Tradizionalmente la fetta verticale e l'intero montaggio preparazione della retina sono stati utilizzati per studiare la funzione dei circuiti della retina. Qui, descriviamo il romanzo taglio metodo di preservare la morfologia dendritica dei neuroni della retina intatta.
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Articolo metodologico
Slice preparazione orizzontale della Retina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tradizionalmente la fetta verticale e l'intero montaggio preparazione della retina sono stati utilizzati per studiare la funzione dei circuiti della retina. Tuttavia, molti dei neuroni della retina, come le cellule amacrine, espandere le loro dendriti in orizzontale, in modo che la morfologia delle cellule dovrebbe essere gravemente danneggiato le fette verticali. In tutta la preparazione di montaggio, soprattutto per patch-clamp registrazioni, i neuroni della retina nello strato intermedio non sono facilmente accessibili grazie alla vasta copertura di cellule gliali (cellule Mueller) endfeets s. Qui, descriviamo il romanzo taglio metodo di preservare la morfologia dendritica dei neuroni della retina intatta. La fetta è stata fatta orizzontalmente lo strato interno della retina con una affettatrice vibratome dopo che la retina è stato incorporato nella bassa temperatura di fusione gel. In questa preparazione fetta orizzontale della retina, abbiamo studiato la funzione dei neuroni della retina rispetto ai loro morfologia, utilizzando patch-clamp registrazione, la tecnica di imaging del calcio, immunocitochimica, e la cella singola RT-PCR.
Protocollo
- Preparare un blocco di agar (30 mg / ml, cioè il 3%, in acqua distillata). Sciogliere e forno a microonde è primo e versatela in un piatto di vetro. Tenere il piatto in frigorifero a 4 ° C.
Suggerimento: Il blocco di agar deve essere preparato in anticipo.
- Preparare a bassa temperatura di fusione gel (25 mg / ml, cioè 2,5%, in media). Sciogliere e forno a microonde esso. Tenerlo in bagno d'acqua calda a 35 ° C.
Suggerimento: Tenere il gel non troppo caldo. Se è troppo caldo, ci vuole molto tempo per essere solidificato, e il gel può uccidere la retina
. - L'eutanasia, enucleare animale un bulbo oculare e aprirlo come un oculare. Per liquefare vitreo, l'oculare è aperto messi a bagno per 10 minuti in ialuronidasi nel medio (0,07 mg / ml), se necessariamente.
- Tagliare l'agar in un blocco (ad esempio, 1 cm x 1,5 cm per la retina del mouse) e saldamente su un palcoscenico vibratome di colla istantanea. Mantenere il blocco di agar bagnato.
- Posizionare la lama a 5 di laurea presso l'affettatrice. Delicatamente tagliare la superficie superiore del blocco di agar alla velocità di ca. 50 micron / sec, freq. 50 Hz.
Suggerimento: Assicurarsi che la superficie superiore del blocco di agar è completamente liscio e piatto. Tagli diversi (almeno 3 volte) può essere necessario per ottenere la superficie liscia e piatta del blocco di agar.
- Sciacquare l'oculare con il mezzo senza ialuronidasi. Isolare la retina da un epitelio pigmentato e fotorecettori posizionarlo rivolto verso il basso su un pezzo di carta da filtro. Per fissare saldamente la retina per la carta da filtro, a vuoto la retina sulla carta da filtro più volte.
Suggerimento: Assicurarsi che la retina è collegata la carta da filtro completamente piatto. Dopo aver messo una retina sulla carta da filtro, tagliare la carta in eccesso filtro che circonda la retina (Fig.2a). La carta in eccesso filtro impedisce spesso una lama di andare nello strato appropriato della retina.
- Pulire delicatamente i media in eccesso sul blocco agar e attentamente luogo la retina sulla carta da filtro sul blocco agar. Per saldamente posto la carta da filtro sul blocco agar, allegare colla istantanea sul bordo della carta da filtro.
Suggerimento: per evitare di rompere unexpectable, luogo della retina come front possibile sulla superficie superiore del blocco di agar.
- Delicatamente versare la bassa temperatura di fusione gel sulla retina. Attendere 1 minuto e versate delicatamente il supporto su di esso per raffreddarlo. Il gel si solidifica rapidamente.
Suggerimento: Troppo caldo gel uccide la retina.
- Sollevare la posizione della lama a diverse centinaia di micron sopra la superficie superiore del blocco di agar e delicatamente tagliare la parte superiore del gel solidificato.
- Più in basso la posizione della lama. Tagliare la retina a livello di un terzo prossimale dello strato nucleare interno (circa tra 200 e 250 micron sopra la superficie superiore del blocco agar).
Suggerimento: la velocità eccessiva della lama danneggia gravemente la retina. Ca. 50 micron / sec (50 Hz) è appropriato.
- Si noti che le cellule amacrine sono ora a faccia in giù. Con attenzione raccogliere la fetta della retina insieme al gel solidificato e posizionarlo rivolto verso l'alto in una camera o un piatto.
Suggerimento: Poiché la retina del mouse è piccolo e ondulato, è difficile ottenere una fetta perfetta orizzontale in un layer appropriato. Una fetta "obliquo" può essere un metodo alternativo per ottenere la fetta relativa piatto della retina. Per ottenere la fetta obliquo, mettere un'altra carta da filtro tra la retina sulla carta da filtro e il blocco di agar come mostrato in Fig.2b. Anche se non si può pretendere una fetta perfetta orizzontale, ci sono sempre alcune aree in cui soma delle cellule amacrine è sulla superficie della fetta.
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Discussione
Ci sono diversi vantaggi importanti della preparazione fetta orizzontale della retina.
In primo luogo, la morfologia delle cellule dendriti che si espandono in orizzontale, come le cellule amacrine e le cellule orizzontali, viene mantenuto. E 'stato dimostrato che ci sono oltre 20 tipi di cellule amacrine della retina (MacNeil e Masland, 1998), in modo che sia molto importante confrontare la morfologia delle cellule con la proprietà fisiologiche.
In secondo luogo, in tutto il montaggio della retina, la copertura completa...
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Dichiarazioni
Tutti i protocolli sperimentali sono state condotte secondo il National Institutes of linee guida per l'uso sanità animale.
Ringraziamenti
Ringraziamo Drs. Richard H. Masland e Akimichi Kaneko per averci dato consigli e suggerimenti validi per stabilire la procedura di preparazione fetta orizzontale della retina.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarosio L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Agarosio a fusione a bassa temperatura |
| Ialuronidasi | Sigma-Aldrich | Tipo I-S, 300 U/mg | |
| Mezzo | in mM: 102 NaCl, 3,1 KCl, 2,0 CaCl2, 1,0 MgCl2, 23 NaHCO3 e 10 glucosio, mantenuto a pH 7,8, oppure Soluzione di Ames’ (Sigma) | ||
| Microonde | |||
| Bagno d'acqua calda | 35 °C | ||
| Tagliatore a vibratomo | Leica Microsystems | VT1000S | |
| Filtri a membrana MF | EMD Millipore | HAWP01300 | Carta filtrante, dimensione dei pori 0,45 µm |
| Strumenti da dissezione | pinzette, lama, pinza, pinzetta, ecc. | ||
| Colla istantanea | ad es. Alonalpha, Krazy Glue | ||
| Siringa da 50 mL | |||
| Filtro per siringa | EMD Millipore | SX0001300 |
Riferimenti
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
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Ristampe e permessi
