4.6

Microarray di DNA

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Un microarray di DNA contiene migliaia di sonde di DNA a filamento singolo disposte in una griglia su un chip di vetro o di silicio. Il DNA di interesse è marcato in fluorescenza e può ibridarsi con la sua sonda complementare sul microarray.

Questa tecnica consente la misurazione simultanea delle concentrazioni relative di specifiche sequenze di cDNA.

Comunemente, i microarray di DNA vengono utilizzati per quantificare l'espressione genica misurando i livelli di cDNA corrispondenti a particolari trascritti di mRNA.

Altri usi includono il rilevamento del legame dei fattori di trascrizione sulla cromatina o l'identificazione di variazioni a singolo nucleotide nel DNA genomico.

Le sonde microarray per la misurazione dell'mRNA sono segmenti di DNA a singolo filamento corrispondenti alla regione codificante di ciascun gene da analizzare. I nucleotidi della sonda possono essere copiati dal DNA genomico mediante PCR o sintetizzati direttamente sulla superficie del chip.

Queste sonde sono attaccate in modo covalente a un chip che forma una serie di punti, in cui ogni sito rappresenta un singolo bersaglio. Pertanto, un microchip di DNA può analizzare decine di migliaia di geni.

Per un'analisi dell'intero genoma, il contenuto totale di mRNA viene isolato dalle cellule di un organismo e convertito in cDNA marcato in fluorescenza. Quando questo campione viene esposto a un chip di microarray di DNA, le sonde si accoppiano con i loro cDNA complementari.

Il segnale fluorescente in ogni punto è direttamente proporzionale alla quantità di cDNA legato e può essere analizzato dal software appropriato per quantificare l'espressione genica.

Sebbene questa analisi non produca le concentrazioni assolute degli mRNA, può essere utilizzata per confrontare le loro concentrazioni relative, quindi i livelli di espressione genica, in due campioni in condizioni diverse.

Un campione di riferimento potrebbe essere etichettato con un fluoroforo verde, mentre un campione di prova sarebbe etichettato in rosso.

Se il campione di prova ha un'espressione più bassa rispetto al campione di riferimento, la macchia appare verde, mentre un'espressione più alta è indicata da una macchia rossa. Il giallo indica livelli di espressione uguali in entrambi i campioni.

Overview

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I microarray sono test ad alta produttività e relativamente economici che possono essere automatizzati per analizzare grandi quantità di dati alla volta. Sono utilizzati negli studi sull'intero genoma per confrontare l'espressione di geni o proteine in due diverse condizioni, come stati sani e malati. I microarray sono costituiti da vetrini di vetro o silice, su cui le molecole sonda sono attaccate covalentemente attraverso la funzionalizzazione della superficie. Nella maggior parte dei casi, i vetrini vengono preparati attraverso il chemiassorbimento dei silani sulle superfici di silice.

Mentre i microarray di DNA vengono utilizzati per monitorare l'espressione genica, i microarray di proteine rilevano interazioni biologicamente rilevanti di una proteina marcata in modo fluorescente con altre proteine, DNA o piccole molecole.

I vetrini di microarray di DNA sono spesso chiamati chip genetici o chip di DNA. I chip di DNA sono ampiamente utilizzati per profilare migliaia di geni parallelamente. Oltre all'espressione genica, vengono utilizzati anche per studiare l'espressione di microRNA, i numeri di copie del DNA e il rilevamento del polimorfismo a singolo nucleotide. Commercialmente, questi chip vengono utilizzati in biotecnologia, medicina legale, tossicologia, scoperta di farmaci e terapie mirate per malattie infettive e genetiche.

La natura chimicamente stabile delle sonde di DNA rende i chip di DNA la più popolare tra le tecnologie di microarray. La sonda di DNA a filamento singolo, legata in modo covalente, mantiene le sue interazioni native nonostante le sostanze chimiche aggressive e le temperature utilizzate durante il caricamento della sonda e la preparazione del chip.

Il difetto più evidente dei microarray di DNA è il prerequisito di una sequenza bersaglio nota. Poiché le sonde per microarray di DNA sono progettate per completare la sequenza di cDNA target, è necessario conoscere la sequenza dell'mRNA da cui viene copiato il cDNA. Ciò rende la tecnologia inutilizzabile durante la ricerca di nuove sequenze di mRNA. Per tali scopi, RNASeq è l'opzione preferita, anche se costosa.

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Un microarray di DNA contiene migliaia di sonde di DNA a filamento singolo disposte in una griglia su un chip di vetro o di silicio. Il DNA di interesse è marcato in fluorescenza e può ibridarsi con la sua sonda complementare sul microarray.

Questa tecnica consente la misurazione simultanea delle concentrazioni relative di specifiche sequenze di cDNA.

Comunemente, i microarray di DNA vengono utilizzati per quantificare l'espressione genica misurando i livelli di cDNA corrispondenti a particolari trascritti di mRNA.

Altri usi includono il rilevamento del legame dei fattori di trascrizione sulla cromatina o l'identificazione di variazioni a singolo nucleotide nel DNA genomico.

Le sonde microarray per la misurazione dell'mRNA sono segmenti di DNA a singolo filamento corrispondenti alla regione codificante di ciascun gene da analizzare. I nucleotidi della sonda possono essere copiati dal DNA genomico mediante PCR o sintetizzati direttamente sulla superficie del chip.

Queste sonde sono attaccate in modo covalente a un chip che forma una serie di punti, in cui ogni sito rappresenta un singolo bersaglio. Pertanto, un microchip di DNA può analizzare decine di migliaia di geni.

Per un'analisi dell'intero genoma, il contenuto totale di mRNA viene isolato dalle cellule di un organismo e convertito in cDNA marcato in fluorescenza. Quando questo campione viene esposto a un chip di microarray di DNA, le sonde si accoppiano con i loro cDNA complementari.

Il segnale fluorescente in ogni punto è direttamente proporzionale alla quantità di cDNA legato e può essere analizzato dal software appropriato per quantificare l'espressione genica.

Sebbene questa analisi non produca le concentrazioni assolute degli mRNA, può essere utilizzata per confrontare le loro concentrazioni relative, quindi i livelli di espressione genica, in due campioni in condizioni diverse.

Un campione di riferimento potrebbe essere etichettato con un fluoroforo verde, mentre un campione di prova sarebbe etichettato in rosso.

Se il campione di prova ha un'espressione più bassa rispetto al campione di riferimento, la macchia appare verde, mentre un'espressione più alta è indicata da una macchia rossa. Il giallo indica livelli di espressione uguali in entrambi i campioni.

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