Tradizionalmente la fetta verticale e l'intero montaggio preparazione della retina sono stati utilizzati per studiare la funzione dei circuiti della retina. Qui, descriviamo il romanzo taglio metodo di preservare la morfologia dendritica dei neuroni della retina intatta.
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Articolo metodologico
Slice preparazione orizzontale della Retina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tradizionalmente la fetta verticale e l'intero montaggio preparazione della retina sono stati utilizzati per studiare la funzione dei circuiti della retina. Tuttavia, molti dei neuroni della retina, come le cellule amacrine, espandere le loro dendriti in orizzontale, in modo che la morfologia delle cellule dovrebbe essere gravemente danneggiato le fette verticali. In tutta la preparazione di montaggio, soprattutto per patch-clamp registrazioni, i neuroni della retina nello strato intermedio non sono facilmente accessibili grazie alla vasta copertura di cellule gliali (cellule Mueller) endfeets s. Qui, descriviamo il romanzo taglio metodo di preservare la morfologia dendritica dei neuroni della retina intatta. La fetta è stata fatta orizzontalmente lo strato interno della retina con una affettatrice vibratome dopo che la retina è stato incorporato nella bassa temperatura di fusione gel. In questa preparazione fetta orizzontale della retina, abbiamo studiato la funzione dei neuroni della retina rispetto ai loro morfologia, utilizzando patch-clamp registrazione, la tecnica di imaging del calcio, immunocitochimica, e la cella singola RT-PCR.
Protocollo
- Preparare un blocco di agar (30 mg / ml, cioè il 3%, in acqua distillata). Sciogliere e forno a microonde è primo e versatela in un piatto di vetro. Tenere il piatto in frigorifero a 4 ° C.
Suggerimento: Il blocco di agar deve essere preparato in anticipo.
- Preparare a bassa temperatura di fusione gel (25 mg / ml, cioè 2,5%, in media). Sciogliere e forno a microonde esso. Tenerlo in bagno d'acqua calda a 35 ° C.
Suggerimento: Tenere il gel non troppo caldo. Se è troppo caldo, ci vuole molto tempo per essere solidificato, e il gel può uccidere la retina
. - L'eutanasia, enucleare ....
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Discussione
Ci sono diversi vantaggi importanti della preparazione fetta orizzontale della retina.
In primo luogo, la morfologia delle cellule dendriti che si espandono in orizzontale, come le cellule amacrine e le cellule orizzontali, viene mantenuto. E 'stato dimostrato che ci sono oltre 20 tipi di cellule amacrine della retina (MacNeil e Masland, 1998), in modo che sia molto importante confrontare la morfologia delle cellule con la proprietà fisiologiche.
In secondo luogo, in tutto il montaggio della retina, la copertura completa.......
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Dichiarazioni
Tutti i protocolli sperimentali sono state condotte secondo il National Institutes of linee guida per l'uso sanità animale.
Ringraziamenti
Ringraziamo Drs. Richard H. Masland e Akimichi Kaneko per averci dato consigli e suggerimenti validi per stabilire la procedura di preparazione fetta orizzontale della retina.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarosio L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Agarosio a fusione a bassa temperatura |
| Ialuronidasi | Sigma-Aldrich | Tipo I-S, 300 U/mg | |
| Mezzo | in mM: 102 NaCl, 3,1 KCl, 2,0 CaCl2, 1,0 MgCl2, 23 NaHCO3 e 10 glucosio, mantenuto a pH 7,8, oppure Soluzione di Ames’ (Sigma) | ||
| Microonde | |||
| Bagno d'acqua calda | 35 °C | ||
| Tagliatore a vibratomo | Leica Microsystems | VT1000S | |
| Filtri a membrana MF | EMD Millipore | HAWP01300 | Carta filtrante, dimensione dei pori 0,45 µm |
| Strumenti da dissezione | pinzette, lama, pinza, pinzetta, ecc. | ||
| Colla istantanea | ad es. Alonalpha, Krazy Glue | ||
| Siringa da 50 mL | |||
| Filtro per siringa | EMD Millipore | SX0001300 |
Riferimenti
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H.
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Ristampe e permessi
