Foto-indotta cross-linking delle proteine non modificato (PICUP) permette la caratterizzazione della distribuzione dimensionale oligomeri in miscele proteiche metastabili. Dimostriamo applicazione di PICUP a tre peptidi rappresentante amiloidogenico il 40 - e 42-residuo forme di β-amiloide, proteina, e la calcitonina, e un peptide di controllo della crescita-fattore di rilascio dell'ormone.
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Articolo metodologico
Photo-Induced Cross-Linking delle proteine non modificati (PICUP) applicata a peptidi amiloidogenico
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'assemblaggio delle proteine amiloidogenica in oligomeri tossici è un evento fondamentale nella patogenesi delle malattie misfolding, tra cui l'Alzheimer, il Parkinson, la corea di Huntington e le malattie, ereditarie sclerosi laterale amiotrofica, e diabete di tipo 2. A causa della natura metastabile di queste assemblee di proteine, è difficile valutare la distribuzione delle dimensioni oligomero quantitativamente con metodi classici, come l'elettroforesi, cromatografia luce, fluorescenza, o dinamico dispersione. Oligomeri di proteine amiloidogenica esistono come miscele metastabile, in cui gli oligomeri dissociano in monomeri e associare in grandi gruppi contemporaneamente. PICUP stabilizza popolazioni oligomero da covalenti cross-linking e in combinazione con metodi di frazionamento, come il sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) o la dimensione-cromatografia di esclusione (SEC), PICUP fornisce istantanee delle distribuzioni di dimensioni oligomero che esisteva prima croce -linking. Quindi, PICUP permette la visualizzazione e l'analisi quantitativa delle popolazioni di proteine metastabili e possono essere utilizzati per monitorare le relazioni di assemblaggio e decifrare tra le modifiche sequenza e oligomerizzazione
Protocollo
1. Peptide preparazione
- Pesare ~ 100-200 mg di peptide liofilizzato utilizzando una microbilancia e trasferimento in etichetta, siliconato, a basso adsorbente tubi microcentrifuga. Qui, usiamo le sequenze umano di Aβ40, Aβ42, calcitonina, e GRF.
- Qui, usiamo peptidi pre-trattati con 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP) per ottenere omogeneo, aggregato senza preparazioni. Questo passaggio è necessario perché preformato aggregati indurre una rapida aggregazione di proteine amiloidogenica, che si traducono in scarsa riproducibilità tra esperimenti 5. Altri metodi, quali il filtraggio e la SEC può anche essere utilizzato per ottenere ....
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Discussione
PICUP è stato sviluppato originariamente per studiare complessi proteici stabili 2. Il metodo è stato applicato in seguito allo studio quantitativo delle assemblee metastabili proteina amiloide, tra cui Aβ 10, prioni e le malattie associate PrP Sc 11 e α-sinucleina 12. I fattori più importanti che devono essere considerati quando si progetta un esperimento PICUP sono la stechiometria dei reagenti, tempo di irradiazione, e la preparazione procedura di esempio. I primi due problemi può richiedere l&.......
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni AG027818 e AG030709 dal NIH / NIA, 2005/2E dalla L. Larry Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 dall'Associazione Alzheimer, e 07-65798 dalla California Department of Public Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Lampada a incandescenza Dolan-Jenner da 200 W | Altro | Dolan-Jenner Industries | Modello 170-D | Il calore generato dalla lampada d–non influisce sui campioni per brevi periodi di incubazione. |
| corpo macchina fotografica SLR da 35 mm | Strumento | Pentax | modello SP500 | Nelle nostre condizioni sperimentali, un mantice è collegato al corpo della fotocamera per fornire una camera agevole in cui irradiare il campione posizionato a 10 cm dalla sorgente luminosa. |
| Tubi PCR trasparenti a pareti sottili | Altro | Eppendorf | 951010006 fornito da Fisher L22-003-24 | |
| Vial di vetro (1,8 mL) | Altro | Kimble Chase | 60940A 2, fornito da Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagente | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagente | TCI America | H0424 | Utilizzare in una cappa chimica. |
| Aβ40 e Aβ42 | Reagente | Laboratorio Biopolimeri UCLA | ||
| Calcitonina | Reagente | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipiridil)diclororutenio(II) esaidrato | Reagente | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortexare fino a quando la soluzione non diventa limpida. Coprire il tubo di RuBpy con della stagnola per proteggere il reagente dalla luce ambiente. Il RuBpy viene preparato fresco ogni volta e deve essere utilizzato entro 48 h. |
| Peroxidisolfato di ammonio | Reagente | Sigma-Aldrich | A-7460 | Agitare fino a quando la soluzione diventa limpida. Il APS viene preparato fresco ogni volta e deve essere utilizzato entro 48 h. |
| β-mercapto–etanolo | Reagente | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Può essere utilizzato quando viene eseguita l'analisi mediante SDS-PAGE. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagente | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-cellula | Strumento | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gel (10-20%) | Altro | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Kit per la colorazione Silver Express | Invitrogen | LC6100 |
Riferimenti
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T.
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Ristampe e permessi
