolism, movement, ...

Requirements for Human Life

The Earth and its atmosphere have provided humans with air, water, and food, but these are not the only requirements for survival. Humans also require a ...

What is Homeostasis?

Maintaining homeostasis requires that the body continuously maintain its internal conditions. Each physiological condition has a particular set point, ...

Negative and Positive Feedback

Plan and conduct an investigation to provide evidence that feedback mechanisms maintain homeostasis in living organisms. Examples of investigations could include heart rate responses to exercise, stomate responses to moisture and temperature, root development in response to water levels, or cell response to hypertonic and hypotonic environments.

HS-LS1-3

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

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