Name: bacterial stains for cell walls and spores
Uploaded: 2023-04-30T07:10:16.000Z
Duration: 11 min 33 s
Channel: JoVE

1. Colorazione del grammo
<ol><li>
Configurazione
	<ol>
<li>Indossare guanti e un cappotto da laboratorio non infiammabile, poiché i coloranti macchiano mani e vestiti.</li>
		<li>Un bruciatore Bunsen viene utilizzato per riscaldare i batteri. Usare attenzione quando si lavora con la fiamma; legare i capelli lunghi.</li>
		<li>Verranno utilizzati reagenti per macchie di Gram disponibili in commercio.</li>
		<li>Pulire i vetrini del microscopio con salviette da laboratorio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocollo
	<ol>
<li>Pipet 10 μL fosfato tamponato soluzione salina o brodo di coltura su vetrino.</li>
		<li>Spalmare una colonia batterica nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme. Nota: Non utilizzare colture più vecchie di 24 ore, poiché i batteri troppo vecchi potrebbero avere cambiamenti nella loro parete cellulare che influenzeranno i risultati della macchia di Gram (1, 4).</li>
		<li>Scivolo completamente asciutto all'aria.</li>
		<li>Una volta asciugati, il calore fissa i batteri facendo scorrere attraverso la fiamma (i batteri si trovano verso l'alto) 4-5 volte. Nota: Non tenere il vetrino nella fiamma troppo a lungo o si possono distorcere le cellule batteriche (1).</li>
		<li>Lavorando sopra il lavandino, tenere premuto il livello di scorrimento e applicare Gram's Crystal Violet per coprire completamente i batteri termo-fissati, lasciare riposare 45 secondi.</li>
		<li>Risciacquare crystal violet in eccesso tenendo il vetrino ad angolo e spruzzando un flusso d'acqua delicato e indiretto sullo scivolo e lasciandolo scorrere sui batteri macchiati. Non spruzzare acqua direttamente sui batteri.</li>
		<li>Tenendo nuovamente il livello del vetrino, applicare gram's Iodine Solution per coprire completamente i batteri macchiati, lasciare riposare 45 secondi.</li>
		<li>Risciacquare lo iodio in eccesso come nel passaggio 1.2.6 sopra.</li>
		<li>Tenendo la diapositiva ad angolo, aggiungere alcune gocce di Decolorizer sulla diapositiva, lasciandola gocciolare sui batteri macchiati solo fino a quando il deflusso è chiaro; in genere, circa 5 secondi. Risciacquare immediatamente con acqua come indicato al punto 1.2.6 di cui sopra. Nota: Questo è un passaggio critico nel protocollo. Lasciare che Decolorizer rivolo troppo a lungo o non abbastanza a lungo si tradurrà in una falsa colorazione di Gram (4).</li>
		<li>Tenendo nuovamente il livello del vetrino, applicare la safranina di Gram per coprire completamente i batteri, lasciare riposare 45 secondi.</li>
		<li>Risciacquare la safranina in eccesso come al punto 1.2.6 di cui sopra.</li>
		<li>Macchia, non strofinare, acqua in eccesso dallo scivolo usando asciugamani di carta.</li>
		<li>Esaminare il vetrino al microscopio utilizzando l'immersione in olio con un obiettivo 100X.</li>
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</li>
	<li>
Risultati e analisi dei dati
	<ol>
<li>I batteri Gram-positivi macchieranno di viola.</li>
		<li>I batteri Gram-negativi si macchiano di rosso.</li>
		<li>La forma (cocchi, bacilli, aste curve, spirali) dei batteri sarà visibile.</li>
		<li>Sarà visibile la disposizione delle cellule batteriche (cellule singole, cellule accoppiate, catene di cellule, cluster, raggruppamenti).</li>
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</li>
</ol>2. Colorazione della capsula
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Configurazione
	<ol>
<li>Indossare guanti e un cappotto da laboratorio come coloranti macchiare mani e vestiti.</li>
		<li>Per preparare la soluzione di Crystal Violet all'1%, mescolare 0,25 grammi di Crystal Violet con 25 ml di acqua distillata fino a quando non si scioglie.</li>
		<li>Per preparare la soluzione Congo Red all'1%, mescolare 0,25 grammi di Congo Red con 25 ml di acqua distillata fino a quando non si scioglie.</li>
		<li>Pulire i vetrini con salviette da laboratorio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocollo
	<ol>
<li>Posizionare 10 μL Congo Red sulla diapositiva.</li>
		<li>Usando una punta di pipetta, spalmare una colonia batterica nel colorante per produrre uno strato sottile e uniforme.</li>
		<li>Vetrino completamente asciutto all'aria con miscela colorante/cellulare, 5-7 minuti. Nota: Non fissare il calore in quanto il riscaldamento può disidratare o distorcere la capsula.</li>
		<li>Inondare lo striscio con l'1% di Crystal Violet per 1 minuto.</li>
		<li>Risciacquare la macchia in eccesso tenendo la diapositiva ad angolo e spruzzando un flusso d'acqua delicato e indiretto sullo scivolo e lasciandolo scorrere sui batteri macchiati. Non spruzzare acqua direttamente sui batteri.</li>
		<li>Tenere la diapositiva con un angolo di 45 gradi fino a completa asciugazione all'aria.</li>
		<li>Esaminare lo striscio al microscopio sotto immersione in olio con un obiettivo 100X.</li>
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</li>
	<li>
Risultati e analisi dei dati
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<li>Le cellule batteriche macchieranno di viola.</li>
		<li>Lo sfondo della diapositiva si macchia di scuro.</li>
		<li>Le capsule saranno un alone chiaro intorno alle cellule su uno sfondo scuro.</li>
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</li>
</ol>3. Colorazione delle endospore (metodo Schaeffer-Fulton)
<ol><li>
Configurazione
	<ol>
<li>Indossare guanti e camici da laboratorio non infiammabili per proteggere mani e indumenti da coloranti e fiamme.</li>
		<li>Un bruciatore Bunsen viene utilizzato per riscaldare i batteri. Usare attenzione quando si lavora con la fiamma; legare i capelli lunghi.</li>
		<li>Per preparare la soluzione verde di malachite allo 0,5%, mescolare 0,125 grammi di malachite verde con 25 ml di acqua distillata fino a quando non si scioglie.</li>
		<li>Utilizzare la soluzione di reagente safranina di Gram disponibile in commercio.</li>
		<li>Pulire i vetrini con salviette da laboratorio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocollo
	<ol>
<li>Pipetta 10 μl fosfato tamponato soluzione salina (PBS) o brodo di coltura su vetrino.</li>
		<li>Usando la tecnica asettica, spalmare una colonia batterica nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme. Nota: Le endospore generalmente non si formano nelle cellule giovani, quindi si raccomanda che la coltura sia compresa tra 18 e 36 ore (9).</li>
		<li>Scivolo completamente asciutto all'aria.</li>
		<li>Correzione del calore facendo passare il vetrino (batteri lato verso l'alto) attraverso la fiamma 4-5 volte.</li>
		<li>Per aiutare a contenere il colorante, posizionare un pezzo di carta per lenti (tagliato per adattarsi allo striscio batterico) sopra lo striscio fisso a caldo.</li>
		<li>Saturare la carta per lenti con la soluzione Malachite Green.</li>
		<li>Posizionare il vetrino sopra il becher di acqua bollente su una piastra calda e scorrere a vapore per 5 minuti, mantenendo la carta delle lenti umida aggiungendo più colorante una goccia alla volta, se necessario. Nota: Evitare il surriscaldamento e l'essiccazione della soluzione colorante.</li>
		<li>Rimuovere il vetrino dal becher, rimuovere e scartare la carta per lenti, lasciare raffreddare la diapositiva per 2 minuti.</li>
		<li>Tenendo il vetrino ad angolo, risciacquare abbondantemente spruzzando un flusso d'acqua delicato e indiretto sullo scivolo, permettendogli di drenare sopra lo striscio.</li>
		<li>Tenendo il livello di scorrimento, allagare la macchia con Safranin, lasciare riposare 1 minuto.</li>
		<li>Risciacquare la safranina in eccesso come nel passaggio 3.2.9 sopra.</li>
		<li>Lasciare asciugare all'aria.</li>
		<li>Esaminare il vetrino al microscopio sotto immersione in olio con un obiettivo 100X.</li>
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Risultati e analisi dei dati
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<li>Le spore si macchiano di verde.</li>
		<li>Le cellule vegetative si macchiano di rosso.</li>
		<li>Alcune cellule vegetative conterranno spore; le cellule si macchieranno di rosso, mentre le endospore si macchieranno di verde.</li>
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</li>
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I batteri hanno caratteristiche distintive che possono aiutare nella loro identificazione. Alcune di queste caratteristiche possono essere osservate mediante colorazione e microscopia ottica. Tre tecniche di colorazione utili per osservare queste caratteristiche sono la colorazione di Gram, la colorazione della capsula e la colorazione delle endospore. Ogni tecnica identifica diverse caratteristiche dei batteri e può essere utilizzata per aiutare i medici a raccomandare trattamenti per i pazienti, identificare potenziali...

microscopia e colorazioni: la colorazione di gram, delle endospore e del capside

Microscopy and Staining: Gram, Capsule, and Endospore Staining

Fonte: Rhiannon M. LeVeque1, Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1e Victor J. DiRita1 1 Dipartimento di Microbiologia e Genetica Molecolare, Michigan State University, East Lansing, Michigan, Stati Uniti d'America
I batteri sono diversi microrganismi che si trovano quasi ovunque sulla Terra. Molte proprietà aiutano a distinguerli l'uno dall'altro, incluso ma non limitato al tipo di colorazione di Gram, alla forma e alla disposizione, alla produzione di capsule e alla formazione di spore. Per osservare queste proprietà, si può usare la microscopia ottica; tuttavia, alcune caratteristiche batteriche (ad esempio dimensioni, mancanza di colorazione e proprietà di rifrazione) rendono difficile distinguere i batteri esclusivamente con un microscopio ottico (1, 2). La colorazione dei batteri è necessaria quando si distinguono i tipi batterici con la microscopia ottica. I due principali tipi di microscopi otscopici sono semplici e composti. La principale differenza tra loro è il numero di lenti utilizzate per ingrandire l'oggetto. I microscopi semplici (ad esempio una lente d'ingrandimento) hanno una sola lente per ingrandire un oggetto, mentre i microscopi composti hanno diverse lenti per migliorare l'ingrandimento (Figura 1). I microscopi composti hanno una lente obiettiva vicino all'oggetto che raccoglie la luce per creare un'immagine dell'oggetto. Questo viene poi ingrandito dall'oculare (lente oculare) che ingrandisce l'immagine. La combinazione dell'obiettivo e dell'oculare consente un ingrandimento maggiore rispetto all'utilizzo di una singola lente da sola. Tipicamente, i microscopi composti hanno più lenti obiettivo di varie potenze per consentire un ingrandimento diverso (1, 2). Qui, discuteremo la visualizzazione dei batteri con macchie di Gram, macchie di capsule e macchie di endospore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10513/10513fig1.jpg"> Figura 1: Un tipico microscopio composto. Le parti più importanti del microscopio sono etichettate.
La macchia di Gram, sviluppata nel 1884 dal batteriologo danese Hans Christian Gram (1), differenzia i batteri in base alla composizione della parete cellulare (1, 2, 3, 4). In breve, uno striscio batterico viene posto su un vetrino per microscopio e quindi fissato a calore per far aderire le cellule al vetrino e renderle più facilmente accettabili delle macchie (1). Il campione fissato a caldo viene colorato con Crystal Violet, trasformando le cellule in viola. Il vetrino viene lavato con una soluzione di iodio, che fissa il Crystal Violet alla parete cellulare, seguito da un decolorante (un alcool) per lavare via qualsiasi Crystal Violet non fisso. Nella fase finale, una controcolore, Safranin, viene aggiunta alle celle colorate di rosso (Figura 2). I batteri Gram-positivi si colorano di viola a causa dello spesso strato di peptidoglicano che non è facilmente penetrato dal decolorante; I batteri Gram-negativi, con il loro strato peptidoglicano più sottile e il più alto contenuto lipidico, si dissacrono con il decolorante e sono controcolorati di rosso quando viene aggiunta Safranina (Figura 3). La colorazione di Gram viene utilizzata per differenziare le cellule in due tipi (Gram-positivo e Gram-negativo) ed è anche utile per distinguere la forma delle cellule (sfere o cocchi, aste, aste curve e spirali) e la disposizione (celle singole, coppie, catene, gruppi e cluster) (1, 3).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10513/10513fig2.jpg"> Figura 2: Schema del protocollo di colorazione di Gram. La colonna di sinistra mostra come reagiscono i batteri Gram-negativi in ogni fase del protocollo. La colonna di destra mostra come reagiscono i batteri Gram-positivi. Inoltre, sono mostrate due tipiche forme di cellule batteriche: i bacilli (o bastoncelli) e i cocchi (o sfere).

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10513/10513fig3.jpg"> Figura 3: Risultati della colorazione di Gram. Una macchia di Gram di una miscela di Staphylococcus aureus (cocchi viola Gram-positivi) ed Escherichia coli (barre rosse Gram-negative).
Alcuni batteri producono uno strato esterno viscoso extracellulare chiamato capsula (3, 5). Le capsule sono strutture protettive con varie funzioni, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'aderenza a superfici e altri batteri, la protezione dall'essiccazione e la protezione dalla fagocitosi. Le capsule sono tipicamente composte da polisaccaridi contenenti più del 95% di acqua, ma alcune possono contenere polialcoli e poliammine (5). A causa della loro composizione per lo più non ionica e della tendenza a respingere le macchie, i semplici metodi di colorazione non funzionano con la capsula; invece, la colorazione della capsula utilizza una tecnica di colorazione negativa che macchia le cellule e lo sfondo, lasciando la capsula come un alone chiaro intorno alle cellule (1, 3) (Figura 4). La colorazione della capsula comporta la spalma di un campione batterico in una macchia acida su un vetrino per microscopio. A differenza della colorazione di Gram, lo striscio batterico non viene fissato termicamente durante una colorazione della capsula. Il fissaggio del calore può interrompere o disidratare la capsula, portando a falsi negativi (5). Inoltre, il fissaggio termico può ridurre le celle con conseguente pulizia intorno alla cellula che può essere scambiata per una capsula, portando a falsi positivi (3). La macchia acida colora lo sfondo della diapositiva; mentre segue con una macchia di base, Crystal Violet, colora le cellule batteriche stesse, lasciando la capsula incontaminata e apparendo come un alone chiaro tra le cellule e lo sfondo del vetrino (Figura 5). Tradizionalmente, l'inchiostro indiano è stato usato come macchia acida perché queste particelle non possono penetrare nella capsula. Pertanto, né la capsula né la cellula sono macchiate dall'inchiostro dell'India; invece, lo sfondo è macchiato. Congo Red, Nigrosin o Eosin possono essere utilizzati al posto dell'inchiostro indiano. La colorazione della capsula può aiutare i medici a diagnosticare le infezioni batteriche quando si guardano le colture dai campioni dei pazienti e guidare il trattamento appropriato del paziente. Le malattie comuni causate da batteri incapsulati includono polmonite, meningite e salmonellosi.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10513/10513fig4.jpg"> Figura 4: Schema del protocollo di colorazione della capsula. Il pannello superiore mostra lo striscio di scorrimento prima di qualsiasi applicazione di macchia. Il pannello centrale mostra come la diapositiva e i batteri si occupano della macchia primaria, Congo Red. Il pannello finale mostra come il vetrino e i batteri si occupano della controcolorazione, Crystal Violet.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10513/10513fig5.jpg"> Figura 5: Risultati della colorazione della capsula. Colorazione della capsula di Acinetobacter baumannii incapsulato (indicato con frecce nere) e Escherichia coli non incapsulato (indicato con frecce bianche). Si noti che lo sfondo è scuro e le cellule di A. baumannii sono macchiate di viola. La capsula intorno alle cellule di A. baumannii è evidente come un alone, mentre E. coli non ha alone.
In condizioni avverse (ad esempio limitazione dei nutrienti, temperature estreme o disidratazione), alcuni batteri producono endospore, strutture metabolicamente inattive resistenti ai danni fisici e chimici (1, 2, 8, 9). Le endospore consentono al batterio di sopravvivere a condizioni difficili proteggendo il materiale genetico delle cellule; una volta che le condizioni sono favorevoli alla crescita, le spore germinano e la crescita batterica continua. Le endospore sono difficili da macchiare con le tecniche di colorazione standard perché sono impermeabili ai coloranti tipicamente utilizzati per la colorazione (1, 9). La tecnica abitualmente utilizzata per macchiare le endospore è il Metodo Schaeffer-Fulton (Figura 6),che utilizza la macchia primaria Malachite Green, una macchia solubile in acqua che si lega relativamente debolmente al materiale cellulare, e il calore, per consentire alla macchia di sfondare la corteccia della spora (Figura 7). Questi passaggi colorano le cellule in crescita (denominate cellule vegetative nel contesto della biologia delle endospore), così come le endospore e le eventuali spore libere (quelle che non sono più all'interno del precedente involucro cellulare). Le cellule vegetative vengono lavate con acqua per rimuovere Malachite Green; le endospore trattengono la macchia a causa del riscaldamento del verde malachite all'interno della spora. Infine, le cellule vegetative sono controbattete con Safranin per visualizzare (Figura 8). La colorazione per le endospore aiuta a differenziare i batteri in formatori di spore e formatori non sporici, oltre a determinare se le spore sono presenti in un campione che, se presente, potrebbe portare a contaminazione batterica al momento della germinazione.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10513/10513fig6.jpg"> Figura 6: Schema del protocollo di colorazione delle endospore. La colonna di sinistra mostra come reagiscono i batteri che formano spore in ogni fase del protocollo. La colonna di destra mostra come reagiscono i batteri che non formano spore.

<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10513/10513fig7.jpg"> Figura 7: Diagramma della struttura delle endospore. Cellula batterica contenente un'endospora con le varie strutture sporiche etichettate.

<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10513/10513fig8.jpg"> Figura 8: Risultati della colorazione delle endospore. Una colorazione tipica delle endospore di Bacillus subtilis. Le cellule vegetative (indicate con le frecce bianche) sono macchiate di rosso, mentre le endospore (denotate con le frecce nere) sono macchiate di verde.

Microscopia e colorazioni: la colorazione di Gram, delle endospore e del capside

Source: Rhiannon M. LeVeque1, Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

I batteri sono organismi viventi microscopici che hanno molte caratteristiche distintive come la forma, la disposizione delle cellule, se producono o meno capsule e se formano spore. Queste caratteristiche possono essere visualizzate mediante colorazione e aiutano nell'identificazione e nella classificazione di diverse specie batteriche. 
Per esaminare le prime due caratteristiche della forma e della disposizione delle cellule, possiamo utilizzare una semplice tecnica chiamata colorazione di Gram. Qui, il cristallovioletto viene applicato ai batteri, che sono stati fissati a caldo su un vetrino. Successivamente, la soluzione di iodio di Gram viene aggiunta al vetrino, con conseguente formazione di un complesso insolubile tra il cristallovioletto e la soluzione di iodio di Gram. Viene quindi applicato un decolorante e tutti i batteri con uno spesso strato di peptidoglicano si colorano di viola, poiché questo strato non è facilmente penetrabile dal decolorante. Questi batteri sono indicati come Gram-positivi. 
I batteri Gram-negativi hanno uno strato di peptidoglicano più sottile e decolorano il decolorante, perdendo il colore viola. Tuttavia, si colorano di rosa-rossastro quando viene aggiunto un controcolorante di safranina, che si lega a uno strato di lipopolisaccaride all'esterno. Una volta colorate, le cellule possono essere osservate per morfologia, dimensioni e disposizione, ad esempio in catene o grappoli, il che aiuta ulteriormente nella classificazione e nell'identificazione. 
Un'altra tecnica utile nel kit di strumenti del microbiologo è la colorazione della capsula, utilizzata per visualizzare le capsule esterne che circondano alcuni tipi di cellule batteriche. A causa della composizione non ionica della capsula e della tendenza a respingere le macchie, i semplici metodi di colorazione non funzioneranno. Invece, viene utilizzata una tecnica di colorazione negativa, che prima colora lo sfondo con un colorante acido, come il rosso Congo, prima che le cellule batteriche vengano colorate con cristallovioletto. Questo lascia qualsiasi capsula presente come un alone chiaro intorno alle cellule. 
L'ultima tecnica di colorazione principale qui trattata può aiutare a determinare se i batteri studiati formano spore. In condizioni avverse, alcuni batteri producono endospore, strutture dormienti, dure e non riproduttive la cui funzione primaria è quella di garantire la sopravvivenza dei batteri durante periodi di stress ambientale, come temperature estreme o disidratazione. Tuttavia, non tutte le specie batteriche producono endospore e sono difficili da colorare con le tecniche standard perché sono impermeabili a molti coloranti. Il metodo Schaeffer-Fulton utilizza la colorazione verde malachite, che viene applicata ai batteri fissati a un vetrino. Il vetrino viene quindi lavato con acqua prima di essere controcolorato con Safranin. Le cellule vegetative appariranno rosso-rosate, mentre le eventuali endospore presenti appariranno verdi. In questo video imparerai come eseguire queste comuni tecniche di colorazione batterica e quindi esaminerai i campioni di colorazione utilizzando la microscopia ottica. 
Per iniziare la procedura, lega i capelli lunghi e indossa i dispositivi di protezione individuale appropriati, tra cui camice da laboratorio e guanti. 
Quindi, pulire un vetrino da microscopio nuovo con una salvietta da laboratorio. Quindi, pipettare 10 microlitri di soluzione fisiologica tamponata con fosfato 1X sul primo vetrino. Quindi, utilizzare una punta per pipetta sterile per selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Spalmare la colonia batterica nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme. Posizionare lo scivolo sul piano di lavoro e lasciarlo asciugare completamente all'aria. 
Una volta asciugato, accendi un bruciatore Bunsen per fissare i batteri a caldo. Utilizzando le pinze, passare più volte il vetrino attraverso la fiamma del bruciatore, con i batteri rivolti verso l'alto, facendo attenzione a non tenere il vetrino nella fiamma troppo a lungo, che potrebbe distorcere le celle. 
Ora, lavorando sopra il lavandino, tenere il vetrino in piano e applicare diverse gocce di cristallovioletto di Gram per coprire completamente lo striscio batterico, quindi posizionare il vetrino sul banco in posa per 45 secondi. Quindi, tieni il vetrino inclinato e spruzza delicatamente un getto d'acqua sulla parte superiore del vetrino, facendo attenzione a non spruzzare direttamente lo striscio batterico. Ora, tenendo di nuovo il vetrino in piano, applicare la soluzione di iodio di Gram per coprire completamente i batteri macchiati e poi lasciarla riposare per altri 45 secondi. Successivamente, sciacquare accuratamente lo iodio dal vetrino, come mostrato in precedenza. Tenendo il vetrino inclinato, aggiungere alcune gocce di decolorante di Gram al vetrino, lasciandolo scorrere sui batteri macchiati, fino a quando il deflusso non è chiaro, per circa 5 secondi. Risciacquare immediatamente con acqua come mostrato in precedenza. Ciò limiterà l'eccessiva decolorazione dello striscio. Quindi, tenendo nuovamente il vetrino a livello, applicare il colorante di contrasto alla safranina di Gram per coprire completamente i batteri macchiati. Dopo 45 secondi, sciacquare delicatamente la safranina dallo scivolo con acqua, come mostrato in precedenza, e poi asciugare con carta assorbente. 
Infine, aggiungere una goccia di olio da immersione direttamente sul vetrino, quindi esaminare il vetrino utilizzando un microscopio ottico con una lente obiettivo a olio 100X. 
Per iniziare questo protocollo di colorazione, indossare prima i dispositivi di protezione individuale corretti e poi assicurarsi che i vetrini che verranno utilizzati siano puliti. 
Quindi, prepara le soluzioni. Per ottenere una soluzione di cristallovioletto all'1%, mescolare 0,25 grammi di polvere di cristallovioletto con 25 millilitri di acqua distillata e agitare fino a dissoluzione. Quindi, preparare una soluzione di rosso Congo all'1% mescolando 0,25 grammi di polvere rossa del Congo con 25 millilitri di acqua distillata e agitare fino a quando non si sarà sciolto. Ora, pipettare 10 microlitri di soluzione di rosso Congo sul vetrino. Utilizzando un puntale per pipetta pulito e sterile, selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Quindi, spalmare la colonia batterica nel colorante per produrre uno strato sottile e uniforme. Asciugare completamente all'aria il vetrino batterico per 5-7 minuti. Una volta che il vetrino è asciutto, inondare lo striscio con una quantità sufficiente di cristallovioletto all'1% per coprire lo striscio e lasciarlo riposare per 1 minuto. Ora, tieni lo scivolo inclinato e spruzza delicatamente un getto d'acqua sulla parte superiore dello scivolo, facendo attenzione a non spruzzare direttamente i batteri. Continuare a tenere il vetrino a un angolo di 45 gradi fino a completa asciugatura all'aria. Infine, aggiungere una goccia di olio da immersione direttamente sul vetrino, quindi esaminare il vetrino utilizzando un microscopio ottico con un obiettivo a olio 100X. 
Per eseguire la colorazione con endospore, preparare innanzitutto una soluzione di verde malachite allo 0,5% mescolando 0. 125 grammi di polvere verde di malachite con 25 millilitri di acqua distillata, quindi agitare la soluzione fino a quando non si scioglie. Quindi, pipettare 10 microlitri di 1X PBS al centro del vetrino. Quindi, utilizzare una punta per pipetta sterile per selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB. Spalmare i batteri nel liquido per produrre uno strato sottile e uniforme. Ora, posiziona lo scivolo sul piano di lavoro e lascialo asciugare completamente all'aria. Una volta asciugato, accendi un bruciatore Bunsen per fissare i batteri a caldo. Passare più volte il vetrino attraverso la fiamma blu del bruciatore, con il lato dei batteri rivolto verso l'alto. Quindi, una volta che il vetrino si è raffreddato, posizionare un pezzo di carta per lenti pretagliata sopra la macchia fissata a caldo. Quindi, accendi una piastra al massimo e porta a ebollizione un bicchiere d'acqua. 
Saturare la carta per lenti con la soluzione di verde malachite e, utilizzando una pinza, posizionare il vetrino sopra il bicchiere di acqua bollente a cuocere a vapore per 5 minuti. Mantieni umida la carta per lenti aggiungendo altro colorante, una goccia alla volta, se necessario. Quindi, sempre usando le pinze, prelevare il vetrino dal becher e rimuovere e gettare la carta per lenti. Lasciare raffreddare il vetrino per 2 minuti. Lavorando sopra il lavandino, tieni lo scivolo inclinato e spruzza delicatamente un getto d'acqua sulla parte superiore dello scivolo. Ora, tieni premuto il vetrino a livello e applica Safranin per coprire completamente il vetrino. Quindi, lasciarlo riposare per 1 minuto. Quindi, tenere il carrello inclinato e risciacquare come mostrato in precedenza. Lasciare asciugare lo scivolo all'aria sul piano di lavoro. Infine, aggiungere una goccia di olio da immersione direttamente sul vetrino, quindi esaminare il vetrino con un microscopio ottico, con un obiettivo a olio 100X. 
Nel protocollo di colorazione di Gram, possono risultare due macchie di colore diverso. La colorazione viola scuro indica che i batteri sono Gram-positivi e che hanno mantenuto la colorazione cristallovioletta. Al contrario, la colorazione rosa-rossastra è una caratteristica dei batteri Gram-negativi, che invece saranno colorati dalla controcolorazione Safranina. Inoltre, dopo la colorazione di Gram è possibile visualizzare diverse forme e disposizioni dei batteri. Ad esempio, è possibile differenziare i Cocchi, o batteri rotondi, dai Bacillus a forma di bastoncello, o identificare i batteri, che formano filamenti, rispetto a quelli che tipicamente si aggregano come grumi o si verificano singolarmente. 
In un'immagine al microscopio colorata con capsula, le cellule batteriche saranno tipicamente colorate di viola e lo sfondo del vetrino dovrebbe essere colorato in modo scuro. Su questo sfondo scuro, le capsule dei batteri, se presenti, appariranno come un chiaro alone attorno alle cellule. 
Infine, nella colorazione con endospore, le cellule vegetative saranno colorate di rosso dalla controcolorazione safranina. Se nel campione sono presenti endospore, queste manterranno la macchia verde malachite e appariranno di colore verde-bluastro.

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bacterial stains for cell walls and spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria.

A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound microscopes also have several objective lenses, which allows different levels of magnification. This setup is useful when studying bacterial shape and arrangement.

The Gram stain separates bacteria based on cell wall structure. A bacterial smear is first heat-fixed to the slide so the cells stick and take up stain better. Crystal Violet colors the cells purple, iodine helps hold that dye in place, alcohol removes dye from cells that do not retain it, and Safranin acts as the counterstain. Gram-positive bacteria stay purple because they have a thick peptidoglycan layer, while Gram-negative bacteria lose the first dye and then turn red.

Gram staining also shows cell shape and arrangement. It can help distinguish cocci, which are spheres, from bacilli, which are rods, as well as curved rods and spirals. It can also show whether cells appear alone, in pairs, chains, groups, or clusters. A mixed sample of Staphylococcus aureus and Escherichia coli shows these differences clearly.

Capsule staining is used to see the protective outer capsule that some bacteria make. Capsules help bacteria stick to surfaces and other bacteria, resist drying out, and avoid being engulfed by immune cells. They are usually made of polysaccharides with more than 95% water, although some contain polyalcohols and polyamines. Because capsules repel many stains, this method uses negative staining, which colors the background and the cells but leaves a clear halo around the capsule.

For capsule staining, the bacterial smear is not heat-fixed. Heat can damage the capsule, dry it out, or shrink the cells and create false results. Acidic stains such as India ink, Congo Red, Nigrosin, or Eosin color the background, and Crystal Violet colors the cells. The capsule remains unstained, so it appears as a clear ring. This method can support diagnosis of infections caused by encapsulated bacteria, including pneumonia, meningitis, and salmonellosis.

Endospore staining focuses on bacteria that survive harsh conditions by making endospores. Nutrient limitation, extreme temperatures, and dehydration can trigger spore formation. Endospores are inactive structures that protect genetic material and can later germinate when conditions improve. They are hard to stain with standard methods because dyes do not easily enter them.

The Schaeffer-Fulton method is used to stain endospores. It uses Malachite Green and heat so the dye can enter the spore cortex. Water then washes the dye from vegetative cells, which are the growing cells, but the endospores keep the green stain. Safranin is added at the end to color the vegetative cells red. This stain helps identify spore-forming bacteria, detect free spores, and spot possible contamination if spores later germinate.

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

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creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

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Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

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Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

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Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

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Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

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Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

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Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

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Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

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Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

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Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

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Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Questa collezione mostra gli strumenti chiave dell'indagine microbiologica, tra cui tecniche di mantenimento della sterilità e piastratura, come utilizzare terreni selettivi e arricchire i campioni e metodi di coltura per campioni misti o puri. Inoltre, esamina i metodi comuni per l'identificazione degli isolati microbici, nonché le procedure per la manipolazione genetica dei batteri.

Learn how Gram, capsule, and endospore stains reveal bacterial cell walls, capsules, and spores using a compound microscope and common lab dyes.

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

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