Mutagenesi sito-specifica di plasmidi tutto è un modo semplice per creare varianti leggermente diverse di un plasmide originale. Qui mostriamo un modo semplice ed economico per introdurre sostituzioni di basi in un plasmide standard utilizzando reagenti.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Mutagenesi sito fatto in casa Regia di Plasmidi Whole
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mutagenesi sito-specifica di plasmidi tutto è un modo semplice per creare varianti leggermente diverse di un plasmide originale. Con questo metodo il gene bersaglio clonato può essere modificato attraverso la sostituzione, cancellazione o l'inserimento di alcune basi direttamente in un plasmide. Funziona semplicemente amplificando il plasmide intero, in modo non basati sulla PCR reazione termici. Durante la reazione di primer mutagenico, portando la mutazione desiderata, sono integrati nel plasmide di nuova sintesi. In questo video tutorial che mostrano un modo semplice ed economico per introdurre sostituzioni di basi in un plasmide. Il protocollo lavora con reagenti standard ed è indipendente dal kit commerciali, che spesso sono molto costosi. L'applicazione di questo protocollo in grado di ridurre il costo totale di una reazione ad un ottavo di ciò che costa utilizzando alcuni dei kit commerciali. In questo video abbiamo anche commentare le fasi critiche durante il processo e dare istruzioni dettagliate su come progettare il primer mutagenico.
Protocollo
Principio del Metodo:
Il sito mutagenesi di plasmidi tutto spiegato in questo video è un metodo di mutagenesi che consente di modificare un gene bersaglio clonato attraverso la sostituzione, cancellazione o l'inserimento di alcune basi direttamente in un plasmide. Funziona, amplificando il plasmide intero, in modo non basati sulla PCR reazione termici. Durante la reazione di primer mutagenico, portando la mutazione desiderata in forma di mismatch al plasmide originale, sono integrati nel plasmide di nuova sintesi. Dopo la rimozione del plasmide originale dalla reazione del plasmide mutato si trasforma in E. coli. seguenti passa....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Mutagenesi sito-è un metodo di mutagenesi, che fornisce un modo veloce per mutare un gene portato da un plasmide. La reazione tutto può essere fatto in un solo giorno. Con questo metodo, sarà necessario solo un paio di primer omaggio portando le mutazioni desiderato e una polimerasi correzione di bozze, come Pfu-polimerasi. Il plasmide di nuova sintesi può essere separato dal plasmide genitoriale digerire la reazione con il DpnI enzima di restrizione. Questo enzima digerisce solo il DNA metilato. Quindi solo il plasmide.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Polimerasi Pfu (ricombinante o nativa) | Fermentas | EP0571 or EP0501 | |
| Mix di dNTP 10 mM | Fermentas | R0191 | |
| DpnI o DpnI Fast digest | Fermentas | ER1701 | |
| Primers | Invitrogen | desalinizzati |
Riferimenti
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies. 9, 3-4 (1996).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
