Drosophila larvali NMJ Dissection

Sommario

Questo protocollo dimostra come sezionare Drosophila in preparazione per immunoistochimica e / o immagini della giunzione neuromuscolare.

Protocollo

Prima di iniziare

1. Tutte le culture devono essere coltivate a 25 ° C.
2. HL3.1 tampone dissezione può essere preparata in anticipo. Prendete un aliquota 50 ml di HL3.1 e tenerlo in ghiaccio.
3. Preparare 15 ml di fresca formaldeide 3,5% nel HL3.1. Tenerlo in ghiaccio.

Dissezione larvale

1. Mettere una goccia di freddo HL3.1 sul piatto dissezione. Ciò manterrà l'animale da essiccazione e stordire l'animale che lo rende più facile lavorare con.
2. Utilizzando le pinze lunghe, selezionare un errante larva terzo instar e inserirlo nel menu di HL3.1.
3. In primo luogo, utilizzare pinze breve per cogliere un perno minutien. Posizionare il perno tra gli spiracoli posteriori. L'animale in genere tenta di strisciare via dal perno che si stira fuori e rendendo più facile per voi di inserire un pin dritto nella testa della larva nei pressi della foce ganci. Tratto l'animale in senso longitudinale. Questo vi aiuterà a massimizzare la quantità di parete del corpo esposte si può raggiungere durante il taglio. Nota: Se si sceglie di pin la prima testa, l'animale può avvolgere il corpo in tutto il pin o frusta il suo corpo avanti e indietro, rendendo difficile al pin. Di solito è possibile contrastare questa rimuovendo il HL3.1 e mettere una goccia fresca fredda stupefacente l'animale di nuovo. Lo scienziato ambidestro può solo prendere l'animale e tenerlo in posizione.
4. Forbici primavera utilizzando fare una incisione orizzontale appena anteriormente al pin posteriore sul lato dorsale della larva. Luogo una lama delle forbici in incisione e fare un taglio verticale lungo la linea mediana dorsale verso la fine rostrale della larva. Alla tribuna degli animali fanno incisioni orizzontali a sinistra ea destra del perno. Nota: il risultato finale dovrebbe apparire come un io sul lato dorsale della larva lungo l'asse rostrocaudal.
5. Rimuovere gli organi. Iniziare mettendo alcuni ulteriori cadute di HL3.1 sulla larva. In questo modo gli organi di galleggiare fuori dal corpo consentendo di rimuoverli molto più facilmente. In primo luogo, rimuovere il sistema tracheale. In secondo luogo, utilizzare la pinza per afferrare il resto degli organi e rimuoverli.
6. Durante la fase 3 che hai fatto un flap flap sinistra e destra nella parete del corpo. Pin i lembi in senso orario assicurandosi per allungare la parete del corpo sia orizzontalmente che verticalmente.

Fissazione

Fissare ogni animale presente nel 3,5% di formaldeide in HL3.1 per 25 minuti. Lavare l'animale due volte in HL3.1 per 5 minuti.

Immagazzinamento

Rimuovere i perni e trasferire le larve in una provetta contenente 1,5 ml di PBS 1X. Se si prevede di utilizzare l'immagine del NMJ fuso tag fluorescenti, si dovrebbe immagine degli animali entro due giorni. È possibile memorizzare le larve sezionato per un massimo di una settimana a 4 ° C.

Rappresentante risultati

Ci sono parecchi componenti chiave di una larva adeguatamente sezionato Drosophila. In primo luogo, si deve fare molta attenzione a non danneggiare i muscoli, soprattutto i muscoli 4, 6, e 7. Questi sono i muscoli più popolari di studiare e se sono danneggiati scartare la preparazione filetto e sezionare un altro animale. In secondo luogo, si deve assicurarsi che l'animale è allungato al massimo in modo che ogni muscolo e NMJ possono essere distinti.

Discussione

La tecnica di dissezione dimostrato in questo video può essere utilizzato per preparare le larve di Drosophila per una varietà di tecniche sperimentali. Se i tag proteina fluorescente sono presenti, le larve possono essere montati e ripreso immediatamente. Altrimenti, immunostaining può essere effettuata in modo da segnare specifici comparti sinaptica. Inoltre, elettrofisiologia può essere facilmente effettuata sulla larve sezionato per valutare il funzionamento della neurotrasmissione.

Materiali

HL3 Buffer Dissection: (in mm) 70 NaCl, 5 KCl, 0,2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trealosio, 115 saccarosio, e 5 HEPES, pH 7.3.
Sylgard Piastra dissezione: Mescolare delicatamente (per evitare le bolle) 10:1 in un bicchiere. Versare il composto nella piastra di Petri (qualsiasi dimensione). Lasciare SylGard per curare una notte in incubatrice 37C.