Name: plasmid dna transfer in bacteria
Uploaded: 2019-01-29T11:04:45.000Z
Duration: 4 min 33 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Florida Department of Education

High School

Life Science

SC.912.L.16

SC.912.L.16.7

Bacterial Transformation

All'inizio del XX secolo, un batteriologo britannico di nome Frederick Griffith stava lavorando con il batterio che causa la polmonite Streptococcus pneumoniae. Ha eseguito un semplice esperimento utilizzando due ceppi diversi. Un ceppo è noto come ceppo S a causa di una capsula protettiva che fa apparire lisce le colonie o i grumi che forma e lo rende anche virulento o dannoso. Il secondo era il ceppo R, una versione dei batteri priva della capsula protettiva, che dava alle colonie un aspetto ruvido e le rendeva non virulente.

In primo luogo, Griffith ha preso alcuni dei batteri del ceppo S e li ha riscaldati, producendo una versione uccisa dal calore del ceppo S. Poi, ha raccolto alcuni topi e li ha divisi in quattro gruppi. Iniettò nel primo gruppo il ceppo S virulento e nel secondo il ceppo R non virulento. Ha dosato il terzo gruppo con il ceppo S ucciso a caldo e, infine, ha combinato insieme il ceppo S ucciso a caldo e il ceppo R, e ha iniettato questa miscela nel quarto gruppo. Come previsto, i topi del primo gruppo sono morti e quelli del secondo e del terzo gruppo sono sopravvissuti. Ma con sorpresa di Griffith, anche i topi dell'ultimo gruppo sono morti.

Quando pubblicò il suo studio nel 1928, chiamò questo misterioso processo di trasformazione, poiché ipotizzò la presenza di un principio trasformante sottostante, che permise al ceppo precedentemente non virulento di diventare mortale. Più tardi, nel 1943, Avert, MacLeod e McCarty riferirono che questo principio trasformante era probabilmente l'acido desossiribonucleico, o DNA, che ora sappiamo essere il materiale ereditario. Essenzialmente ciò che è accaduto nell'esperimento di Griffith è stato che quando i batteri sono stati combinati, un po' di DNA è fuoriuscito dal ceppo S ucciso dal calore e nelle cellule del ceppo R, trasformando questi batteri non virulenti e passando le informazioni per creare la capsula protettiva, trasformando il ceppo R in uno virulento, ora in grado di uccidere gli animali del quarto gruppo.

Gli scienziati hanno sviluppato un modo molto più semplice per studiare la trasformazione batterica, utilizzando i batteri E. coli e piccoli anelli circolari di DNA chiamati plasmidi. Di solito, il plasmide utilizzato negli esperimenti di trasformazione include un gene per una funzione speciale, come la resistenza agli antibiotici. Gli E. coli sono un ottimo soggetto per la trasformazione perché possono mostrare una proprietà chiamata competenza, la capacità di assorbire il DNA dall'ambiente. In sostanza, ciò significa che in determinate condizioni ambientali, come una sostanza chimica o uno shock elettrico o termico, la parete cellulare dell'E. coli può diventare temporaneamente permeabile e consentire l'assorbimento del DNA dall'ambiente. Una volta che il plasmide si trova all'interno dell'E. coli, può rimanere nel citoplasma della sua nuova cellula ospite ed essere replicato ed espresso nel corso delle generazioni insieme al genoma, oppure può incorporarsi completamente nel genoma dell'ospite. Se i batteri perdono il plasmide in qualsiasi momento, anche la cellula perderà la sua resistenza agli antibiotici, e quindi gli scienziati coltivano i batteri in un terreno contenente l'antibiotico per garantire che gli unici sopravvissuti siano quelli che contengono il plasmide di interesse.

In questo laboratorio imparerai come trasformare le cellule di E. coli con un plasmide contenente un gene di resistenza agli antibiotici, mentre pratichi tecniche microbiologiche sterili.

trasformazione batterica

<h4>Sfondo</h4>

All'inizio del XX secolo, la polmonite era responsabile di gran parte dei decessi per malattie infettive1. Al fine di sviluppare un vaccino efficace contro la polmonite, Frederick Griffith si mise a studiare due diversi ceppi di Streptococcus pneumoniae: un ceppo non virulento con un aspetto ruvido (ceppo R) e un ceppo virulento con un aspetto liscio (ceppo S) a causa di una capsula polisaccaridica esterna2. Questo strato esterno dei batteri del ceppo S ha permesso loro di resistere al sistema immunitario dell'ospite, portando infine a una malattia pericolosa per la vita. Quando Griffith iniettò separatamente nei topi batteri uccisi dal calore di entrambi i ceppi, i topi sopravvissero. Tuttavia, quando ha iniettato nei topi una combinazione del ceppo S ucciso dal calore con il ceppo R vivo, i topi sono morti2. Quando ha analizzato i campioni ottenuti da topi morti iniettati con la combinazione, ha osservato la presenza di batteri vivi del ceppo S. Nel 1928, Griffith notò che doveva essersi verificato un processo di "trasformazione" per cambiare i batteri non virulenti nel ceppo virulento. Come prima scoperta nota della trasformazione batterica, la sua scoperta ha aperto la strada allo sviluppo di uno strumento essenziale nell'ingegneria genetica: la trasformazione3.

La trasformazione è il cambiamento genetico in una cellula dovuto all'assunzione di DNA dall'ambiente. Nell'esperimento di Griffith, il DNA che codifica il rivestimento protettivo in polisaccaridi dei batteri del ceppo S non si è scomposto a causa dello shock termico ed è stato introdotto nel ceppo R, consentendo a quest'ultimo di bypassare il sistema immunitario del topo. Mentre questo processo avviene costantemente in natura tra organismi e persino specie diverse, gli scienziati trasformano i batteri in ambienti di laboratorio per scopi di ricerca4.

<h4>Trasformazione batterica con plasmidi</h4>

I batteri sono gli organismi ideali per la trasformazione in quanto possono facilmente assorbire materiale genetico esogeno nel loro genoma e amplificarlo rapidamente3,5. Hanno un cromosoma circolare e più piccoli pezzi circolari di DNA a doppio filamento chiamati plasmidi all'interno del citoplasma. Questi plasmidi possono replicarsi indipendentemente dal DNA cromosomico e generalmente forniscono alcuni benefici funzionali, come la resistenza agli antibiotici6,7. Nel loro ambiente naturale, i batteri subiscono una "trasformazione batterica" assorbendo plasmidi da altri batteri in un processo chiamato coniugazione8. Inoltre, quando si moltiplicano, ciascuno dei loro discendenti riceve una copia del nuovo plasmide.

I plasmidi utilizzati per scopi sperimentali sono chiamati vettori plasmidici. In un ambiente di laboratorio, gli scienziati possono creare artificialmente "plasmidi ricombinanti" lunghi circa 5.000-10.000 coppie di basi inserendo frammenti di DNA in un vettore plasmidico. Questi plasmidi ricombinanti di solito hanno alcuni componenti: un'origine di replicazione (ORI), un gene di resistenza agli antibiotici, un sito di clonazione multiplo, un promotore, un marcatore di selezione e il gene di interesse. L'origine della replica è il punto in cui inizia la replica. Il gene della resistenza agli antibiotici consente ai batteri che assorbono il plasmide di sopravvivere sulle piastre in presenza di un determinato farmaco antibiotico. Sebbene i plasmidi siano pezzi di DNA relativamente piccoli, gli scienziati devono trattare le cellule ospiti per consentire la penetrazione del plasmide attraverso la membrana cellulare. Quindi, l'efficienza della trasformazione è direttamente correlata alla porosità della membrana ospite. Un approccio comune consiste nello shock termico dei batteri che sono stati trattati con una soluzione di cloruro di calcio9. I batteri che non incorporano il plasmide non si trasformano e quindi non hanno resistenza per sopravvivere sulla piastra ed essere visibili. I siti di clonazione multipli aiutano l'inserimento del DNA contenendo siti per gli enzimi di restrizione per tagliare il plasmide dove il gene di interesse può essere inserito e legato. Il promotore guida la trascrizione del gene di interesse. È etichettato da un marcatore, di solito una proteina fluorescente come una proteina fluorescente verde (GFP), o può essere un gene aggiuntivo di resistenza agli antibiotici. Il gene della resistenza agli antibiotici e gli altri marcatori di selezione ci aiutano a determinare se i batteri raccolti contengono il plasmide di interesse.

<h4>Applicazioni</h4>

Metodi di trasformazione efficaci hanno permesso agli scienziati di isolare e profilare geni e prodotti genici e hanno portato a molti progressi nelle scienze della vita e nella medicina, come lo sviluppo di farmaci efficaci, la generazione di colture geneticamente modificate e strumenti diagnostici avanzati10. Inoltre, con i progressi tecnologici, sono emersi nuovi metodi di trasformazione. Ad esempio, il Gateway Cloning consente l'inserimento di più frammenti di DNA in diversi vettori e il trasferimento di sequenze di DNA tra plasmidi11. Inoltre, le ripetizioni palindrome brevi raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR)-Cas9 sono una tecnica di editing genetico che modifica direttamente i nucleotidi nel genoma e non richiede l'uso di plasmidi12. Dopo la trasformazione, i ricercatori spesso isolano e profilano il gene di interesse e i suoi prodotti. Successivamente, l'intero processo di clonazione genetica ha aperto un nuovo campo di manipolazione genetica. Grazie alla clonazione genetica, i ricercatori possono manipolare i batteri per produrre grandi quantità di proteine umane specifiche, come l'insulina, per il trattamento dei pazienti diabetici10. La clonazione ha anche svolto una grande importanza nell'agricoltura moderna. Gli organismi geneticamente modificati (OGM) sono il risultato diretto della clonazione genetica e della trasformazione batterica10. Ad esempio, gli scienziati stanno lavorando per generare colture geneticamente modificate con geni che fissano l'azoto incorporati nel loro genoma per aumentare la produzione alimentare e ridurre l'uso di fertilizzanti, diminuendo così l'impatto economico e ambientale dei fertilizzanti. In sintesi, la trasformazione batterica è il primo passo della biotecnologia moderna e il fondamento delle future scoperte della ricerca.

<h4>Referenze</h4>

<ol class="riferimenti">
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</ol>

Trasformazione batterica

Sfondo

All'inizio del XX secolo, la polmonite era responsabile di gran parte dei decessi per malattie infettive1. Al fine di sviluppare un vaccino efficace ...

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Biologia

Genetics

Genetica

plasmid dna transfer in bacteria

Plasmid DNA transfer in bacteria helped launch modern genetic engineering. The idea traces back to Frederick Griffith’s work on pneumonia-causing Streptococcus pneumoniae in the early 20th century. He studied a rough, non-virulent R strain and a smooth, virulent S strain with a protective polysaccharide capsule. When he injected mice with heat-killed bacteria of either strain, the mice survived. But when heat-killed S-strain bacteria were mixed with live R-strain bacteria, the mice died, and live S-strain bacteria were found in the samples. Griffith concluded that a &quot;transformation&quot; had taken place. This was the first known discovery of bacterial transformation.

Transformation means a cell changes genetically after taking in DNA from its environment. In Griffith’s experiment, DNA that encoded the S-strain’s protective capsule was not destroyed by heat. That DNA entered the R-strain and helped it evade the mouse immune system. This process can happen naturally in the environment between organisms, and even between different species. Scientists also use transformation in the lab for research.

Bacteria are useful for transformation because they can take in outside genetic material and quickly copy it. They have one circular chromosome and many smaller circular DNA molecules called plasmids. Plasmids sit in the cytoplasm and can replicate on their own. They often carry useful traits, such as antibiotic resistance. In nature, bacteria can acquire plasmids from other bacteria through conjugation, and each new cell can inherit the plasmid when the bacteria divide.

In laboratories, plasmids used for experiments are called plasmid vectors. Scientists can build recombinant plasmids by inserting DNA fragments into a vector. These plasmids are usually about 5,000 to 10,000 base pairs long and often include an origin of replication, an antibiotic resistance gene, a multiple cloning site, a promoter, a selection marker, and the gene of interest. The origin of replication is where copying begins. The antibiotic resistance gene lets transformed bacteria survive on plates that contain a specific antibiotic.

Getting plasmids into bacteria often requires treating the host cells so the DNA can cross the cell membrane. Transformation efficiency depends on how porous the membrane is. One common method uses calcium chloride followed by heat shock. Bacteria that do not take up the plasmid do not transform, so they lack resistance and cannot grow on the plate. Multiple cloning sites help scientists insert DNA because they contain restriction enzyme cut sites. The promoter turns on transcription of the gene of interest. Scientists may track the inserted gene with a marker such as green fluorescent protein (GFP) or with another antibiotic resistance gene. These selection markers help confirm which bacteria contain the desired plasmid.

Transformation methods have had major effects on science and medicine. They helped researchers isolate and study genes and gene products and supported the development of drugs, genetically modified crops, and diagnostic tools. New cloning methods also continue to appear. Gateway Cloning can insert multiple DNA fragments into different vectors and move DNA between plasmids. CRISPR-Cas9 is another gene-editing method, but it directly changes nucleotides in the genome and does not require plasmids.

After transformation, researchers often isolate the gene of interest and study its product. This cloning work opened the door to genetic manipulation. It also allows bacteria to make large amounts of human proteins, such as insulin for diabetes treatment. Genetic cloning has also affected agriculture through genetically modified organisms, or GMOs. Scientists are working to add nitrogen-fixing genes to crops to improve food production and reduce fertilizer use. Bacterial transformation remains a key first step in modern biotechnology and an important base for future discoveries.

Plasmid DNA Transfer in Bacteria

genetics of organisms

Mendelian Traits and Exceptions

Mendelian genetics explains how traits move from parents to offspring. Gregor Mendel studied pea plants in 1865 and showed that many visible traits are controlled by two alleles, or gene versions, with one inherited from each parent. He also found that some alleles are dominant and others are recessive. Mendel’s work was not widely accepted until 1900, and it took about 30 more years for Mendelian inheritance to fit into evolutionary theory. One reason for the delay was that real breeding...

dna isolation and restriction enzyme analysis

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DNA Extraction, Quantification, and Cutting

DNA extraction, quantification, and cutting are key steps in many biology labs. Scientists use these methods to study genes, prepare DNA for testing, and compare fragments for analysis. DNA isolation starts with a small sample, such as a leaf, hair follicles, or epithelial cells from the mouth collected with a saline solution. The first steps are cell harvesting, lysis, protein degradation, and DNA precipitation. Lysis breaks open the cell and nuclear membranes so the DNA can be released from...

bacterial transformation

Plasmid DNA transfer in bacteria helped launch modern genetic engineering. The idea traces back to Frederick Griffith’s work on pneumonia-causing Streptococcus pneumoniae in the early 20th century. He studied a rough, non-virulent R strain and a smooth, virulent S strain with a protective polysaccharide capsule. When he injected mice with heat-killed bacteria of either strain, the mice survived. But when heat-killed S-strain bacteria were mixed with live R-strain bacteria, the mice died, and...

genetics

Learn how plasmid DNA transfer works in bacteria, from Griffith’s experiment to plasmids, selection markers, and biotechnology uses in high school science.

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Genetic Lingo

Overview

An organism is diploid if it inherits two variants, or alleles, of each gene, one from each parent. These two alleles constitute the genotype ...

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Overview

A Punnett square displays the possible genotypes offspring can inherit from two parental genotypes. If a trait&#x2019;s inheritance pattern ...

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Overview

In the 1850s and 1860s, Gregor Mendel investigated inheritance by performing monohybrid crosses in pea plants. He crossed two plants that were ...

Dihybrid Crosses

Overview

To determine whether traits are inherited together or separately, Gregor Mendel crossed pea plants that differed in two traits. These parental ...

Law of Segregation

When crossing pea plants, Mendel noticed that one of the parental traits would sometimes disappear in the first generation of offspring, called the F1 ...

Law of Independent Assortment

While Mendel&#x2019;s Law of Segregation states that the two alleles for one gene are separated into different gametes, a different question of how ...

Test Cross

Alleles are different forms of the same gene. Humans and other diploid organisms inherit two alleles of every gene, one from each parent.

An allele is ...

Pedigree Analysis

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Use Mendel's laws of segregation and independent assortment to analyze patterns of inheritance.

SC.912.L.16.1

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Discuss observed inheritance patterns caused by various modes of inheritance, including dominant, recessive, codominant, sex-linked, polygenic, and multiple alleles.

SC.912.L.16.2

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Describe the basic process of DNA replication and how it relates to the transmission and conservation of the genetic information.

SC.912.L.16.3

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

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In a population that is not at Hardy-Weinberg equilibrium, the frequency of alleles changes over time. Therefore, any deviations from the five conditions ...

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SC.912.L.16.4

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A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

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Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs perform diverse ...

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Bacterial RNA Polymerase

Eukaryotic RNA Polymerases

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tRNA Activation

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Termination of Translation

Improving Translational Accuracy

Nonsense-mediated mRNA Decay

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The Proteasome

Regulated Protein Degradation

Proteins: From Genes to Degradation

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SC.912.L.16.5

Chromatin Structure and RNA Splicing

Alternative RNA Splicing

Nuclear Export of mRNA

Discuss the mechanisms for regulation of gene expression in prokaryotes and eukaryotes at transcription and translation level.

SC.912.L.16.6

Molecular Cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

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Recombineering and Gene Targeting

One of the most widely used tools in modern biology is molecular cloning with restriction enzymes, which create compatible ends between DNA fragments that ...

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The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

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Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

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Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

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Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

CRISPR

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Bacterial Transformation
ExpandFirst, ensure that each student or student group has a filled ice bucket.
Then, set up a tube rack for each work station.
...

Bacterial Transformation
ExpandIMPORTANT: In addition to wearing the appropriate personal protective equipment, be sure to take care to keep your face ...

Describe how viruses and bacteria transfer genetic material between cells and the role of this process in biotechnology.

What is the Cell Cycle?

The cell cycle refers to the sequence of events occurring throughout a typical cell&#8217;s life. In eukaryotic cells, the somatic cell cycle has two ...

Interphase

The cell cycle occurs over approximately 24 hours (in a typical human cell) and in two distinct stages: interphase, which includes three phases of the ...

The Cell Cycle Control System

Positive Regulator Molecules

Inhibition of CDK Activity

S-Cdk Initiates DNA Replication

M-Cdk Drives Transition Into Mitosis

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Replicative Cell Senescence

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Cells Coordinate Growth and Proliferation

What is Cancer?

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Cancers Originate from Somatic Mutations in a Single Cell

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Loss of Tumor Suppressor Gene Functions

The Retinoblastoma Gene

Mechanisms of Retrovirus-induced Cancers

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The Ras Gene

Explain the relationship between mutation, cell cycle, and uncontrolled cell growth potentially resulting in cancer.

SC.912.L.16.8

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The central dogma explains the flow of genetic information from DNA nucleotides to the amino acid sequence of proteins.
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Human Genetics

Human genetics explores how genes influence physical traits such as height and eye color, behaviors like risk-taking and eating habits, and susceptibility ...

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Within the human body, a vast network of trillions of cells functions cohesively. Typically, each cell contains a nucleus with 46 chromosomes,&#160; a ...

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SC.912.L.16.9

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This video presents synthetic biology and its role in bioengineering. Synthetic biology refers to the methods used to genetically modify organisms in ...

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SC.912.L.16.10

A. DNA stores and transmits genetic information. Genes are sets of instructions encoded in the structure of DNA.

B. Genetic information is passed from generation to generation by DNA in all organisms and accounts for similarities in related individuals.

C. Manipulation of DNA in organisms has led to commercial production of biological molecules on a large scale and genetically modified organisms.

D. Reproduction is characteristic of living things and is essential for the survival of species.

Plasmid DNA Transfer in Bacteria

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