Questo articolo descrive una tecnica ad alta risoluzione temporale e spaziale a otticamente movimento immagine del potenziale d'azione sulla superficie del Langendorff-cuore perfuso di ratto utilizzando un colorante potenziometrica (di-8-ANEPPS).
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Articolo metodologico
Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mappatura ottica della superficie cardiaca con coloranti fluorescenti voltaggio-sensibile è diventato un importante strumento per indagare l'eccitazione elettrica in modelli sperimentali che vanno in scala da colture di cellule di interi organi
Protocollo
Parte 1: Preparare le soluzioni e il sistema isolato cuore perfuso
- La mattina del dell'esperimento, 4,0 L di Krebs-Henseleit soluzione viene preparata come descritto in precedenza [5, 6].
- 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (BDM) è sciolto in 1,0 L di Krebs-Henseleit soluzione decantata dal perfusato preparato al punto 1.1.
- Altri 150 ml di Krebs-Henseleit viene rimosso dal perfusato preparato al passo 1.1 e mescolato con 5 mol / l di-8-ANEPPS (diluito da un mMol / L 10 magazzino sciolto in dimetilsolfossido (DMSO)).
- Queste tre soluzioni sono trasferiti ad acqua con camicia in vetro serbatoi (Radnóti) dove sono pre-riscaldato a 41,0 ° C e ossigenata con un gorgogliatore sommerso (Radnóti) con 0,2 micron filtrata 95% O 2, 5% CO 2. Le soluzioni da 3 serbatoi magazzino vengono pompati al muro con sistema Langendorff Masterflex ™ L / S pompe peristaltiche ea basso assorbimento tubo al silicone (Cole-Parmer).
- Prima del montaggio, il sistema Langendorff vetro (Radnóti) è meticolosamente lavata con E-Toxa-CLEAN reagente (Sigma-Aldrich) e risciacquata a fondo con 0,1 M / L HCl, 100% di etanolo e acqua distillata.
- Il mancato ricircolo Langendorff apparato è stato costruito per fornire 70 mm Hg a pressione costante da 3 serbatoi separati ossigenati, che sono separati dal cuore con l'acqua con camicia serpentine di riscaldamento e trappole bolla (Radnóti) [7]. Le 3 linee di perfusione indipendente convergono sopra il cuore a due rubinetti a 3 vie, che ci permette di controllare con precisione la consegna delle soluzioni preparate in passi 1,1-1,3. Acqua con camicia vetro è collegato in serie con tubi BPT Masterflex PharMed (Cole-Parmer) e riscaldato a 39 ° C con acqua distillata usando due circolatori E100 (Lauda). Perdita di calore attraverso il platino tubo al silicone vulcanizzato (Cole-Parmer) che collega la pressione di testa serbatoi per le bobine di riscaldamento e trappole bolla portato ad una temperatura di 37 ° C perfusato raggiungere il cuore.
Parte 2: Raccolta del cuore di ratto e set-up perfusione Langendorff
- Per indurre profonda anestesia generale in 200-250 g ratti Lewis, 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina viene iniettato nella cavità intraperitoneale. A questa miscela, si aggiungono 500 U / kg di eparina per prevenire la coagulazione del sangue e l'ischemia miocardica durante la procedura di espianto.
- Per un facile accesso al cuore e dei grossi vasi, la parete toracica anteriore è stato rimosso. Dopo di che, il tessuto circostante è attentamente sezionato e aperto il sacco pericardico.
- A seguito di identificazione della vena cava inferiore, il vaso è legatura con 5-0 seta (Ethicon) e l'intero blocco cuore-polmone è espiantati. Tessuti è immediatamente posto in ghiacciata Krebs-Henseleit soluzione contenuta in un bicchiere da 50 ml su ghiaccio.
- L'aorta ascendente è rapidamente individuato e sezionato dal tessuto circostante. Una di dimensioni idonee cannula (Harvard Apparatus) è inserita nell'aorta, avendo cura di evitare di interrompere la perfusione obbligatorio delle arterie coronarie mediante l'inserimento della cannula troppo nella radice aortica. La cannula viene fissato l'aorta ascendente con 5-0 seta (Ethicon).
- Il cuore di ratto è poi situato su di esso Langendorff senza introdurre bolle d'aria nella cannula. Retrograda perfusione vascolare coronarica è ormai consolidata con il caldo, ossigenata di Krebs-Henseleit soluzione dalla pressione a testa descritto al punto 1.6.
- Tessuto extra, tra cui i polmoni, è ora rimosso e il cuore è perfuso per 20 minuti per permettere il recupero della funzione e stabilizzare il ritmo. Durante questo periodo, una sonda molto sottile di temperatura termocoppia (Cole-Parmer) è introdotto nella cavità ventricolare sinistra e suturato in posizione con 5-0 Prolene sutura (Ethicon). La sonda è collegata ad un termo-regolatore (di Digi-Sense) per garantire la temperatura del cuore è mantenuta a 37 ° C regolando le impostazioni di pompe di circolazione dell'acqua. Moto da perfusato stillicidio dalla apice cardiaco è ridotto al minimo mettendo un pezzo di garza nel recipiente effluenti.
Parte 3: il cuore di carico con colorante potenziometrica e acquisire segnali elettrografiche e ottici
- Di-8-ANEPPS (Invitrogen) viene caricato nel cuore passando alla linea di perfusione contenente il Krebs-Henseleit miscelato con il colorante fluorescente con un rubinetto. Inoltre, una cannula 18G è collocato nell'atrio sinistro e / o diritto e ulteriori 50 ml di soluzione colorante sta lentamente somministrato in ognuna di queste camere perché non sono sufficientemente perfusi con colorante introdotto attraverso le arterie coronariche.
- Durante la procedura di caricamento, 3 derivazioni ECG (Harvard Apparatus) sono gentilmente messo sulla superficie del cuore che non sta affrontando l'ottica utilizzata per la mappatura. Elettrodo N o 1 è posizionato sulla parte posteriore apicale del ventricolo sinistro, N ° 2 sul atrio sinistro, e N p> o 3 come un elettrodo di riferimento sulla radice aortica (Figura 1). I segnali atriali e ventricolari elettrografiche sono poi amplificati, digitalizzati, e visualizzata accanto segnali ottici utilizzando il software (redshirt Imaging) (Figura 2). Un oscilloscopio (Tektronix TDS modello 1002) è utilizzato anche per visualizzare la superficie ECG s in tempo reale e per garantire la stimolazione adeguata.
- ECG amplificatore (Hugo Sachs Elektronik) impostazioni: filtro passa-alto: 0,1 Hz
Filtro passa basso: 150 Hz - La fotocamera CMOS (redshirt Imaging) e macroscopio stata posizionata mediante gli aggiustamenti XYZ modo che la superficie del cuore è a fuoco e centrata nella cornice di acquisizione. La fotocamera e le ottiche sono montate su un tavolo isolamento dalle vibrazioni (Minus K Technology) per ridurre al minimo le frequenze di risonanza. Allo stesso tempo, un elettrodo di stimolazione coassiale (Harvard Apparatus), controllato con un isolato, S48 elettrico-stimolazione unità (Grass), è posto sulla atrio destro e il cuore viene stimolato a 300 battiti al minuto (Figura 1).
- Stimolazione elettrica (Erba) impostazioni:
Vota: 5 impulsi al secondo
Ritardo: 0,2 ms
Durata: 2 ms
Volt: 6-12 V
Modalità: Ripetizione
Pulse: Singolo - Per le registrazioni ottiche che mancano di artefatti da movimento di contrazione, il cuore ha bisogno di essere elettromeccanicamente disaccoppiato. Facciamo questo nuovo passaggio linee di perfusione a Krebs-Henseleit soluzione che contiene 11 mmol / L BDM. Tra acquisizioni, il cuore è perfuso con puro Krebs-Henseleit per aiutare a preservare la vitalità del preparato.
- I parametri di registrazione sono impostati utilizzando il software (Imaging redshirt) con le impostazioni di acquisizione seguenti:
Configurazione: 2.000 Hz; 128x128 gamma di pixel
Intervallo di telaio: 0,5 ms
Fotocamera Guadagno Amplificatore: 5x
On-Chip Guadagno: 8x-12Me-bene
Shutter: 500 ms di ritardo
Numero di fotogrammi: 4000
Durata: 2000 ms - Tutte le luci della stanza e le attrezzature sono disattivati o schermati per eliminare rumori di fondo durante la registrazione. La luce a LED illumina il cuore solo durante la registrazione ottica per ridurre fotometabolismo e tossicità colorante. L'otturatore sorgente luminosa è controllata con un impulso di 5 V fornita attraverso il pannello di controllo per mezzo di un D-to-A bordo del computer (Imaging redshirt).
Parte 4: Analisi delle informazioni di acquisizione utilizzando Imaging Software redshirt
- A seguito dell'acquisizione, i dati vengono elaborati utilizzando diverse impostazioni del filtro. Noi di solito utilizzare le impostazioni predefinite, tranne quando si regola la Banda Stop / filtro passa, che è impostato con il confine a sinistra al 44,0 e il bordo destro a 98,0. In seguito le informazioni registrate vengono elaborate e un film è generato (Imaging redshirt).
- I dati di uno di acquisizione corrisponde alla attivazione elettriche locali a 16.384 siti sulla superficie del cuore per un periodo di 2 secondi. Il software permette a questi segnali locali per essere direttamente confrontati tra loro e con le registrazioni atriali e ventricolari elettrografiche. I dati vengono quindi visualizzati con la mappatura locali attivazione elettrica per colorare e rendere queste informazioni come un'animazione che mostra l'attivazione spazio-temporale elettrico sulla superficie cardiaca. Per creare un'animazione tale, si usa il software:
- temporalmente e / o spazialmente filtrare i dati
- selezionare un orario di inizio e di fine per l'animazione
- segnali ottici mappa di colori in base a riposo l'intensità luminosa di ogni pixel
- sovrapporre i dati di colore risultante con una foto del cuore
- generare l'animazione
Parte 5: risultati Rappresentante
Se la preparazione cuore perfuso era immobile durante la registrazione, i segnali ottici mostrano un picco distinto per ogni pixel coinvolti in un cambiamento della intensità di emissione di di-8-ANEPPS. I film corrispondente (figure 3 e 4) dimostrare un fronte d'onda di eccitazione di propagazione attraverso la superficie epicardica del cuore così come le registrazioni acquisite simultaneamente elettrografiche (Figura 2).
Figura 1. Una fotografia di un Langendorff-perfuso preparazione cuore raffiguranti le posizioni degli elettrodi sulla stimolazione atrio destro e il derivazioni come descritto al punto 3.2.
Figura 2. Rappresentante segnali ottici e registrazioni elettrografiche da un cuore perfuso di ratto Lewis. Un pannello mostra un'immagine della superficie epicardico utilizzato per l'imaging ottico. La posizione dei pixel selezionati per dimostrare i cambiamenti nella emissione di fluorescenza nel tempo, nel Pannello di B sono indicati da frecce colorate. Segnali elettrografici sono mostrati in Pannello di C con la linea rossa che indica l'attivazione atriale e la linea di luce blu che corrisponde al segnale ventricolare. Per favoreve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussione
L'asportazione del cuore di ratti anestetizzati deve essere eseguita rapidamente per evitare di ischemia miocardica. Se la perfusione ischemia coronarica o insufficiente si verifica, il cuore probabilmente sviluppare aritmie e può diventare infartuata. Inoltre, questi cuori si dimostrano insufficienti emissione di fluorescenza per le registrazioni informative e le analisi successive. Prima di caricare il colorante, le cellule del miocardio devono essere adeguatamente perfusi con soluzione Krebs-Henseleit di stabilir...
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Dichiarazioni
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso in bambini Hospital di Boston.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto da borse di ricerca dal National Institutes of Health (HL068915; HL088206) e contributi al Fondo di conduzione cardiaca presso il Children Hospital di Boston.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| CardioCMOS-SM128f | Attrezzatura | RedShirtImaging, LLC | ||
| Software CardioPlex | Attrezzatura | RedShirtImaging, LLC | ||
| Sorgente luminosa LED LUXEON 460-490 nm | Attrezzatura | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| Amplificatore ECG Tipo 689 Hugo Sachs Elektronik | Attrezzatura | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Specchio Dicroico 505 nm | Attrezzatura | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Filtro di Emissione Passa-Alto a 605 nm | Attrezzatura | SciMedia | ||
| THT Sideways | Attrezzatura | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Porta Giunto Sferico Mini | Attrezzatura | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Set di Elettrodi di Stimolazione Piccoli | Attrezzatura | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| Piattaforma BM-6 per Isolamento dalle Vibrazioni da Banco | Attrezzatura | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Elettrodo Monopolare per ECG | Attrezzatura | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Pompa a Rulli SCI 400 | Attrezzatura | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Pompa a Rulli MasterFlex Easy Load II | Attrezzatura | Cole-Parmer | Modello 77201-60 | |
| Tubazione Marprene #14 | Attrezzatura | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| Tubazione MasterFlex | Attrezzatura | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| Stimolatore ad Impulsi Quadrati S48 | Attrezzatura | Grass Technologies | Modello S48 | |
| Unità di Isolamento con Trasformatore RF SIU5 | Attrezzatura | Grass Technologies | Modello SIU5 | |
| Reservoir da 5 Litri con Giacca d'Acqua | Attrezzatura | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| Reservoir da 2 Litri con Giacca d'Acqua | Attrezzatura | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| Reservoir da 0,5 Litri con Giacca d'Acqua | Attrezzatura | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| Reservoir da 0,25 Litri con Giacca d'Acqua | Attrezzatura | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| Bobina Riscaldante da 10 ml | Attrezzatura | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Trappola per Bolle di Compatibilità | Attrezzatura | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Cannula con Sconnessione Luer | Attrezzatura | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| Rubinetto a Tre Vie, FLL a MLT, Senza Coperchi per Porta | Attrezzatura | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Termometro a Termocoppia | Attrezzatura | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Microsonda Flessibile Ultrafine Serie IT | Attrezzatura | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscopio Tektronix TDS 1002 | Attrezzatura | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| Monossima di 2,3-butanedione | Reagente | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Cloridrato di Ketamina | Reagente | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xilazina | Reagente | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagente | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagente | Invitrogen | D-3167 |
Riferimenti
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
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Ristampe e permessi
