Name: calcium chloride dna uptake in e. coli
Uploaded: 2023-04-30T07:10:31.000Z
Duration: 10 min 54 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Florida Department of Education

High School

Life Science

SC.912.L.16

SC.912.L.16.7

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

Questo protocollo descrive la preparazione e la trasformazione del competente E. coli DH5α utilizzando un adattamento della procedura del cloruro di calcio (12).
1. Configurazione
<ol><li>
Attrezzatura
	<ul>
<li>Spettrofotometro</li>
		<li>Centrifuga Sorval (o equivalente)</li>
		<li>Centrifuga da banco</li>
		<li>Blocco termico o bagno d'acqua</li>
		<li>Agitatore orbitale</li>
		<li>Incubatore stazionario</li>
		<li>Vassoio per colata in gel</li>
		<li>Pettini di pozzo</li>
		<li>Sorgente di tensione</li>
		<li>Scatola di gel</li>
		<li>Sorgente di luce UV</li>
		<li>Microonde</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Soluzioni e reagenti
	<ul>
<li>Brodo di Luria-Bertani (LB) (10 g di idrolizzato enzimatico di caseina, 5 g di estratto di lievito e 5 g di cloruro di sodio in 1000 ml di H2O)</li>
		<li>Brodo super ottimale con repressione della catabolite (SOC): (2% (p/v) triptone, 0,5% (p/v) estratto di lievito, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2,10 mM MgSO4e 20 mM glucosio)</li>
		<li>CaCl2-MgCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) soluzione.</li>
		<li>MCaCl 2 soluzione (se le cellule saranno trasformate immediatamente) o 0,1M soluzione di CaCl2 contenente il 10% (v/v) di glicerolo (se le cellule saranno congelate per un uso futuro).</li>
		<li>Piastre di agar LB</li>
		<li>Piastre selettive LB agar (per questo esperimento, poiché il plasmide utilizzato conferisce resistenza all'ampicillina, sono state utilizzate piastre lb agar contenenti ampicillina 100 μg/mL)</li>
		<li>
E. coli Ceppo DH5α</li>
		<li>Plasmide pUC19 DNA (100 pg/ μl)</li>
		<li>Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen)</li>
		<li>
Posteriore III enzima di restrizione</li>
		<li>1 kb più scala DNA</li>
		<li>Agarose a basso punto di fusione</li>
		<li>1X tampone TAE (40 mM Tris Base, 20 mM Acido Acetico e 1mM EDTA)</li>
		<li>Bromuro di etidio (10mg/mL)</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Note generali sulla sicurezza E. coli DH5α è classificato come Livello di Biosicurezza 1 (BSL1). I microbi in questa categoria rappresentano poca o nessuna minaccia di infezione negli adulti sani. Tuttavia, è necessaria un'attenta manipolazione del microrganismo.</li>
</ol>IMPORTANTE tutte le fasi di questo protocollo devono essere eseguite utilizzando tecniche asettiche e su ghiaccio o temperature di 4° C se non indicato.
2. Protocollo
<ol><li>Da uno stock congelato di E. coli DH5α (congelato al 20% in glicerolo da una coltura notturna coltivata in LB) strisciare i batteri per l'isolamento su una piastra di agar LB. Incubare a 37°C durante la notte (16-20 ore).</li>
	<li>Inoculare una singola colonia in 3 ml di brodo LB in un tubo. Crescere scuotendo a 210 giri/min a 37°C durante la notte (16-20 ore).</li>
	<li>Misurare l'OD600 della cultura notturna. Utilizzare la coltura notturna per inoculare 100 ml di brodo LB in un pallone da 1 litro a un OD600 = 0,01. Incubare la coltura scuotendo vigorosamente (210 rpm) a 37°C monitorando OD600 nello spettrofotometro ogni 15-20 min, fino a raggiungere OD600=0,35 (circa 3 ore). NOTA: affinché la trasformazione sia efficiente, le cellule batteriche devono essere in fase di crescita media-esponenziale. Il numero massimo di cellule deve essere di 108 cellule/mL, che per la maggior parte dei ceppi di E. coli corrisponde a OD600=0,4. L'uso dello spettrofotometro consente di misurare l'OD600, che consente di determinare che le cellule sono nella fase di crescita appropriata. Se questo protocollo verrà utilizzato per altri ceppi di batteri, sarà necessaria la calibrazione per determinare il numero di colonie che formano unità a valori specifici di OD600 per determinare questa correlazione.</li>
	<li>Trasferire i 50 ml della coltura in ciascuna delle 2 bottiglie di centrifuga in polipropilene ghiacciato. Mettere le bottiglie sul ghiaccio per 20 minuti per raffreddare.</li>
	<li>Recuperare le celle mediante centrifugazione a 2700g (4100 rpm in un rotore Sorval GSA) per 10 min a 4°C.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante. Scolare via le ultime tracce di supporto posizionando la bottiglia a testa in giù su un tampone o un asciugamano di carta.</li>
	<li>Riconsoppiare ogni pellet batterico in 30 mL di unasoluzioneghiacciata CaCl2 -MgCl2 (80mM MgCl 2 ,20mM CaCl 2 ). Per prima cosa aggiungere 5 ml di soluzione, ruotare con attenzione fino a quando il pellet si è sciolto completamente e quindi aggiungere i restanti 25 mL di soluzione.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.4.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.5.</li>
	<li>Se le cellule competenti stanno per essere trasformate direttamente, riconsemere ogni pellet batterico in 2 ml di una soluzione ghiacciata di CaCl2 (0,1 M) facendo roteare attentamente i tubi. Se il pellet non viene riconsociato con questo metodo, risusepenare delicatamente su e giù (evitando la formazione di bolle). In alternativa, le cellule competenti possono essere congelate e conservate per un uso successivo. Per preparare le scorte congelate di cellule competenti, risuscimere il pellet in 2 ml di una soluzione di 0,1M CaCl2 contenente il 10% (v/v) di glicerolo. Questa soluzione deve essere ghiacciata. Sospensione di cellule aliquote in tubi di polipropilene da 1,5 mL ghiacciati (160 μl per tubo). Congelare immediatamente le cellule competenti in un bagno di ghiaccio secco/etanolo. Trasferire i tubi in un congelatore a -70°C.</li>
	<li>Per trasformare le cellule trattate con CaCl2,trasferire 50 μl di cellule competenti in ciascuna delle 2 provette di polipropilene da 1,5 ml. Aggiungere 1 μl (100 pg) di DNA plasmidico pUC19 a uno dei tubi e lasciare il secondo tubo senza DNA (controllo negativo). Mescolare delicatamente (evitare la formazione di bolle). Incubare per 30 minuti sul ghiaccio. NOTA: Nella trasformazione non devono essere utilizzati più di 50 ng di DNA in un volume pari o inferiore a 10 μL.</li>
	<li>Trasferire i tubi nel blocco di calore e incubare a 42°C per 45 s esatti. NOTA: lo shock termico è un passaggio critico. Non superare la temperatura o il tempo di incubazione.</li>
	<li>Trasferire facilmente i tubi sul ghiaccio. Incubare per 2 min.</li>
	<li>Aggiungere 950 μL di mezzi SOC e incubare le provette per 1 ora a 37°C per consentire ai batteri di recuperare ed esprimere il marcatore resistente agli antibiotici codificato nel plasmide.</li>
	<li>Diluire 10 μL della sospensione cellulare in 1000 μL in SOC (diluizione 1/100) e 100 μL della sospensione cellulare in 1000 μL in SOC (diluizione 1/10). Piastra 100 μl delle diluizioni, così come il controllo, su piastre selettive, e diffondere utilizzando una spatola. Di solito, la placcatura di 100 μL di una diluizione 1/100 e 1/10 produrrà un numero sufficiente di unità formanti colonie (cfu) per piastra. Idealmente, questo numero dovrebbe variare tra 30-300 ufc in modo che ci siano abbastanza colonie ma separate l'una dall'altra. Tuttavia, il numero di cfu dipenderà dall'efficienza della trasformazione (vedere la sezione Analisi dei dati e risultati).</li>
	<li>Incubare le piastre a 37°C. Le colonie trasformate dovrebbero apparire in 12-16 ore (questo intervallo dipenderà dal ceppo cellulare e dal metodo di selezione). Nessuna colonia dovrebbe crescere nel controllo negativo.</li>
	<li>Contare il cfu/piastra ottenuto per la trasformazione (Tabella 1).</li>
	<li>Per verificare che i trasformanti ospitino il plasmide pUC19, verrà eseguita una preparazione del plasmide e la successiva digestione. A tal fine, inoculare una singola colonia in 3 ml di brodo LB in un tubo. Crescere scuotendo a 210 giri/min a 37°C durante la notte (16-20 ore).</li>
	<li>Preparare una preparazione del plasmide utilizzando il kit QIAprep Spin Miniprep, secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Digerire 1 μg di pUC19 purificato con l'enzima di restrizione HindIII a 37°C per 1 ora. NOTA: per questo passaggio è possibile utilizzare qualsiasi enzima che taglia nel sito di clonazione multipla pUC19.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Importo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer digest di restrizione 10X</td>
			<td>2,5 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plasmide pUC19</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Posteriore III</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Da 20,5 μl (a 25 μl)</td>
		</tr>
</tbody></table><ol start="21"><li>Eseguire una scala a peso molecolare, DIGERIRE IL DNA pUC19 e la stessa quantità di DNA pUC19 non digerito in un gel di agarosio all'1% contenente 1 μg/mL di bromuro di etidio per 1 ora a 95 V. NOTA: il tempo e la tensione variano a seconda dell'apparecchiatura utilizzata.</li>
	<li>Visualizza il gel sotto la luce UV. Confrontare le dimensioni del DNA pUC19 digerito e non digerito (Figura 2) (vedere la sezione Analisi dei dati e risultati). Procedere con i passaggi necessari per verificare la trasformazione in base all'obiettivo di ogni particolare esperimento di trasformazione.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig2.jpg"> Figura 2: Digestione del DNA plasmidico recuperato da cellule DH5α trasformate. Il DNA plasmidico è stato recuperato da cellule DH5α trasformate, digerite con HindIII, eseguite in un gel di acarosio all'1% e visualizzate con una fonte UV (passaggi da 2,19 a 2,22).
3. Analisi dei dati e risultati
Per calcolare l'efficienza di trasformazione, un indicatore di quanto bene le cellule hanno preso il DNA extracellulare, le colonie ottenute nella trasformazione devono essere contate:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Diluizione</td>
			<td>Cfu</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/100</td>
			<td>34</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/10</td>
			<td>246</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Unità formanti colonie (cfu) conteggiate dall'esperimento di trasformazione.
L'efficienza di trasformazione (TE) è una misura del numero di cfu risultante dalla trasformazione di 1 μg di plasmide in un dato volume di cellule competenti. Molti parametri influenzano l'efficienza della trasformazione: dimensione del plasmide, genotipo cellulare, fase di crescita durante la preparazione della competenza, metodi di trasformazione, ecc.). Quando si calcola il TE è importante considerare quale diluizione (se presente) è stata eseguita prima della placcatura e incorporarla nel calcolo del numero totale di cfu. L'efficienza di trasformazione (TE) viene calcolata con la seguente equazione:
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq1.jpg">
Per prima cosa dividi il cfu per il μg di DNA, in questo esempio 0,0001μg. Quindi dividere il risultato per il fattore di diluizione. In questo esempio, è stata utilizzata una diluizione di 1/10 e sono stati placcati 100μL di una soluzione da 1 ml (diluizione: 1/10 × 100 μL /1000 μL = 0,01).
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq2.jpg">

La trasformazione è un metodo potente per introdurre DNA esogeno nelle cellule batteriche che è la chiave per molte applicazioni di biologia molecolare in laboratorio. Inoltre, svolge un ruolo importante in natura consentendo alle cellule batteriche di scambiare materiale genetico che potrebbe comportare una maggiore variazione genetica e consentire l'acquisizione di diversi tratti benefici per la sopravvivenza in una vasta gamma di condizioni. Molti ceppi batterici codificano i geni necessari per la competenza naturale....

trasformazione di cellule di e. coli tramite l'utilizzo di una procedura basata sul metodo del cloruro di calcio

Fonte: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1e Victor J. DiRita1 1 Dipartimento di Microbiologia e Genetica Molecolare, Michigan State University
I batteri hanno la capacità di scambiare materiale genetico (acido desossiribonucleico, DNA) in un processo noto come trasferimento genico orizzontale. L'incorporazione di DNA esogeno fornisce un meccanismo attraverso il quale i batteri possono acquisire nuovi tratti genetici che consentono loro di adattarsi alle mutevoli condizioni ambientali, come la presenza di antibiotici o anticorpi (1) o molecole presenti negli habitat naturali (2). Esistono tre meccanismi di trasferimento genico orizzontale: trasformazione, trasduzione e coniugazione (3). Qui ci concentreremo sulla trasformazione, la capacità dei batteri di prendere il DNA libero dall'ambiente. In laboratorio, il processo di trasformazione ha quattro fasi generali: 1) Preparazione di cellule competenti, 2) Incubazione di cellule competenti con DNA, 3) Recupero di cellule e 4) Placcatura delle cellule per la crescita dei trasformanti (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig1.jpg"> Figura 1: Fasi generali del processo di trasformazione. Il processo di trasformazione ha quattro fasi generali: 1) Preparazione delle cellule competenti, 2) Incubazione con DNA, 3) Recupero delle cellule e 4) Cellule placcate per la crescita dei trasformanti.
Affinché si verifichi la trasformazione, i batteri riceventi devono essere in uno stato noto come competenza. Alcuni batteri hanno la capacità di diventare naturalmente competenti in risposta a determinate condizioni ambientali. Tuttavia, molti altri batteri non diventano competenti naturalmente, o le condizioni per questo processo sono ancora sconosciute. La capacità di introdurre il DNA nei batteri ha una serie di applicazioni di ricerca: generare più copie di una molecola di DNA di interesse, esprimere grandi quantità di proteine, come componente nelle procedure di clonazione e altri. A causa del valore della trasformazione in biologia molecolare, ci sono diversi protocolli volti a rendere le cellule artificialmente competenti quando le condizioni per la competenza naturale sono sconosciute. Due metodi principali sono utilizzati per preparare cellule artificialmente competenti: 1) attraverso il trattamento chimico delle cellule e 2) esponendo le cellule a impulsi elettrici (elettroporazione). Il primo utilizza diverse sostanze chimiche a seconda della procedura per creare attrazione tra il DNA e la superficie cellulare, mentre il secondo utilizza campi elettrici per generare pori nella membrana cellulare batterica attraverso i quali le molecole di DNA possono entrare. L'approccio più efficiente per la competenza chimica è l'incubazione con cationi bivalenti, in particolare calcio (Ca2+)(4,5) La competenza indotta dal calcio è la procedura che verrà descritta qui (6). Questo metodo viene utilizzato principalmente per la trasformazione dei batteri Gram-negativi e questo sarà il focus di questo protocollo.
La procedura di trasformazione chimica comporta una serie di passaggi in cui le cellule sono esposte a cationi per indurre competenza chimica. Questi passaggi sono successivamente seguiti da un cambiamento di temperatura - shock termico - che favorisce l'assorbimento di DNA estraneo da parte della cellula competente (7). Gli involucri cellulari batterici sono caricati negativamente. Nei batteri Gram-negativi come l'Escherichia coli,la membrana esterna è caricata negativamente a causa della presenza di lipopolisaccaride (LPS) (8). Ciò si traduce in repulsione delle molecole di DNA caricate negativamente in modo simile. Nell'induzione della competenza chimica, gli ioni calcio caricati positivamente neutralizzano questa repulsione di carica consentendo l'assorbanza del DNA sulla superficie cellulare (9). Il trattamento del calcio e l'incubazione con dna vengono effettuati su ghiaccio. Successivamente, viene eseguita un'incubazione a temperature più elevate (42°C), lo shock termico. Questo squilibrio di temperatura favorisce ulteriormente l'assorbimento del DNA. Le cellule batteriche devono essere nella fase di crescita media-esponenziale per resistere al trattamento di shock termico; in altre fasi di crescita le cellule batteriche sono troppo sensibili al calore con conseguente perdita di vitalità che diminuisce significativamente l'efficienza di trasformazione.
Diverse fonti di DNA possono essere utilizzate per la trasformazione. Tipicamente, i plasmidi, piccole molecole di DNA circolari a doppio filamento, vengono utilizzati per la trasformazione nella maggior parte delle procedure di laboratorio in E. coli. Affinché i plasmidi possano essere mantenuti nella cellula batterica dopo la trasformazione, devono contenere un'origine di replicazione. Ciò consente loro di essere replicati nella cellula batterica indipendentemente dal cromosoma batterico. Non tutte le cellule batteriche vengono trasformate durante la procedura di trasformazione. Pertanto, la trasformazione produce una miscela di cellule trasformate e cellule non trasformate. Per distinguere tra queste due popolazioni, viene utilizzato un metodo di selezione per identificare le cellule che hanno acquisito il plasmide. I plasmidi di solito contengono marcatori selezionabili, che sono geni che codificano un tratto che conferisce un vantaggio per la crescita (cioè resistenza a un antibiotico o a una sostanza chimica o salvataggio da un'auxotrofia di crescita). Dopo la trasformazione, le cellule batteriche vengono placcate su mezzi selettivi, che consentono solo la crescita delle cellule trasformate. Nel caso di cellule trasformate con un plasmide che conferisce resistenza a un determinato antibiotico, il mezzo selettivo sarà un mezzo di crescita contenente quell'antibiotico. Diversi metodi possono essere utilizzati per confermare che le colonie coltivate nei mezzi selettivi sono trasformanti (cioè hanno incorporato il plasmide). Ad esempio, i plasmidi possono essere recuperati da queste cellule utilizzando metodi di preparazione del plasmide (10) e digeriti per confermare le dimensioni del plasmide. In alternativa, la PCR della colonia può essere utilizzata per confermare la presenza del plasmide di interesse (11).
Lo scopo di questo esperimento è quello di preparare cellule chimicamente competenti di E. coli DH5α, utilizzando un adattamento della procedura del cloruro di calcio (12), e di trasformarle con il plasmide pUC19 per determinare l'efficienza di trasformazione. Il ceppo di E. coli DH5α è un ceppo comunemente usato nelle applicazioni di biologia molecolare. A causa del suo genotipo, in particolare recA1 e endA1, questo ceppo consente una maggiore stabilità dell'inserto e migliora la qualità del DNA plasmidico nei preparati successivi. Poiché l'efficienza di trasformazione diminuisce con l'aumentare delle dimensioni del DNA, il plasmide pUC19 è stato utilizzato in questo protocollo a causa delle sue piccole dimensioni (2686 bp) (vedi https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html per una mappa vettoriale). pUC19 conferisce resistenza all'ampicillina e, quindi, questo era l'antibiotico utilizzato per la selezione.

Sebbene il TE dipenda da molti fattori, i preparati cellulari competenti non commerciali, come questo, normalmente producono da10 6 a 107 trasformanti per microgrammo di plasmide. Pertanto, questa preparazione, con un TE = 2,46 x 108 cfu/μg, ha prodotto un TE ben oltre l'intervallo previsto. Sono disponibili protocolli aggiuntivi per la realizzazione di celle supercompetenti quando sono richieste maggiori efficienze di trasformazione per unadetermi...

Trasformazione di cellule di E. coli tramite l'utilizzo di una procedura basata sul metodo del cloruro di calcio

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

I batteri sono notevolmente adattabili e un meccanismo che facilita questo adattamento è la loro capacità di assorbire molecole di DNA esterne. Un tipo di DNA che i batteri possono assorbire è chiamato plasmide, un pezzo di DNA circolare che contiene spesso informazioni utili, come i geni di resistenza agli antibiotici. Il processo di modifica dei batteri da parte di nuove informazioni genetiche incorporate da una fonte esterna è indicato come trasformazione. La trasformazione può essere facilmente eseguita in laboratorio utilizzando Escherichia coli o E. coli. Per essere trasformate, le cellule di E. coli devono prima essere rese competenti, il che significa in grado di assorbire molecole di DNA dal loro ambiente. Il protocollo per ottenere questo risultato è sorprendentemente semplice, una breve incubazione delle cellule in una soluzione di cloruro di calcio. Questa incubazione fa sì che le cellule diventino permeabili alle molecole di DNA. Dopo che le celle sono state pellettate mediante centrifugazione, il surnatante viene rimosso. Il DNA plasmidico viene ora aggiunto alle cellule competenti. Dopo aver incubato le cellule con il DNA, la miscela viene brevemente riscaldata a 42 gradi Celsius, seguita da un rapido raffreddamento su ghiaccio. Questo shock termico provoca il trasferimento del DNA attraverso la parete e le membrane della cellula. Le cellule vengono quindi incubate in terreni freschi. Quindi, i batteri vengono posizionati a 37 gradi per consentire loro di richiudere le loro membrane ed esprimere proteine resistenti. Quelle cellule che hanno assorbito i plasmidi copieranno fedelmente il DNA e lo passeranno alla loro progenie ed esprimeranno tutte le proteine che potrebbero essere codificate da esso, compresi i mediatori della resistenza agli antibiotici. Questi geni di resistenza possono essere utilizzati come marcatori selezionabili per identificare i batteri che sono stati trasformati con successo perché le cellule che non hanno assorbito il plasmide non esprimeranno il prodotto del gene di resistenza. Ciò significa che quando le cellule vengono piastrate su un terreno solido che contiene l'antibiotico appropriato, cresceranno solo le cellule che hanno assorbito il plasmide. La trasformazione delle cellule in una colonia in crescita può essere ulteriormente confermata coltivando tali cellule in mezzi liquidi durante la notte per aumentare la resa prima di estrarre il DNA dal campione. Una volta isolato il DNA, è possibile eseguire un digest enzimatico di restrizione diagnostica. Poiché gli enzimi di restrizione tagliano il DNA in posizioni prevedibili, l'esecuzione di questi digestati su un gel dovrebbe mostrare un modello prevedibile se il plasmide desiderato è stato trasformato con successo. Ad esempio, se pUC19 viene preparato e tagliato con l'enzima di restrizione HindIII, sul gel dovrebbe essere visibile una singola banda di 2686 nucleotidi. In questo laboratorio, trasformerai il ceppo DH-5 Alpha di E. coli con pUC19 e quindi confermerai la trasformazione riuscita mediante elettroforesi su gel di DNA. Prima di iniziare la procedura, indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi camice da laboratorio e guanti. Quindi, sterilizzare l'area di lavoro con etanolo al 70%. Ora, prepara le cellule chimicamente competenti depositando un anello pieno di batteri su una piastra sterile di agar LB e strisciando i batteri con un nuovo anello. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, sterilizzare nuovamente il piano di lavoro con etanolo al 70% e rimuovere la piastra dall'incubatrice. Inoculare una singola colonia ben isolata in 3 millilitri di brodo LB in una provetta con ansa sterile. Quindi, coltiva la coltura a 37 gradi Celsius durante la notte, con agitazione a 210 giri/min. Il giorno successivo, misurare la densità ottica della coltura notturna con uno spettrofotometro. Quindi, aggiungere 100 millilitri di brodo LB a un pallone da un litro e inocularelo con la coltura notturna a una densità ottica di 0. 01. Ora, incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione e controllare l'OD600 ogni 15-20 minuti fino a quando la coltura non raggiunge la fase di crescita esponenziale media. Dopo circa tre ore, trasferire 50 millilitri di coltura in due bottiglie di polipropilene ghiacciate. Quindi, rimettere le bottiglie sul ghiaccio per 20 minuti per raffreddarle. Successivamente, recuperare le cellule tramite centrifugazione. Scartare i surnatanti e posizionare le bottiglie capovolte su un tovagliolo di carta. Quindi, risospendere il pellet batterico in cinque millilitri di soluzione ghiacciata di cloruro di calcio e cloruro di magnesio e agitare accuratamente fino a quando il pellet non si è completamente sciolto. Quindi, aggiungere altri 25 millilitri di soluzione al pellet batterico disciolto. Risospendere l'altro pellet batterico come precedentemente dimostrato. Successivamente, ripetere la centrifugazione e rimuovere i surnatanti. Se le cellule competenti devono essere trasformate direttamente, risospendere ogni pellet batterico in due millilitri di una soluzione ghiacciata di cloruro di calcio molare 0,1 molare facendo roteare accuratamente le provette. Per iniziare la procedura di trasformazione, trasferire 50 microlitri di cellule competenti in due provette di polipropilene da 1,5 millilitri etichettate. Quindi, aggiungere un microlitro di DNA plasmidico pUC19 a una delle provette. Mescolare delicatamente, evitando la formazione di bolle, e incubare entrambe le provette per 30 minuti con ghiaccio. Dopo l'incubazione, trasferire le provette in un blocco termico e incubare a 42 gradi Celsius per 45 secondi. Trasferire immediatamente le provette nel ghiaccio e incubare per due minuti. Ora, aggiungere 950 microlitri di terreno SOC a ciascuna provetta e incubarle per un'ora a 37 gradi Celsius per consentire ai batteri di riprendersi ed esprimere il marcatore di resistenza agli antibiotici codificato nel plasmide. Per effettuare una diluizione da 1 a 100, aggiungere 990 microlitri di terreno SOC e 10 microlitri di sospensione cellulare a una provetta da 1,5 millilitri. Quindi, effettuare una diluizione da 1 a 10 aggiungendo 900 microlitri di terreno SOC e 100 microlitri di sospensione cellulare a una provetta da 1,5 millilitri. Successivamente, impiattare 100 microlitri di sospensioni cellulari diluite e 100 microlitri di controllo negativo, su piastre selettive separate contenenti ampicillina utilizzando un divaricatore e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 12-16 ore. Dopo l'incubazione, contare le unità formanti colonie, o CFU, per piastra, ottenute attraverso la trasformazione, e registrare questi dati. Per verificare che i trasformanti abbiano il plasmide pUC19, prelevare una singola colonia ben isolata da una piastra con un ansa sterile e introdurla in una provetta contenente 3 millilitri di brodo LB. Quindi, incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione, durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare un mini kit di preparazione del DNA per isolare il DNA da 3 millilitri di coltura, secondo le istruzioni del produttore. Dopo aver completato la mini preparazione del DNA, digerire 1 microgrammo di pUC19 purificato con un enzima di restrizione a 37 gradi Celsius per 1 ora. Ora, caricare 20 microlitri di una scala di peso molecolare, 1 microgrammo di DNA plasmidico digerito e 1 microgrammo di DNA plasmidico non digerito in pozzetti consecutivi di un gel di agarosio all'1% contenente 1 microgrammo per millilitro di bromuro di etidio. Quindi, fai funzionare il gel per 1 ora a 95 volt. Infine, visualizza il gel con un illuminatore UV. In questo esperimento, le cellule di E. coli DH5 alfa chimicamente competenti sono state preparate utilizzando un adattamento della procedura del cloruro di calcio e poi trasformate con il plasmide pUC19 per determinare l'efficienza della trasformazione. Per calcolare l'efficienza di trasformazione, utilizzare i conteggi CFU registrati per le diluizioni 1 su 100 e 1 su 10 e qualsiasi altra diluizione con conteggi CFU compresi tra 30 e 300. In primo luogo, la conta delle CFU registrate, 246 in questo esempio, viene divisa per la quantità di DNA, 0,0001 microgrammi qui, che è stata placcata. Quindi, questo numero viene diviso per il fattore di diluizione utilizzato per ottenere l'efficienza di trasformazione in CFU per microgrammo. In questo esempio, è stata utilizzata una diluizione da 1 a 10 e sono stati piastrati 100 microlitri di una soluzione da 1 millilitro, ottenendo un fattore di diluizione finale di 0,01. Nella corsia plasmidica non digerita, il DNA circolare può apparire come due o tre bande diverse di luminosità variabile. Questo perché il DNA circolare non tagliato può esistere in diversi stati di conformazione, come superavvolto, cerchio aperto o più lineare, e ognuno di questi si muove attraverso il gel a velocità diverse. L'analisi della digestione del DNA plasmidico recuperato ha indicato che il plasmide utilizzato ha una dimensione prevista di DNA pUC19, 2.686 coppie di basi.

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calcium chloride dna uptake in e. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency.

Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation. Transformation is the process in which bacteria take up free DNA from the environment. In the lab, it usually includes four steps: preparing competent cells, mixing cells with DNA, recovering the cells, and plating them so transformants can grow.

For transformation to occur, cells must be competent, which means they can take in DNA. Some bacteria become naturally competent under certain conditions. Others do not, or the conditions are not known. For that reason, scientists often make cells artificially competent. Two common approaches are chemical treatment and electroporation, which uses electric pulses to open pores in the cell membrane.

This protocol uses calcium ions, especially Ca2+, to create chemical competence. It is mainly used with Gram-negative bacteria. E. coli cells and their outer membrane carry negative charge, and DNA is also negatively charged. Calcium helps neutralize this repulsion so DNA can attach to the cell surface. The cells and DNA are kept on ice during this step, and then a heat shock at 42°C helps drive DNA into the cells.

The cells must be in mid-exponential growth phase before heat shock. At other growth stages, they are more sensitive to heat and may lose viability. That lowers transformation efficiency. The DNA used for transformation is usually a plasmid, which is a small circular double-stranded DNA molecule. To stay in the cell after transformation, the plasmid must have an origin of replication so it can copy itself independently of the bacterial chromosome.

Not every cell becomes transformed, so the result is a mix of transformed and non-transformed cells. To find the cells that received the plasmid, the procedure uses selection. Plasmids often carry selectable markers, such as antibiotic resistance genes or genes that rescue a growth need. After transformation, the cells are plated on selective media. In this case, the media contains ampicillin, which allows only the transformed cells to grow.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

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Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

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Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

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Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Questa collezione mostra gli strumenti chiave dell'indagine microbiologica, tra cui tecniche di mantenimento della sterilità e piastratura, come utilizzare terreni selettivi e arricchire i campioni e metodi di coltura per campioni misti o puri. Inoltre, esamina i metodi comuni per l'identificazione degli isolati microbici, nonché le procedure per la manipolazione genetica dei batteri.

See how calcium chloride makes E. coli competent for DNA uptake, then use heat shock and ampicillin selection to identify transformants.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli | JoVE K12

Natalia Martin

Andrew J. Van Alst

Rhiannon M. LeVeque

Victor J. DiRita

Department of Microbiology and Molecular Genetics

Michigan State University

Concepts

Performing the Experiment

Results

Genetic Lingo

Overview

An organism is diploid if it inherits two variants, or alleles, of each gene, one from each parent. These two alleles constitute the genotype ...

Punnett Squares

Overview

A Punnett square displays the possible genotypes offspring can inherit from two parental genotypes. If a trait&#x2019;s inheritance pattern ...

Monohybrid Crosses

Overview

In the 1850s and 1860s, Gregor Mendel investigated inheritance by performing monohybrid crosses in pea plants. He crossed two plants that were ...

Dihybrid Crosses

Overview

To determine whether traits are inherited together or separately, Gregor Mendel crossed pea plants that differed in two traits. These parental ...

Law of Segregation

When crossing pea plants, Mendel noticed that one of the parental traits would sometimes disappear in the first generation of offspring, called the F1 ...

Law of Independent Assortment

While Mendel&#x2019;s Law of Segregation states that the two alleles for one gene are separated into different gametes, a different question of how ...

Test Cross

Alleles are different forms of the same gene. Humans and other diploid organisms inherit two alleles of every gene, one from each parent.

An allele is ...

Pedigree Analysis

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Use Mendel's laws of segregation and independent assortment to analyze patterns of inheritance.

SC.912.L.16.1

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Discuss observed inheritance patterns caused by various modes of inheritance, including dominant, recessive, codominant, sex-linked, polygenic, and multiple alleles.

SC.912.L.16.2

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Describe the basic process of DNA replication and how it relates to the transmission and conservation of the genetic information.

SC.912.L.16.3

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

Mutations

Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

Mutation, Gene Flow, and Genetic Drift

In a population that is not at Hardy-Weinberg equilibrium, the frequency of alleles changes over time. Therefore, any deviations from the five conditions ...

Explain how mutations in the DNA sequence may or may not result in phenotypic change. Explain how mutations in gametes may result in phenotypic changes in offspring.

SC.912.L.16.4

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

RNA Structure

The basic structure of RNA consists of a string of ribonucleotides attached by phosphodiester bonds. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

Types of RNA

Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs perform diverse ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Bacterial RNA Polymerase

Eukaryotic RNA Polymerases

General Transcription Factors

Tissue-specific transcription factors contribute to diverse cellular functions in mammals. For example, the gene for beta globin, a major component of ...

RNA Polymerase II Accessory Proteins

Transcription Elongation Factors

pre-mrna-processing-modification-of-pre-mrna-ends

Pre-mRNA Processing: Modification of pre-mRNA Ends

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Pre-mRNA Processing: RNA Splicing

Transfer RNA Synthesis

Ribosomal RNA Synthesis

The Nucleolus

Additional Subnuclear Structures

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

Improving Translational Accuracy

Nonsense-mediated mRNA Decay

Molecular Chaperones and Protein Folding

The Proteasome

Regulated Protein Degradation

Proteins: From Genes to Degradation

Explain the basic processes of transcription and translation, and how they result in the expression of genes.

SC.912.L.16.5

Chromatin Structure and RNA Splicing

Alternative RNA Splicing

Nuclear Export of mRNA

Discuss the mechanisms for regulation of gene expression in prokaryotes and eukaryotes at transcription and translation level.

SC.912.L.16.6

Molecular Cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

Recombineering and Gene Targeting

One of the most widely used tools in modern biology is molecular cloning with restriction enzymes, which create compatible ends between DNA fragments that ...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

CRISPR

Bacterial Transformation

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Bacterial Transformation
ExpandFirst, ensure that each student or student group has a filled ice bucket.
Then, set up a tube rack for each work station.
...

Bacterial Transformation
ExpandIMPORTANT: In addition to wearing the appropriate personal protective equipment, be sure to take care to keep your face ...

Describe how viruses and bacteria transfer genetic material between cells and the role of this process in biotechnology.

A. DNA stores and transmits genetic information. Genes are sets of instructions encoded in the structure of DNA.

B. Genetic information is passed from generation to generation by DNA in all organisms and accounts for similarities in related individuals.

C. Manipulation of DNA in organisms has led to commercial production of biological molecules on a large scale and genetically modified organisms.

D. Reproduction is characteristic of living things and is essential for the survival of species.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

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