15.10: RT-PCR in tempo reale

La reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa in tempo reale, o RT-PCR in tempo reale, è uno strumento analitico utilizzato per determinare il livello di espressione dei geni bersaglio. Il metodo prevede la conversione dell'mRNA in DNA complementare con l'aiuto di un enzima noto come trascrittasi inversa, seguita dall'amplificazione PCR del cDNA. Questi due processi possono essere eseguiti simultaneamente in un unico tubo o separatamente come reazione in due fasi.

La quantificazione in tempo reale del numero di prodotti amplificati viene effettuata utilizzando coloranti fluorescenti o sonde sequenze-specifiche collegate ad un fluoroforo. I coloranti fluorescenti utilizzati in questo caso possono legarsi specificamente al DNA a doppio filamento e mostrare fluorescenza solo quando legati al DNA. La fluorescenza viene misurata alla fine di ogni ciclo di PCR dopo la sintesi del filamento complementare. Nel caso delle sonde marcate con fluoroforo, la fluorescenza si manifesta quando il fluoroforo viene separato dalla sonda durante la sintesi del filamento complementare. La fluorescenza esibita da queste molecole viene quindi rilevata da fotorilevatori che convertono i segnali di fluorescenza in un formato leggibile. La RT-PCR in tempo reale richiede una macchina PCR specializzata dotata di un rilevatore per consentire la quantificazione in tempo reale, poiché una macchina PCR tradizionale non è attrezzata per tale analisi.

L’output può essere analizzato in diversi modi. Un modo è contare il numero di cicli necessari affinché la fluorescenza raggiunga livelli rilevabili. Il ciclo soglia, indicato con C^t, è quando la fluorescenza viene rilevata al di sopra del rumore di fondo. Maggiore è la quantità di target nel materiale di partenza, più velocemente apparirà l'aumento significativo della fluorescenza, con conseguente C^t inferiore. Il valore C^t trova applicazione nella quantificazione a valle o nel rilevamento della presenza o dell'assenza della sequenza target. Inoltre, confrontando i valori C^t di campioni a concentrazione sconosciuta con una serie di valori C^t ottenuti dalla concentrazione standard è possibile determinare la quantità di stampo in una reazione sconosciuta. Questa è nota come quantificazione assoluta e può essere eseguita anche confrontando la fluorescenza con una curva standard preparata utilizzando concentrazioni di DNA note.

La reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale, o RT-PCR in tempo reale, può quantificare un RNA di interesse man mano che la reazione progredisce.

Per iniziare, la trascrittasi inversa copia l'RNA in cDNA complementare. La RNasi H digerisce l'RNA originale, lasciando dietro di sé piccoli primer attaccati al cDNA.

Un filamento complementare viene quindi sintetizzato dalla DNA polimerasi.

L'amplificazione mirata può quindi essere effettuata utilizzando la PCR per creare copie esponenziali di segmenti specifici. I due fili vengono separati all'inizio di ogni ciclo ad alte temperature. I primer oligonucleotidici complementari vengono quindi ricotti a ciascun filamento di cDNA e vengono estesi dalla DNA polimerasi.

Il DNA può essere quantificato utilizzando uno dei due diversi metodi di rilevamento basati sulla fluorescenza. Un metodo utilizza coloranti che emettono fluorescenza solo quando sono legati al DNA a doppio filamento.

Il colorante si lega al DNA, dove il filamento originale è accoppiato con un filamento complementare di nuova sintesi. Alla fine di ogni ciclo di PCR, un'appropriata lunghezza d'onda della luce eccita il colorante legato.

L'altro metodo utilizza sonde oligonucleotidiche complementari sequenziali specifiche legate a un fluoroforo e a una molecola di quencher.

La reazione è continuamente esposta a una lunghezza d'onda della luce appropriata e la molecola di quencher assorbe la fluorescenza del fluoroforo quando è vicina l'una all'altra. La DNA polimerasi stacca il fluoroforo durante l'estensione, impedendo il quenching.

Il metodo basato su probe è specifico, in quanto si collega solo alla sequenza di destinazione. Al contrario, il metodo basato sul colorante non è specifico e si lega a tutto il DNA a doppio filamento.

In entrambi i casi, la fluorescenza emessa dal fluoroforo eccitato viene rilevata da fotorivelatori che convertono i segnali ricevuti in un'uscita digitale.

Il ciclo di soglia, o Ct, è il numero di cicli di PCR affinché la fluorescenza raggiunga un livello prestabilito ben al di sopra della fluorescenza di fondo.

Il ciclo di soglia è inversamente proporzionale alla quantità di RNA bersaglio nel campione iniziale: più basso è il ciclo di soglia, maggiore è la quantità di RNA di interesse.

La quantificazione assoluta confronta il ciclo di soglia o l'intensità della fluorescenza con quella di una curva standard preparata utilizzando concentrazioni di DNA note.

In alternativa, la quantificazione relativa confronta la fluorescenza di un campione con quella di un riferimento. Questo metodo può essere utilizzato per confrontare i cambiamenti nell'espressione genica in diverse condizioni.