Name: dna extraction, quantification, and cutting
Uploaded: 2019-01-31T09:26:45.000Z
Duration: 4 min 46 s
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K12 Standards

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North Carolina K-12 Science Standard Course of Study

9-12

Biology

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Heredity- Inheritance and Variation of Traits

LS.Bio.8.1

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DNA Isolation and Restriction Enzyme Analysis

L'estrazione del DNA è la rimozione e la purificazione del DNA dalle cellule. In primo luogo, le cellule vengono lisate - aperte - di solito attraverso una combinazione di distruzione fisica e trattamento con sostanze chimiche, come un detergente che dissolve la cellula e le membrane nucleari. SDS o sodio dodecil solfato è un detergente di uso comune che agisce solubilizzando le proteine e i lipidi che compongono queste membrane. Il contenuto può quindi fluttuare liberamente nella soluzione circostante. 

Successivamente, il DNA deve essere separato dalle altre molecole presenti. La proteinasi K aggiunta alla reazione rompe i legami peptidici e digerisce le proteine contaminanti. Il sale viene quindi aggiunto al campione, che stabilizza i gruppi fosfato caricati negativamente nella spina dorsale del DNA e, dopo l'aggiunta di alcol ghiacciato, fa precipitare il DNA fuori dalla soluzione. Il precipitato bianco viene raccolto facendolo girare in una centrifuga dove si deposita sul fondo del tubo. Dopo averlo lavato e risospeso in una soluzione tampone, il DNA estratto può finalmente essere utilizzato in applicazioni di ricerca o biotecnologiche. 

Alcune applicazioni biotecnologiche, come l'impronta digitale del DNA, che possono identificare nuovi modelli nel DNA specifici di uno o più individui, comportano l'uso di enzimi di restrizione. Gli enzimi di restrizione sono molecole che interagiscono con il DNA e riconoscono sequenze specifiche. Una volta identificato il loro sito specifico, tagliano il DNA. Ciò comporterà il taglio del filo in uno o più pezzi lineari. Se il DNA estratto era un plasmide, un pezzo circolare di DNA che si trova più spesso nei batteri, qualsiasi taglio comporterà la formazione di uno o più frammenti lineari da parte del DNA. Diversi enzimi di restrizione riconoscono diverse sequenze di DNA, quindi l'utilizzo di una combinazione di questi può portare alla produzione di frammenti distinti. 

Nel DNA fingerprinting, possiamo quindi esaminare questi frammenti utilizzando una tecnica chiamata elettroforesi del DNA o gel. Per preparare i gel, l'agarosio in polvere viene mescolato con un tampone e riscaldato fino a quando non si scioglie. Una colorazione nucleotidica viene quindi aggiunta alla miscela calda e quindi questa soluzione viene versata nello stampo di colata. Viene inserito un pettine per formare i pozzetti. Una volta solidificato, il gel viene trasferito in una scatola di gel riempita di tampone e il pettine viene rimosso. Una miscela di riferimento di frammenti di DNA colorato di lunghezze note, la scala del DNA, viene aggiunta a un pozzetto e i campioni di DNA colorato di interesse vengono caricati nei pozzetti rimanenti. La scatola è collegata a una fonte di alimentazione e l'accensione induce la migrazione dei gruppi fosfato caricati negativamente nei nucleotidi del DNA attraverso il gel verso l'anodo, l'estremità positiva. I pezzi più piccoli si muovono più rapidamente dei frammenti più grandi, che migrano con difficoltà. 

Al termine della corsa, il gel viene esposto alla luce ultravioletta per visualizzare la colorazione nucleotidica nei campioni di DNA. La loro presenza può essere confermata in base alla loro posizione relativa alle fasce ladder. Poiché il DNA con sequenze diverse avrà siti di taglio in posizioni diverse, questo può produrre nuovi modelli di bande, o impronte digitali, che possono essere utilizzati per distinguere individui o profili di DNA varianti. 

In questo laboratorio eseguirai estrazioni di DNA utilizzando un tampone con e senza SDS per valutare l'importanza dei detergenti nell'isolamento del DNA e quindi digerirai il DNA plasmidico con diversi enzimi di restrizione per esaminare i profili di DNA risultanti.

analisi degli enzimi di isolamento e restrizione del dna

La rivelazione del DNA come molecola ereditaria in tutti gli organismi ha portato a enormi scoperte scientifiche e mediche e ha migliorato significativamente la nostra comprensione di noi stessi e degli altri organismi. L'isolamento e la profilazione del DNA sono stati i primi passi fondamentali per molti dei progressi del secolo scorso; Dall'identificazione della funzione genica, alle rivoluzioni dell'agricoltura e della medicina legale.

<h4>Isolare il DNA dalle cellule</h4>

L'isolamento del DNA è una procedura abbastanza semplice che richiede pochi ma essenziali passaggi: raccolta cellulare, lisi, degradazione delle proteine e infine precipitazione del DNA. Generalmente, il DNA può essere raccolto da piccole quantità di tessuto, come una singola foglia di una pianta, follicoli piliferi di animali o cellule epiteliali che possono essere facilmente rimosse all'interno della bocca con una semplice soluzione salina. Poiché il DNA è compartimentalizzato all'interno del nucleo o dei mitocondri all'interno delle cellule eucariotiche, gli scienziati prima rompono la cellula e la membrana nucleare per esporre il DNA, che viene fatto con la fase di lisi. Tuttavia, una volta esposto, il DNA può essere degradato da ioni di metalli pesanti e pH estremi. Pertanto, una soluzione tampone contenente detergente viene utilizzata non solo per dissolvere la membrana cellulare, ma anche per proteggere il DNA dalla degradazione degli elementi nella soluzione. Inoltre, il DNA è una molecola insolitamente lunga che si condensa all'interno del nucleo impacchettandosi strettamente attorno a speciali proteine chiamate istoni. Pertanto, un enzima chiamato proteinasi K, che degrada i legami peptidici delle proteine, viene aggiunto per separare il DNA dagli istoni e da altre proteine. Successivamente, gli scienziati separano il DNA dal resto dell'estratto cellulare utilizzando le sue proprietà chimiche. A causa della struttura caricata negativamente degli acidi nucleici, gli ioni Na+ in una soluzione di cloruro di sodio si legano e si integrano in filamenti di DNA aggrovigliati. Una volta che il DNA è raggruppato, può essere osservato ad occhio nudo. Il DNA è insolubile in alcol e precipita facilmente a basse temperature, quindi gli scienziati aggiungono alcol freddo per precipitare il DNA. Infine, il DNA precipitato può essere disciolto e conservato in acqua deionizzata o in un tampone delicato, privo di enzimi che possono degradare gli acidi nucleici, fino a quando non viene utilizzato.

<h4>Quantificazione del DNA</h4>

Le reazioni che utilizzano il DNA spesso richiedono un'elevata purezza e quantità precise di DNA. Pertanto, dopo l'isolamento del DNA, gli scienziati utilizzano uno spettrofotometro per quantificare la quantità di DNA nel loro campione, nonché la purezza del DNA nel campione. Uno spettrofotometro misura l'intensità di un raggio di luce passato attraverso un campione in funzione della sua lunghezza d'onda. Gli acidi nucleici assorbono la luce a 260 nm, mentre le proteine assorbono la luce a 280 nm. Misurando l'intensità di un raggio di luce a 260 nm, gli scienziati possono determinare la concentrazione di DNA. Inoltre, valutando l'intensità della luce sia a 260 nm che a 280 nm, è possibile determinare la purezza del contenuto di DNA. In un campione di DNA puro, il rapporto 260/280 nm dovrebbe avvicinarsi al valore di 2.

<h4>Enzimi di restrizione</h4>

Per una serie di analisi, come la clonazione, il sequenziamento e la mappatura di frammenti di DNA e genomi, il DNA isolato deve essere tagliato in sequenze specifiche utilizzando enzimi di restrizione. Questi enzimi sono prodotti dai batteri come meccanismi di immunità innata contro l'intrusione del DNA virale e funzionano come forbici molecolari. Quindi, dopo che gli enzimi di restrizione hanno identificato un DNA virale, iniziano a romperlo tagliandolo in segmenti in determinate sequenze nucleotidiche che riconoscono. Queste sequenze nucleotidiche sono spesso lunghe da sei a dodici nucleotidi e sono generalmente palindromiche, il che significa che hanno la stessa sequenza nucleotidica nelle direzioni 3'-5' e 5'-3'. Ad esempio, l'enzima di restrizione EcoRI taglia il DNA alla sequenza 3'... GAATTC...-5', che si legge allo stesso modo nella direzione 5'-3'. Come EcoRI, ci sono centinaia di enzimi che corrispondono a molte sequenze palindromiche distinte. Una volta che il DNA viene tagliato da questi enzimi, gli scienziati possono caricare il DNA su un gel in una camera di elettroforesi e far passare la corrente elettrica attraverso il gel. Il DNA trasporta cariche negative, che fanno migrare i frammenti di DNA verso l'anodo. Tuttavia, i pori del gel rallentano i frammenti di DNA più grandi rispetto alle sequenze di DNA più piccole, quindi i pezzi si separano in base alle loro dimensioni. Dopo il completamento dell'elettroforesi, i frammenti di DNA possono essere visualizzati con l'aiuto di coloranti che si legano specificamente alle molecole di DNA.

Il taglio del DNA con enzimi di restrizione e la separazione di frammenti di DNA con l'elettroforesi consentono ai ricercatori di identificare le dimensioni dei frammenti sconosciuti rispetto a una scala standard. Questi frammenti di interesse possono poi essere ulteriormente isolati e legati in un vettore plasmidico per la clonazione genetica. L'ingegneria genetica e le analisi di laboratorio sono state migliorate enormemente con questi metodi. Con la profilazione del DNA, gli scienziati sono in grado di sequenziare i genomi per comprendere ulteriormente il funzionamento degli organismi e sono anche in grado di identificare e caratterizzare alcuni geni1.

L'isolamento e la profilazione del DNA sono pratici anche per eventi che hanno un impatto diretto sulla vita quotidiana. Ad esempio, gli scienziati forensi analizzano abitualmente i campioni di DNA per fornire prove per cause penali e civili2. Allo stesso modo, gli operatori sanitari estraggono e analizzano il DNA per verificare la paternità e le malattie genetiche. Recentemente, i kit di analisi del DNA per l'ascendenza sono diventati popolari consentendo agli utenti di determinare il loro lignaggio genetico, trovare parenti e persino scoprire la loro predisposizione genetica a varie condizioni di salute3. Infine, con i progressi della biotecnologia e dell'ingegneria genetica, la medicina personalizzata sta guadagnando terreno tra i ricercatori clinici per sviluppare trattamenti utilizzando i dati genetici di un individuo, aprendo la strada a trattare efficacemente i pazienti senza effetti collaterali dannosi4.

<h4>Referenze</h4>

<ol class="riferimenti">
	<li>Chambers, GK, et al. Impronte digitali del DNA in zoologia: passato, presente, futuro. Investig Genet. 2014, Vol. 5, 3 doi: 10.1186/2041-2223-5-3.</li>
	<li>Roewer, L. Impronte digitali del DNA in medicina legale: passato, presente, futuro. Investig Genet. . 2013, Vol. 4, 22 doi: 10.1186/2041-2223-4-22.</li>
	<li>Kirkpatrick, BE e Rashkin, MD. Test di ascendenza e pratica della consulenza genetica. J Gen Counseling. 2016, vol. 26, 1 (6-20).</li>
	<li>Amburgo, MA e Collins, FS. Il percorso verso la medicina personalizzata. N Engl J Med . 2010; , Vol. 363, 301-304.</li>
</ol>

Analisi degli enzimi di isolamento e restrizione del DNA

La rivelazione del DNA come molecola ereditaria in tutti gli organismi ha portato a enormi scoperte scientifiche e mediche e ha migliorato significativamente il nostro ...

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dna extraction, quantification, and cutting

DNA extraction, quantification, and cutting are key steps in many biology labs. Scientists use these methods to study genes, prepare DNA for testing, and compare fragments for analysis.

DNA isolation starts with a small sample, such as a leaf, hair follicles, or epithelial cells from the mouth collected with a saline solution. The first steps are cell harvesting, lysis, protein degradation, and DNA precipitation. Lysis breaks open the cell and nuclear membranes so the DNA can be released from the nucleus or mitochondria in eukaryotic cells. A detergent-containing buffer helps dissolve membranes and also protects DNA from degrading conditions such as heavy metal ions and extreme pH.

After the DNA is exposed, Proteinase K is added. This enzyme breaks peptide bonds in proteins and helps separate DNA from histones and other proteins. The DNA is then mixed with sodium chloride, and Na+ ions help the tangled DNA strands clump together because nucleic acids carry negative charges. Cold alcohol is added next, since DNA does not dissolve in alcohol and will precipitate at low temperatures. The DNA can then be dissolved in deionized water or a mild buffer for storage, as long as the solution is free of enzymes that could break it down.

Once DNA is isolated, scientists often measure how much DNA they have and how pure it is. A spectrophotometer does this by sending light through the sample at specific wavelengths. DNA absorbs light at 260 nm, while proteins absorb light at 280 nm. The 260 nm reading shows DNA concentration, and the 260/280 ratio helps estimate purity. In a sample of pure DNA, that ratio should approach 2.

For cloning, sequencing, and mapping DNA fragments or genomes, scientists often need to cut DNA at specific sites. They use restriction enzymes, which are bacterial proteins that act like molecular scissors against invading viral DNA. These enzymes recognize short nucleotide sequences, often six to twelve bases long, and the sequences are usually palindromic, meaning they read the same in both directions. EcoRI is one example and cuts at the sequence GAATTC.

After cutting, the DNA fragments are loaded into a gel and separated by electrophoresis. DNA is negatively charged, so it moves toward the anode when an electric current is applied. Smaller fragments travel faster through the gel pores than larger ones, so the pieces separate by size. Dyes that bind to DNA make the fragments visible, and researchers compare them with a standard ladder to estimate fragment size. The fragments can then be isolated and ligated into a plasmid vector for genetic cloning.

These methods support many modern applications. Scientists use DNA profiling to sequence genomes and to identify and study genes. DNA analysis also helps in forensics for criminal and civil cases, in paternity testing, and in checks for genetic diseases. Ancestry kits use DNA to help people trace lineage, find relatives, and learn about possible health traits. These tools also support personalized medicine, where researchers use a person’s genetic data to design treatments with fewer harmful side effects.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting

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genetics of organisms

Mendelian Traits and Exceptions

Mendelian genetics explains how traits move from parents to offspring. Gregor Mendel studied pea plants in 1865 and showed that many visible traits are controlled by two alleles, or gene versions, with one inherited from each parent. He also found that some alleles are dominant and others are recessive. Mendel’s work was not widely accepted until 1900, and it took about 30 more years for Mendelian inheritance to fit into evolutionary theory. One reason for the delay was that real breeding...

dna isolation and restriction enzyme analysis

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bacterial transformation

Plasmid DNA Transfer in Bacteria

Plasmid DNA transfer in bacteria helped launch modern genetic engineering. The idea traces back to Frederick Griffith’s work on pneumonia-causing Streptococcus pneumoniae in the early 20th century. He studied a rough, non-virulent R strain and a smooth, virulent S strain with a protective polysaccharide capsule. When he injected mice with heat-killed bacteria of either strain, the mice survived. But when heat-killed S-strain bacteria were mixed with live R-strain bacteria, the mice died, and...

genetics

Learn how DNA is isolated, measured with a spectrophotometer, cut with restriction enzymes, and separated by gel electrophoresis for analysis.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting | JoVE K12

Preparati a insegnare Analisi degli enzimi di isolamento e restrizione del DNA con questa guida per istruttori di 2 minuti. Copre i passaggi chiave di preparazione per il laboratorio Biology su JoVE Lab Manual.

Preparazione dell'istruttore per Analisi degli enzimi di isolamento e restrizione del DNA in Biology - Oltre 14K visualizzazioni | JoVE Lab Manual

Segui le procedure passo dopo passo di Analisi degli enzimi di isolamento e restrizione del DNA in questo video di protocollo studente di 13 minuti. Parte della collezione Biology su JoVE Lab Manual.

Protocollo studente per Analisi degli enzimi di isolamento e restrizione del DNA in Biology - Oltre 33K visualizzazioni | JoVE Lab Manual

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During embryogenesis, cells become progressively committed to different fates through a two-step process: specification followed by determination. ...

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Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

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Genome Size and the Evolution of New Genes

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Types of Genetic Transfer Between Organisms

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DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

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In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

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Construct an explanation to summarize how inheritable genetic variations may result from: new genetic combinations in meiosis, mutations during replication, or mutations caused by environmental factors.

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To dissect genetic processes or create organisms with novel suites of traits, scientists can perform genetic crosses, or the purposeful mating of two ...

Punnett Squares

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The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

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Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

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DNA Agarose Gel Electrophoresis

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Preparation of Solutions and Materials
ExpandNOTE: For this lab to run smoothly, it is recommended to not exceed 12 samples per laboratory class.
First ...

DNA Isolation
ExpandNOTE: In this experiment you will perform DNA isolation under two experimental conditions: one using a buffer containing the detergent ...

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Transgenic Organisms

Reproductive Cloning

CRISPR

Synthetic Biology

Synthetic biology is an interdisciplinary science that involves using principles from disciplines such as engineering, molecular biology, cell biology, ...

Ribosome Profiling

Ribosome profiling or ribo-sequencing is a deep sequencing technique that produces a snapshot of active translation in a cell. It selectively sequences ...

Transgenic Plants

Recombinant DNA technology called transgenesis is often used to add a foreign gene or remove a detrimental gene from an organism. Such genetically ...

Gene Therapy

biofuels-producing-ethanol-from-cellulosic-material

Biofuels: Producing Ethanol from Cellulosic Material

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
In this experiment, cellulosic material (such as corn stalks, leaves, ...

Testing For Genetically Modified Foods

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
Genetic modification of foods has been a controversial issue due to debated ...

Obtain and communicate information that summarizes the impact of biotechnology applications on the individual, society, and the environment, including agriculture and medicine.

LS.Bio.8.2

Understand genetic mechanisms for variation.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting

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