32.8: Principi della cromatografia su colonna

La tecnica della cromatografia fu inventata per la prima volta nel 1901 da Michael S. Tswett, un botanico russo, per separare i pigmenti vegetali utilizzando solventi organici. Inoltre, nel 1941, Archer John Porter Martin e R. L. M. Synge modificarono la tecnica inserendo il gel di silice in una colonna. Una miscela di amminoacidi è stata quindi separata sulla colonna impaccata utilizzando una miscela di cloroformio e acqua come fase mobile. Questo è stato il primo rapporto sulla cromatografia su colonna. Attualmente, la cromatografia su colonna è una tecnica ampiamente utilizzata per separare vari tipi di composti da una miscela campione.

Fattori che influenzano la separazione efficiente delle proteine

Vari parametri come il materiale della colonna, l'impaccamento e le condizioni operative come le velocità di flusso e la temperatura determinano l'efficienza della separazione mediante cromatografia su colonna.

La scelta del materiale o della matrice della colonna determina l'entità dell'interazione con il campione. Il materiale della matrice deve essere impaccato saldamente e uniformemente nella colonna. Bolle d'aria, detriti, particelle di grandi dimensioni e precipitati interferiscono con il flusso uniforme del solvente attraverso la colonna, influenzandone l'efficienza di separazione. La colonna dovrebbe inoltre essere priva di particolato.

Il campione iniettato nella colonna deve essere limpido e privo di aggregati che potrebbero ostruire la colonna, ostacolando il flusso del solvente. Anche la portata del solvente influisce sulla separazione. Portate di solvente molto elevate o molto basse determinano una separazione inefficiente dei composti e dei preparati impuri. Velocità molto elevate possono inoltre disturbare l'impaccamento della colonna, compromettendo l'efficienza del processo. Inoltre, anche la composizione del tampone di eluizione è un fattore importante. Dovrebbe essere non corrosivo e compatibile con il campione e anche con il materiale della colonna per prevenire la precipitazione o la dissoluzione in situ.

Anche un altro parametro operativo, la temperatura, gioca un ruolo importante nel processo. Decide la stabilità del campione, del materiale della colonna e del tampone solvente. Inoltre, una temperatura costante in tutta la colonna risolve in modo efficiente i composti. Dopo aver completato il processo di separazione, le colonne devono essere lavate accuratamente passando ripetutamente un solvente adatto per evitare la contaminazione del campione nelle analisi successive. Occasionalmente, il solvente viene fatto passare in una colonna nella direzione opposta per rimuovere qualsiasi materiale intasato.

Limitazioni

Sebbene sia una tecnica molto utilizzata, il metodo presenta ancora alcune limitazioni. È un metodo che richiede molto tempo poiché le velocità di flusso devono essere più lente per una migliore risoluzione dei composti. Inoltre, le grandi quantità di solventi altamente puri richiesti nella fase mobile rendono il processo costoso. Ciò aumenta anche i costi di aumento di scala quando sono necessarie rese più elevate di composti puri.

La cromatografia su colonna è una tecnica biochimica utilizzata per separare i composti in base alle loro proprietà fisiche e chimiche.

Ha due componenti principali: la fase stazionaria solida o matrice e la fase mobile liquida o solvente.

La colonna impacchettata con matrice viene caricata con un campione, come una miscela proteica. Il solvente viene quindi utilizzato per trasportare il campione attraverso la colonna.

All'interno della colonna, la matrice agisce come una maglia molecolare che filtra le proteine in base alle loro dimensioni o all'interazione con la matrice. Le proteine più grandi tendono a viaggiare più velocemente delle proteine più piccole, con conseguente separazione basata sulle dimensioni.

Inoltre, le proteine in un campione possono interagire con la matrice. Le interazioni deboli consentono alle proteine di passare rapidamente, mentre le interazioni forti trattengono le proteine all'interno della colonna.

Un cambiamento graduale del pH o della forza ionica del solvente altera le interazioni delle proteine con la matrice e aiuta a eluire le proteine in frazioni separate.