Vi presentiamo un metodo per la generazione di cDNA da mRNA ambientale. In generale, l'RNA totale viene prima raccolto dall'ambiente, è selettivamente rimosso rRNA, mRNA è selettivamente amplificato, e cDNA sintetizzato dalla piscina mRNA arricchito è sequenziato. Sequenze recuperato può essere annotati utilizzando le normali tecniche di bioinformatica per identificare i geni espressi.
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Articolo metodologico
Analisi di espressione genica da comunità microbiche marine utilizzando Trascrittomica Ambientale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Analogamente al metagenomica, trascrittomica ambientale (metatranscriptomics) recupera e sequenze mRNA ambientali da un assemblaggio microbica senza una preventiva conoscenza di ciò che i geni della comunità potrebbe essere espresso. Così fornisce la prospettiva più imparziale sul espressione comunitaria gene
Protocollo
Lavorare con l'RNA
Perché RNasi sono onnipresenti e mRNA degradare rapidamente, precauzioni standard per lavorare in un ambiente privo di ribonucleasi devono essere seguite e campioni devono essere trattati o conservati, il più presto possibile dopo la raccolta.
Parte 1: l'ambiente RNA Collection (progettato per raccogliere biomassa nella frazione dimensioni 0,2-3,0 micron)
Forniture necessarie:
Masterflex tubi
Pompa peristaltica
3 micron alto il volume della capsula filtro a pieghe
0,22 micron Supor o policarbonato 142 millimetri ....
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Discussione
L'indagine di espressione genica da parte delle comunità microbiche naturali è diventato comune negli ultimi anni come un mezzo per esplorare il ruolo ecologico e le funzioni dei microrganismi. Usato in combinazione con l'individuazione, quantificazione e caratterizzazione di microrganismi marini, analisi di espressione genica può essere usata per collegare filogenesi di funzionare in comunità microbiche naturali. Molte tecniche per il targeting espressione funzionale del gene contare su sonde specifiche o impos.......
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Ringraziamenti
Il finanziamento è stato fornito dalla Gordon and Betty Moore sovvenzioni della Fondazione e la National Science Foundation concedere MCB-0702125.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Tubi PowerSoil con perline | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| Kit RNeasy Mini | kit | Qiagen | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| Kit di isolamento mRNA mRNA-ONLY per procarioti | kit | Epicentre Biotechnologies | MOP51010/MOP51024 | |
| Kit di arricchimento mRNA batterico MICROBExpress | kit | Ambion | AM1905 | |
| Kit MICROBEnrich | kit | Ambion | AM1901 | |
| Kit MessageAmp II-Bacteria per l'amplificazione dell'RNA | kit | Ambion | AM1790 | |
| Sistema universale di sintesi del cDNA RiboClone | kit | Promega Corp. | C4360 | |
| Sistema Wizard per la purificazione del DNA | kit | Promega Corp. | A7280 |
Riferimenti
- Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsk....
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Ristampe e permessi
