CD4 + antigene specifico visualizzando cellule T con MHC di classe II tetrameri

Sommario

Questa procedura dimostra la purificazione e l'espansione in vitro di cellule CD4 + antigene specifico le cellule T del sangue periferico da tutto e la loro visualizzazione utilizzando tetrameri MHC di classe II. Tetrameri consentire la visualizzazione diretta delle cellule T con una singola specificità antigenica e definito MHC di classe II restrizione.

Abstract

Complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II tetrameri consentire la visualizzazione diretta dei CD4 + antigene specifico le cellule T mediante citometria di flusso. Questo metodo si basa sulla interazione altamente specifica tra peptide caricato MHC e il corrispondente delle cellule T del recettore. Mentre l'affinità di un singolo MHC / peptide molecola è bassa, il cross-linking complessi MHC / peptide con streptavidina aumenta l'avidità di interazione, consentendo il loro impiego come reagenti di colorazione. A causa delle frequenze relativamente basso di cellule CD4 + T (~ 1 in 300.000 per una specificità unica) questo saggio si avvale di una fase di amplificazione in vitro di aumentare la soglia di rilevazione. Cellule mononucleate sono purificati dal sangue periferico da sottofondo Ficoll. Cellule CD4 + sono poi separati da selezione negativa utilizzando cocktail biotinilato anticorpi e perle di anticorpi anti-biotina magnetico. Utilizzando cellule aderenti dalla frazione di cellule CD4 come cellule presentanti l'antigene, cellule T CD4 + sono espanse in media con l'aggiunta di un peptide antigenico e IL-2. Le cellule espanse sono colorati con la corrispondente classe II tetramero di incubazione a 37 ° C per un'ora e successivamente colorati con anticorpi di superficie come anti-CD4, anti-CD3 e anti-CD25. Dopo l'etichettatura, le cellule possono essere analizzati direttamente mediante citometria di flusso. Le cellule tetramero positivo tipicamente formano una popolazione distinta tra le cellule CD4 + espanse. Cellule tetramero positivi sono di solito CD25 + CD4 e spesso elevata. Perché il livello di colorazione di fondo tetramero possono variare, risultati colorazione positiva deve essere sempre rispetto alla colorazione delle stesse cellule con un tetramero irrilevante. Più varianti di questo test di base sono possibili. Cellule tetramero positivi possono essere ordinati per ulteriori analisi fenotipica, l'inclusione in ELISPOT o saggi di proliferazione, o altre prove secondarie. Diversi gruppi hanno anche dimostrato di co-colorazione con tetrameri e uno anti-citochine o anti-FoxP3 anticorpi.

Protocollo

1. Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) isolamento

1. Ottenere un campione di sangue - sangue deve essere raccolti in siringhe o provette di sangue e anti-coagulato con eparina (1:50 ratio) per prevenire la coagulazione. Aspettatevi una resa di circa 1 × 10 ⁶ PBMC per ml di sangue - circa il 40% dei quali sarà CD4 positivi (CD4 +) le cellule T.
2. Aliquota del sangue in 50 mL coniche, 25 ml per provetta. Se il sangue si è separata, mescolare delicatamente prima aliquoting per distribuire il plasma
3. Aggiungi PBS, portando il volume totale di 40 ml e alla base attraverso l'elaborazione di 11 ml di Ficoll, inserendo nel tu....

Discussione

Comprendere il ruolo delle cellule T CD4 + nel immunità è di fondamentale importanza. Tuttavia, CD4 + antigene specifico le cellule T possono essere difficili da individuare e isolare con metodi tradizionali. Al contrario, tetrameri MHC di classe II permette la visualizzazione diretta delle cellule T CD4 + con la specificità antigene desiderato. Questo video dimostra l'isolamento, la purificazione e l'amplificazione in vitro di cellule T CD4 + e la loro successiva visualizzazione con tetrameri. Classe II sono tetrameri .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Armadio di sicurezza biologica a flusso laminare di Classe 2	attrezzatura	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1200	O equivalente
Tubo conico da 50 mL	attrezzatura	VWR international	47747-182	O equivalente
PBS 1X (senza Ca/Mg)	reagente	Hyclone	SH30028.02	O equivalente
Ficoll-paque PLUS	reagente	GE Healthcare	17-1440-03	avvolto in alluminio per proteggere dalla luce
Pipet Aid XP	attrezzatura	Drummond Scientific	4-000-101	O equivalente
Pipetta da 10 mL	attrezzatura	Corning	CLS4492	O equivalente
Canister Aerosolve	attrezzatura	Beckman Coulter Inc.	359481	con inserti da 50 mL
Centrifuga	attrezzatura	Beckman Coulter Inc.	GS-6R	O equivalente
Pipette per trasferimento	attrezzatura	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	202-20S	O equivalente
Pipette Pasteur	attrezzatura	VWR international	14672-200	O equivalente
Buffer emolitico	reagente	N/D	N/D	8,3 g/L NH4Cl, 1,0 g/L NaHCO3, 0,04 g/L EDTA disodico
Blu di tripano	reagente	Sigma-Aldrich	T6146	0,2% in PBS
Emocitometro	attrezzatura	VWR international	15170-208
Tubo conico da 15 mL	attrezzatura	VWR international	05-527-90	O equivalente
Buffer di lavaggio	reagente	N/D	N/D	PBS + 2 mM EDTA + 5 g/L BSA
Kit di isolamento per cellule T CD4+ MACS II	reagente	Miltenyi Biotec	130-091-155	O equivalente
Magnete EasySep®	attrezzatura	Stem Cell Technologies	18000
Tubo in polipropilene da 5 mL	attrezzatura	Falcon BD	352063
RPMI 1640	reagente	Invitrogen	22400-089	con 25 mM HEPES
Siero umano in pool	reagente	N/D	N/D	prelevato da donatori sani, inattivato termicamente e filtrato
Pen Strep	reagente	Invitrogen	1570-063	O equivalente
Filtro per bottiglia da 500 mL con pori da 0,22 micron	attrezzatura	Nalge Nunc international	595-3320	O equivalente
Piastra a 48 pozzetti	attrezzatura	Costar	3548	O equivalente
Incubatore a 37°C con CO2	attrezzatura	Sanyo	MCO-18AIC	O equivalente
Peptide sintetico da 20 mg/mL	reagente	N/D	N/D	Sintesi personalizzata da qualsiasi fornitore di peptidi
Tubo FACS da 5 mL	attrezzatura	Falcon BD	352008	In polistirene
Tetramero di classe II caricato con peptide (come descritto)	reagente	N/D	N/D	Preparato dal centro tetrameri del BRI
Anti-CD3	reagente	BD Biosciences	347344	O equivalente
Anti-CD4	reagente	eBioscience	17-0049-73	O equivalente
Anti-CD25	reagente	eBioscience	11-0259-73	O equivalente
Citometro a flusso Facs Calibur	attrezzatura	BD Biosciences	342975	O equivalente