L'imaging cellulare Live è di particolare utilità quando si studiano le dinamiche del traffico di organelli. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di denso-core vescicole in neuroni coltivati con grande campo microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è flessibile e può essere adattato a organelli altra immagine come i mitocondri, endosomi e perossisomi.
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Articolo metodologico
Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ippocampale
In questo articolo
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Sommario
Abstract
L'osservazione e la caratterizzazione dinamica dei processi cellulari può fornire informazioni importanti sulle attività cellulare che non possono essere acquisite immagini statiche. Vital sonde fluorescenti, in particolare proteina fluorescente verde (GFP) hanno rivoluzionato la biologia delle cellule che derivano dalla capacità di etichetta specifici comparti intracellulari e strutture cellulari. Per esempio, l'immagine dal vivo di GFP (e le sue varianti spettrale) chimere hanno permesso un'analisi dinamica del citoscheletro, il trasporto degli organelli, e le dinamiche della membrana in una moltitudine di organismi e di tipi di cellule [1-3]. Sebbene l'imaging dal vivo è diventata prevalente, questo approccio pone ancora molti problemi tecnici, in particolare nella scuola primaria neuroni coltivati. Una sfida è l'espressione di proteine GFP-tagged in post-mitotico neuroni, l'altro è la capacità di catturare immagini a fluorescenza, riducendo al minimo fototossicità, photobleaching, e mantenere la salute generale delle cellule. Qui forniamo un protocollo che descrive un metodo a base di lipidi transfezione che produce un tasso di trasfezione relativamente basso (~ 0,5%), è tuttavia ideale per l'imaging di neuroni completamente polarizzata. Un tasso di trasfezione basso è essenziale in modo che gli assoni e dendriti singolo può essere caratterizzato da loro orientamento verso il corpo cellulare per confermare la direzionalità di trasporto, cioè, anterograda v. retrograda. Il nostro approccio all'imaging GFP che esprimono i neuroni si basa su uno standard a grande campo microscopio a fluorescenza equipaggiato con una telecamera CCD, software per la cattura delle immagini, e una camera di imaging riscaldata. Abbiamo immaginato una grande varietà di organelli o strutture, ad esempio, densi-core vescicole, mitocondri, coni di crescita, e actina senza ottica o esigenze particolari di eccitazione che non sia un fonte di luce fluorescente. Inoltre, spettralmente-distinte, proteine fluorescente, ad esempio, GFP-tagged DsRed e proteine, possono essere visualizzati simultaneamente vicino a caratterizzare co-trasporto o altri eventi coordinati cellulare. L'approccio di imaging qui descritto è flessibile per una varietà di applicazioni di imaging e può essere adottata da un laboratorio per il costo relativamente poco fornito un microscopio è disponibile.
Protocollo
Parte 1: Transfection dei neuroni utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen)
Attrezzature di set-up:
Neuroni dell'ippocampo di ratto o il mouse sono coltivate secondo Kaech e banchiere, 2006 [4]. La densità tipica cellula usata per trasfezioni è di 250.000 piatto cells/6-cm. Reagenti necessari e le attrezzature includono 50 acido kynurenic mM, regolare titolare tubo da banco, un dispositivo di raffreddamento da banco (meglio per mantenere freddo Lipofectamine reagenti),
Reagente Lipofectamine, MEM, tubi microcentrifuga, micropipetters e pinza sterile.
Procedimento:
- ....
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Discussione
L'imaging cellulare dal vivo è una tecnica difficile, ma potente per l'osservazione diretta del trasporto degli organelli nei neuroni in coltura. Le difficoltà possono sorgere a monte della procedura con la salute dei neuroni poveri a causa di complicazioni cultura. Di conseguenza, la salute delle cellule (per esempi vedi rif. 4) deve essere valutata prima e dopo la trasfezione osservando i coprioggetti mentre nel mezzo di crescita mediante una cultura microscopio dei tessuti leggeri. Il processo di trasferiment.......
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Ringraziamenti
Ringraziamo Harald Hutter e Helena Decker per la loro attenta lettura di questo manoscritto. Ringraziamo anche Reg. Sidhu di Leica Microsystems per la sua competenza tecnica. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Scienze e Ingegneria del Consiglio Nazionale del Canada, Premio # 327100-06, e la Simon Fraser Facoltà Universitaria di Scienze.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle con sali di Earle e L-glutammina | Reagente | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagente | Invitrogen | 11668-027 | Reagente per trasfezione |
| Hanks 10X con Ca2+ e Mg2+ | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | Mezzo per imaging in tempo reale |
| HEPES 1 M | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 15630-130 | Mezzo per imaging in tempo reale |
Riferimenti
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective trans....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.
Posted by JoVE Editors on 1/20/2010. Citeable Link.
A correction was made to Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:
David M. Kwinter, Michael A. Silverman
instead of:
David Kwinter, Michael Silverman.
